苯并尿嘧啶类肽核酸单体及其中间体与它们的制备方法与 应用 技术领域 本发明属于核酸材料和仿生材料领域， 涉及一种苯并尿嘧啶类肽核酸单体及其中 间体与它们的制备方法与应用。
背景技术 肽核酸 (peptide nucleic acid， PNA， 见文献 ： Nielsen， P.E. ； Egholm， M. ； Berg， R.H. ； Buchardt， O.， Sequence selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substitute polyamide， Science， 1991， 254， 1498 ～ 1 500) 是一类典型 的核酸 (DNA) 结构模拟分子， 是用 2- 氨乙基 - 甘氨酸为单元形成的类肽链替换了核酸的磷 酯链， 但保留了 DNA 的碱基结构， 碱基为 thymine(T) 的肽核酸的分子结构如式 a 所示， 式b 为苯并尿嘧啶的化学结构。因此， PNA 分子为电中性， 而且具有很好的光、 热和化学稳定性， 不仅具有 DNA 类似的分子识别与序列识别性能， 其序列识别性能比 DNA 更强， 在基因治疗、 基因检测、 基因沉默 (silence) 等方面具有重要的应用前景， 因此， 自从 1991 年由 Peter Nielsen 等人发明以来， 得到了化学界和分子生物学界专家学者的高度重视， 并得到了长足 的发展。
( 式 a)
( 式 b)( 式 c)
式 c 所示为以碱基 T(1) 为代表的肽核酸单体的合成路线， 在 1 位上接入乙酸单元 形成化合物 2， 化合物 2 与化合物 3 反应形成化合物 4 后水解得到肽核酸单体 5， 5 是可以直 接用于固相合成的单体。有文献 (L.Kospkina， W.T.WeiWang and T.C.Liang， Tetrahedron Lett.， 1994， 35， 5173-5176 和 A.R.Katritzky， T.Narindoshvili， Org.Biomol.Chem.， 2008， 6， 3171-3176) 报道， 化合物 2 可通过化合物 1 与溴乙酸在氢氧化钾 (KOH) 的水溶液 中通过一步反应得到， 产率为 50-80％。另外的合成方法包括 ： 在 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 以碳酸钾 (K2CO3) 为碱， 催化 1 和溴乙酸乙酯， 并进一步将乙酯水解可得到产物 2， 产率 为 30-70％ (K.L.Dueholm， M.Egholm， C.Behrens， L.Christensen， H.F.Hansen， T.Vulpius， K.H.Petersen， R.H.Berg， P.E.Niesen， O， Buchardt， J.Org.Chem.1994， 59， 5767-5773)。上 述试验方法适用于以天然碱基 T 作为原料进行制备肽核酸单体。但对于苯并尿嘧啶类的碱 基 ( 式 b)， 上述方法并不能获得较高产率的肽核酸单体。 发明内容
本发明的目的是提供一种苯并尿嘧啶类肽核酸单体及其中间体与它们的制备方 法与应用。
本发明提供的制备苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体， 是式 I 结构通式所述化合 物，
( 式 I)
所述式 I 结构通式中， R 为 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -H、 -CH3、 -CH2CH3 或 -CH2CH2CH3， 优选 R 为 -F、 -Cl 或 -CH3。
本发明提供的制备上述化合物的方法， 包括如下步骤 ：
1) 将式 II 所示苯并尿嘧啶衍生物于有机溶剂中与氢氧化钠进行反应， 反应完毕 得到反应溶液 A ；
( 式 II)
所述式 II 中， R 为 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -H、 -CH3、 -CH2CH3 或 -CH2CH2CH3 ；
2) 将溴乙酸溶于有机溶剂中得到反应溶液 B， 将所述反应溶液 B 与所述反应溶液 A 进行反应， 得到式 I 所示化合物。
该方法的步骤 1) 中， 所述有机溶剂选自二甲基亚砜和 N， N- 二甲基甲酰胺中 的至少一种， 优选二甲基亚砜 ； 所述式 II 所示苯并尿嘧啶衍生物、 氢氧化钠与所述有机
溶剂的用量比为 1mmol ∶ 2-10mmol ∶ 2-10ml， 具体可为 1mmol ∶ 5mmol ∶ 5.3-5.9ml、 1mmol ∶ 5mmol ∶ 5.4-5.9ml 或 1mmol ∶ 5mmol ∶ 5.3-5.4ml， 优 选 1mmol ∶ 3-6mmol ∶ 5-6ml ； 温度为 20-80℃， 具体可为 20-70℃、 20-40℃或 40-70℃， 优选 20-70℃， 时间为 10-300 分钟， 优选 100-200 分钟 ； 所述步骤 2) 中， 所述有机溶剂选自二甲 基亚砜和 N， N- 二甲基甲酰胺中的至少一种， 优选二甲基亚砜 ； 所述溴乙酸与所述有机溶 剂的用量比为 1-1.5mmol ∶ 1-10ml， 优选 1.2-1.4mmol ∶ 2-5ml ； 所述反应步骤中， 温度为 20-80℃， 优选 20-70℃， 时间为 5-15 小时， 优选 10 小时。在所述步骤 2) 反应完毕之后， 对 反应体系进行如下纯化处理 ： 将反应体系与乙酸乙酯混匀， 收集得到的沉淀， 将所述沉淀溶 于水中， 调节 pH 值至 2， 得到纯化后的式 I 所示化合物。其中， 乙酸乙酯可根据沉淀的析出 情况确定， 水的用量可根据沉淀的溶解情况确定。
所述步骤 1) 中， R 为 -CH3、 -F 或 -Cl 的式 II 所示苯并尿嘧啶衍生物的制备方法 分别为 ： R 为 -CH3 ： 将市售 2- 氨基 -5 甲基 - 苯甲酸 (4.5g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所述产物 ； R 为 -F ： 将市售 2- 氨基 -5- 氟 - 苯甲酸 (4.65g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所述产物 ； R 为 -Cl ： 将市售 2- 氨 基 -5- 氟 - 苯甲酸 (5.13g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶 中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所 述产物。
本发明提供的肽核酸单体化合物， 其结构通式如式 III 所示，
( 式 III)
所述式 III 中， R 为 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -H、 -CH3、 -CH2CH3 或 -CH2CH2CH3。
本发明提供的制备上述肽核酸单体化合物的方法， 包括如下步骤 ： 将式 I 所述化 合物和苯并三氮唑 -N， N， N′， N′ - 四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU) 溶于有机溶剂 a 中与 N， N- 二异丙基乙胺在室温下反应 10-30 分钟后， 再加入化合物 3 的有机溶液在室温下反应 60-240 分钟后得到产物 a， 将所述产物 a 于有机混合液中与氢氧化钠在室温下反应 30-120 分钟后， 调节 pH 值至 3-5， 得到所述肽核酸单体化合物 ； N- 叔丁氧基 - 羰基 -1， 2- 二氨基乙 烷的有机溶液是将 N- 叔丁氧基 - 羰基 -1， 2- 二氨基乙烷溶于有机溶剂 b 中而得。
该方法中， 所述有机溶剂 a 和有机溶剂 b 均选自 N， N- 二甲基甲酰胺和二甲基亚砜 中的至少一种， 优选 N， N- 二甲基甲酰胺 ； 所述有机溶剂 b 选自 N， N- 二甲基甲酰胺和二甲 基亚砜中的至少一种， 优选 N， N- 二甲基甲酰胺 ； 所述有机混合液是由体积比为 1 ∶ 1 的二 氯甲烷与乙醇混合而得 ；
所述式 I 所述化合物、 苯并三氮唑 -N， N， N ′， N ′ - 四甲基脲六氟磷酸盐、 有机 溶剂 a、 N， N- 二异丙基乙胺、 N- 叔丁氧基 - 羰基 -1， 2- 二氨基乙烷、 有机溶剂 b ： 氢氧化钠的用量比为 1mmol ∶ 1-1.2mmol ∶ 0.5-1ml ∶ 1-1.2mmol ∶ 1-1.2mmol ∶ 0.5-1ml ∶ 1-1.2mmo l， 优选 1mmol ∶ 1.1mmol ∶ 1ml ∶ 1.1mmol ∶ 1.1mmol ∶ 1ml ∶ 1.1mmol。所述室温为 10-25℃。
在所述 N- 叔丁氧基 - 羰基 -1， 2- 二氨基乙烷的有机溶液在室温下反应 60-240 分 钟之后， 在所述与氢氧化钠在室温下反应 30-120 分钟之前， 还将反应体系进行如下处理 ： 将反应体系与水混合， 收集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤和萃取后， 将萃取所得有机层用无水硫酸 镁干燥， 再用由体积比为 10 ∶ 1 的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液进行硅胶柱淋洗， 得 到所述产物 a。
另外， 式 III 所示肽核酸单体化合物在制备具有电位势梯度的核酸仿生材料中的 应用， 以及以式 III 所示肽核酸单体化合物为单体制备得到的肽核酸， 也属于本发明的保 护范围。该肽核酸是由式 III 所示肽核酸单体化合物进行缩合反应制备而得。所述具有电 位势梯度的核酸仿生材料优选为生物有机光伏电池。
本发明提供了一种新型结构的肽核酸单体， 并提供了一种合成这类苯并尿嘧啶类 肽核酸单体的新方法。由于该肽核酸单体具有不同的化学结构， 其电性能也不同， 因而， 可 用于构建具有电位势梯度的核酸仿生纳米材料， 应用于光电子领域。 附图说明
图 1 为实施例 1 制备所得中间体的核磁氢谱和碳谱。 图 2 为实施例 2 制备所得中间体的核磁氢谱和碳谱。 图 3 为实施例 3 制备所得中间体的核磁氢谱和碳谱。 图 4 为实施例 4 制备所得肽核酸单体的核磁氢谱和碳谱。具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于以下实施例。下 述方法中如无特别说明， 所述方法均为常规方法。
实施例 1、 制备式 I 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 2)
1) 在 20℃的加热条件下， 将苯并尿嘧啶 (4g， 22.7mmol， 化合物 1) 溶于 120 毫升 的 DMSO 中， 加入 NaOH(4.5g， 113.55mmol)， 在 40℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时， 得到 反应溶液 (A)。
2) 将溴乙酸 (3.16g， 22.71mmol) 溶于 5 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。在 40℃ 的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌反应 12 小时。将反应
液倒入 150 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 150 毫升水中， 用 6N 盐酸调节溶 液的 pH 值至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.5 克 (8.5mmol) 化合物 1， 用 6N 盐酸调节滤液的 pH 值至 2， 得到 1.1 克 (2.3mmol) 产物化合物 2， 产率为 10％。
该产物的核磁结构表征数据如下 ： 1
H-NMR(400MHz ， DMSO-d 6) δ ： 12.99(s ， 1H ， -OH) ， 11.49(s ， 1H ， -NH) ， 7.74(s ， 1H， -phH)， 7.53(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 7.13(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 13 2.35(s， 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 161.6， 149.8， 137.2， 136.4， 132.1， 126.8， 115.3， 113.2， 41.3， 20.2 ； ESI-MS m/z(％ ) ： 233.0(M-H ， 100％ ).
该产物的核磁氢谱和碳谱如图 1 所示。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所示 苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 2)。
其中， 步骤 1) 所用反应物化合物 1 是按照如下方法制备而得 ： 将市售 2- 氨基 -5 甲 基 - 苯甲酸 (4.5g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160℃ 下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所述化合物 1 1(4.5g， 25.6mmol)， 产率 85％。该产物的结构表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.21(s， 1H， -NH)， 11.05(s， 1H， -NH)， 7.69(s， 1H， -phH)， 7.47(d， 1H， J ＝ 7.2Hz， -phH)， 13 7.08(d， 1H， J ＝ 7.2Hz， -phH)， 2.32(s， 3H， -CH3) ；CNMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 162.8， 150.3， 138.7， 135.9， 131.5， 126.5， 115.3， 114.2， 20.2 ； ESI-MS m/z(％ ) ： 176.0(M， 100％ )。由上 可知， 该化合物结构正确， 为所述化合物 1。
实施例 2、 制备式 I 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 4)
1) 在 40℃的加热条件下， 将苯并尿嘧啶 (4g， 22.2mmol， 化合物 3) 溶于 120 毫升 的 DMSO 中， 加入 NaOH(4.44g， 111mmol)， 在 40℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时， 得到反 应溶液 (A)。2) 将溴乙酸 (3.1g， 22.2mmol) 溶于 5 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。在 40 ℃ 的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌 12 小时。将反应液倒 入 150 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 150 毫升水中， 用 6N 盐酸调溶液的 pH 值至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.4 克 (7.8mmol) 化合物 3， 用 6N 盐酸调滤液的 pH 值至 2， 得到 0.8 克 (3.4mmol) 产物化合物 4， 产率为 15％。
该产物的核磁结构表征数据如下 ： 1
H-NMR(400MHz ， DMSO-d 6) δ ： 13.04(s ， 1H ， -OH) ， 11.66(s ， 1H ， -NH) ， 7.65(m ， 13 2H， -phH)， 7.27(m， 1H， -phH)， 4.55(s， 2H， -CH2) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.2，
160.9， 158.7， 156.2， 149.5， 136.1， 123.6， 123.4， 117.7， 114.4， 112.5， 112.3， 41.5 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 238(M， 10％ ).
该产物的核磁氢谱和碳谱如图 2 所示。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所示 苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 4)。
其中， 所述步骤 1) 中所用反应物化合物 3 是按照如下方法制备而得 ： 将市售 2- 氨 基 -5- 氟 - 苯甲酸 (4.65g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶 中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所 述化合物 3(4.5g， 25mmol)， 产率 83％。 1
该产物的结构表征数据如下： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.29(s， broad， 13 2H， -NH)， 7.60(m， 2H， -phH)， 7.21(s， 1H， -phH) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 162.1， 158.5， 156.1， 150.1， 137.5， 123.0， 122.8， 117.6， 117.5， 115.4， 115.3， 112.1， 111.8 ； GCT-MSm/ z(％ ) ： 180.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为所述化合物 3。
实施例 3、 制备式 I 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 6)
1) 在 70℃的加热条件下， 将苯并尿嘧啶 (4g， 20.3mmol， 化合物 5) 溶于 120 毫升 的 DMSO 中， 加入 NaOH(4.06g， 101.5mmol)， 在 40℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时， 得到 反应溶液 (A)。
2) 将溴乙酸 (2.82g， 20.3mmol) 溶于 5 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。在 40℃ 的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌 12 小时。将反应液倒 入 150 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 150 毫升水中， 用 6N 盐酸调溶液的 pH 值至 pH ＝ 7， 得到 1.6 克 (8.2mmol) 化合物 5， 用 6N 盐酸调滤液的 pH 值至 2， 过滤得到 0.7 克 (2.8mmol) 产物化合物 6， 产率为 14％。
该产物的核磁结构表征数据如下 ： 1
H-NMR(400MHz ， DMSO-d 6) δ ： 13.05(s ， 1H ， -OH) ， 11.74(s ， 1H ， -NH) ， 7.89(s ， 1H， -phH)， 7.77(d， 1H， J ＝ 8.8Hz， -phH)， 7.26(d， 1H， J ＝ 8.8Hz， -phH)， 4.55(s， 2H， -CH2) ； 13 CNMR(DMSO-d 6， 100MHz) δ ： 169.4 ， 161.8 ， 150.1 ， 139.7 ， 134.8 ， 126.3 ， 125.9 ， 117.5 ， 115.8， 41.3 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 254.0(M， 25％ ).
该产物的核磁氢谱和碳谱如图 3 所示。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所示 苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 6)。
其中， 所述步骤 1) 中所用反应物化合物 5 是按照如下方法制备而得 ： 将市售 2- 氨 基 -5- 氟 - 苯甲酸 (5.13g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶 中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所
述化合物 5(5.0g， 25.5mmol)， 产率 85％。 1
该产物的结构表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.44(s， 1H， -NH)， 11.27(s， 1H， -NH)， 7.82(s， 1H， -phH)， 7.70(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -phH)， 7.19(d， 1H， J ＝ 13 8.4Hz， -phH) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 161.8， 150.1， 139.7， 134.8， 126.3， 115.9， 117.5， 115.8 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 196.0(M， 100％ )。 由上可知， 该化合物结构正确， 为所述化 合物 5。
实施例 4、 制备式 III 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体 ( 化合物 9)
将实施例 1 制备所得中间体化合物 2(117mg， 0.5mmol)， HBTU(170mg， 0.5mmol) 混 合于 1 毫升的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 加入 N， N- 二异丙基乙基胺 (DIEA， 0.5mmol)。 搅 拌 30 分钟后， 加入化合物 7N- 叔丁氧基 - 羰基 -1， 2- 二氨基乙烷 (120mg， 0.5mmol) 的 1 毫 升 DMF 溶液， 室温搅拌 2 小时后， 倒入 20 毫升水中， 收集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤、 萃取后， 有 机层用无水硫酸镁干燥， 除去有机溶剂后的油状物用硅胶过柱， 用由体积比为 10 ∶ 1 的二 氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液淋洗， 得到产物化合物 8(184mg， 0.41mmol)， 产率为 80％。
将产物化合物 8 溶于体积比为 1 ∶ 1 的由二氯甲烷和乙醇组成的混合溶剂 5 毫升 中， 加入 1 毫摩尔的氢氧化钠， 室温搅拌 2 小时后用 1N 盐酸中和， 调节溶液的 pH 值到 3-5， 除去有机溶剂得到化合物 9， 产率为 100％。
该产物的核磁结构表征数据如下 ： 1
H-NMR(400MHz ， DMSO-d 6) δ ： 12.99(s ， 1H ， -OH) ， 11.49(s ， 1H ， -NH) ， 7.74(s ， 1H， -phH)， 7.53(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 7.13(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 6.7(s， 1H， -NH)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 3.0(d， 2H， J ＝ 5.6Hz， -CH2)， 2.5(m， 3H， -CH2)， 2.35(s， 3H， -CH3)， 2.1(s， 13 1H， -CH2)， 1.37(s， 9H， -Boc-H) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.3， 169.1， 160.7， 155.4， 150.2， 137.7， 136.7， 132.8， 127.6， 125.3， 114.2， 80.5， 54.2， 52.8， 49.8， 42.3， 28.6， 20.2 ； ESI-MS m/z(％ ) ： 433.0(M-H ， 100％ ).
该产物的核磁氢谱和碳谱如图 4 所示。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 III 所 示苯并尿嘧啶类肽核酸单体 ( 化合物 9)。
实施例 5、 用实施例 4 制备所得肽核酸单体制备具有电位势梯度的肽核酸纳米异 质结 ： 制 备 Pc-R2-CONH-AAAAA-CONH-R1-PDI-R1-CONH-Tpy-8UTTφTna-CONH2(Tφ 中 的 取 代 基 R ＝ -CH3， Tna 和 Tpy-8 中的取代基 R 为 H) 肽核酸纳米异质结 1
1) 以 4- 甲苯氢胺 (MBHA 树脂 ) 为起始单元， 用二氯甲烷溶胀后， 用 2mL 三氟乙酸 (TFA) 处理 3 次， 每次 3 分钟， 然后分别用 2mL 摩尔比为 1 ∶ 1 的 DMF/DCM 洗 3 次， 2mL 吡 啶洗两次后， 将碱基为 Tpy-8 的肽核酸单体用脱水催化剂和二异丙基乙基胺进行活化后， 与
MBHA 树脂于 125μL N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中进行反应， 用 DMF 洗涤两次， 用封端试剂 ( 乙酸酐 ) 处理并洗涤后， 得到 MBHA-Tpy-8 化合物 ；
2) 将 所 述 MBHA-Tpy-8 化 合 物 与 碱 基 为 U 的 肽 核 酸 单 体 进 行 脱 水 反 应， 得到 MBHA-Tpy-8U 化合物 ；
3) 重复所述步骤 2)(3) 次， 得到 MBHA-Tpy-8UTTφTna 化合物 ；
4) 将 PDI 用脱水催化剂和二异丙基乙基胺进行活化后， 与所述 MBHA-Tpy-8UTTφTna 化合物进行反应， 得到 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI 化合物 ；
5) 将碱基为 A1 的肽核酸单体用脱水催化剂和二异丙基乙基胺进行活化后， 与所述 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI 化合物进行反应， 得到 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI-R1-A1 化合物 ；
6) 将所述 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI-R1-A1 化合物与碱基为 A2 的肽核酸单体进行脱 水反应， 得到 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI-R1-A1 A2 化合物 ；
7) 重复所述步骤 6)3 次， 得到 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI-R1-A1 A2…… An 化合物 ；
8) 将 Pc 用 脱 水 催 化 剂 和 二 异 丙 基 乙 基 胺 进 行 活 化 后，与 所 述 MBHA-T py-8UTT φT na-R 1-PDI-R 1-A 1 A 2…… A n 化 合 物 进 行 反 应， 得 到 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI-R1-A1 A2…… An-R2-Pc ； 9) 将所述 MBHA-Tpy-8UTTφTna-R1-PDI-R1-A1 A2…… An-R2-Pc 与 5mL 三氟乙酸和 5mL TFMSA 分别进行反应， 并用乙酸乙酯沉淀后， 收集沉淀， 得到未纯化的所述肽核酸纳米异质 结分子。
将上述未纯化的肽核酸纳米异质结分子溶于 0.5mL DMF 中， 注入到高压液相色谱 仪 (HPLC) 中， 用 TFA/H2O( 体积比 0.5％ ) 和 CH3CN/H2O( 体积比 0.5％ ) 的混合溶剂洗脱， 收集洗脱液， 用质谱 (TOF-MS) 确定所需产物后， 冷冻干燥， 所得固体再用 HPLC 和 TOF-MS 进 行检测， 确定为目标产物， 即 Pc-R2-CONH-AAAAA-CONH-R1-PDI-R1-CONH-Tpy-8UTTφTna-CONH2(T 为一个共价偶联有 PDI 和 Pc 的肽核酸分子 ； naTφTpy-8 中的取代基 R ＝ -CH3)，
10) 将所述步骤 9) 中得到的共价偶联有 PDI 和 Pc 的肽核酸分子溶于由 50μL 水 和 50μL 浓度为 200mM/L NaCl 水溶液组成的混合液中， 置于 37℃的培养器中培养 2 小时， 得到式 I 所述 PNA 为 -CONH-Tn-CONH2 的肽核酸纳米异质结 1。
所述步骤 1)- 步骤 9) 中， 所述反应均为等摩尔反应， 如所述步骤 1) 中， 所述碱基 为 T1 的肽核酸单体、 脱水催化剂、 二异丙基乙基胺和 4- 甲苯氢胺 (MBHA) 树脂的摩尔比均 为 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1。各反应步骤中， 有机溶剂的用量以完全溶解反应物为准 ； 所述脱水催化 剂为苯并三氮唑 -N， N， N′， N′ - 四甲基脲六氟磷酸盐。
该肽核酸纳米异质结 1 可按照常规方法制备生物有机光伏电池， 其制备方法如 下： 在处理干净的 ITO 玻璃表面上， 旋涂一层厚度为 40nm 的 PSS/PEDOT( 聚二氧乙基噻吩聚 对苯乙烯磺酸 ) 后， 在 150℃干燥 0.5 小时后， 将所述肽核酸纳米异质结 1 与硝基苯组成的 混合物中旋涂在该 PSS/PEDOT 层上， 得到生物有机光伏电池的活性层 ( 厚度为 100nm)， 于 -5 100℃干燥 1 小时后， 在真空度为 5×10 Pa 的条件下， 蒸镀一层厚度为 150nm 的金属铝电 极， 得到所述生物有机光伏电池。
该方法中， 所述碱基为 Tφ(R 为 -CH3) 的肽核酸为化合物 9φ， 是按照如下方法制备 而得 ：
1) 将中间体化合物 2φ(117mg， 0.5mmol)， HBTU(170mg， 0.5mmol) 混合于 1 毫升的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 加入 N， N- 二异丙基乙基胺 (DIEA， 0.5mmol)。搅拌 30 分钟 后， 加入化合物 7φN- 叔丁氧基 - 羰基 -1， 2- 二氨基乙烷 (120mg， 0.5mmol) 的 1 毫升 DMF 溶液， 室温搅拌 2 小时后， 倒入 20 毫升水中， 收集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤、 萃取后， 有机层用 无水硫酸镁干燥， 除去有机溶剂后的油状物用硅胶过柱， 用由体积比为 10 ∶ 1 的二氯甲烷 和乙酸乙酯组成的混合液淋洗， 得到产物化合物 8φ(184mg， 0.41mmol)， 产率为 80％。2) 将 产物化合物 8φ 溶于体积比为 1 ∶ 1 的由二氯甲烷和乙醇组成的混合溶剂 5 毫升中， 加入 1 毫摩尔的氢氧化钠， 室温搅拌 2 小时后用 1N 盐酸中和， 调节溶液的 pH 值到 3-5， 除去有 1 机溶剂得到化合物 9φ， 产率为 100％。该产物的核磁结构表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 12.99(s， 1H， -OH)， 11.49(s， 1H， -NH)， 7.74(s， 1H， -phH)， 7.53(d， 1H， J ＝ 8.0 Hz， -phH)， 7.13(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 6.7(s， 1H， -NH)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 3.0(d， 2H， J＝ 13 5.6Hz， -CH2)， 2.5(m， 3H， -CH2)， 2.35(s， 3H， -CH3)， 2.1(s， 1H， -CH2)， 1.37(s， 9H， -Boc-H) ； C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.3， 169.1， 160.7， 155.4， 150.2， 137.7， 136.7， 132.8， 127.6， 125.3， 114.2， 80.5， 54.2， 52.8， 49.8， 42.3， 28.6， 20.2 ； ESI-MS m/z( ％ ) ： 433.0(M-H-， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 III 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体 ( 化合物 9φ)。
其中， 所述中间体化合物 2φ 是按照如下方法制备而得 ：
1) 在 20℃的加热条件下， 将苯并尿嘧啶 (4g， 22.7mmol， 化合物 1φ) 溶于 120 毫升 的 DMSO 中， 加入 NaOH(4.5g， 113.55mmol)， 在 40℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时， 得到 反应溶液 (A)。2) 将溴乙酸 (3.16g， 22.71mmol) 溶于 5 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。 在 40℃的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌反应 12 小时。 将反应液倒入 150 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 150 毫升水中， 用 6N 盐 酸调节溶液的 pH 值至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.5 克 (8.5mmol) 化合物 1φ， 用 6N 盐酸调滤液的 pH 值至 2， 过滤得到 1.1 克 (2.3mmol) 产物化合物 2φ， 产率为 10％。该产物的核磁结构表 1 征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 12.99(s， 1H， -OH)， 11.49(s， 1H， -NH)， 7.74(s，
1H， -phH)， 7.53(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 7.13(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -phH)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 13 2.35(s， 3H， -CH3) ；CNMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 161.6， 149.8， 137.2， 136.4， 132.1， 126.8， 115.3， 113.2， 41.3， 20.2 ； ESI-MS m/z(％ ) ： 233.0(M-H ， 100％ )。 由上可知， 该化合 物结构正确， 为式 I 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 2φ)。
其中， 步骤 1) 所用反应物化合物 1φ 是按照如下方法制备而得 ： 将市售 2- 氨基 -5 甲基 - 苯甲酸 (4.5g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160 ℃下加热过夜， 降温到 100 ℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所 1 述化合物 1φ(4.5g， 25.6mmol)， 产率 85 ％。该产物的结构表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.21(s， 1H， -NH)， 11.05(s， 1H， -NH)， 7.69(s， 1H， -phH)， 7.47(d， 1H， J ＝ 13 7.2Hz， -phH)， 7.08(d， 1H， J ＝ 7.2Hz， -phH)， 2.32(s， 3H， -CH3) ；CNMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 162.8， 150.3， 138.7， 135.9， 131.5， 126.5， 115.3， 114.2， 20.2 ； ESI-MS m/z( ％ ) ： 176.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为所述化合物 1φ。
所述碱基为 Tna(R 为 H) 的肽核酸为化合物 5na， 是按照如下方法制备而得 ：
将中间体化合物 2na(130mg， 0.5mmol) 和 HBTU(170mg， 0.5mmol) 混合于 1 毫升的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 加入而异丙基乙基胺 (DIEA， 0.5mmol)。搅拌 30 分钟后， 加 入化合物 3na(120mg， 0.5mmol) 的 1 毫升 DMF 溶液， 室温搅拌 3 小时后， 倒入 20 毫升水中， 收集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤、 萃取后， 有机层用无水硫酸镁干燥， 除去有机溶剂后的油状物 用硅胶过柱， 用由体积比为 10 ∶ 1 的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液淋洗， 得到产物 化合物 4na(200mg， 0.41mmol)， 产率 80 ％。将化合物 4na 溶于体积比为 1 ∶ 1 的由二氯甲 烷和乙醇组成的混合溶剂 5 毫升中， 加入 1 毫摩尔的氢氧化钠， 室温搅拌 2 小时， 后用 1N 盐酸中和， 调溶液的 pH 值到 3-5， 除去有机溶剂得到化合物 5na， 产率为 100 ％。该产物的 1 H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 13.04(s， 1H， -OH)， 11.67(s， 1H， -NH)， 结构表征数据如下 ： 8.71(s， 1H， -naph-H)， 8.15(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -naph-H)， 7.95(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -naph-H)， 7.63(t， 1H， J ＝ 8.0Hz， -naph-H)， 7.59(s， 1H， -naph-H)， 7.48(t， 1H， J ＝ 8.0Hz， -naph-H)， 4.90(s， 2H， -CH2)， 3.0(d， 2H， J ＝ 5.6Hz， -CH2)， 2.5(m， 3H， -CH2)， 2.1(s， 1H， -CH2)， 1.37(s， 13 9H， -Boc-H) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 161.7， 149.8， 136.4， 134.9， 13 1.2， 129.6， 129.5， 128.6， 126.8， 125.1， 114.2， 110.4， 80.5， 54.2， 52.8， 49.8， 41.4， 28.6， 20.2 ； ESI-MSm/z(％ ) ： 469.2(M-H ， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 III 所示萘并尿 嘧啶类肽核酸单体 ( 化合物 5na)。
其中， 中间体化合物 2na 是按照如下方法制备而得 ：
1) 在 20 ℃的加热条件下， 将萘并尿嘧啶 (4.0g， 18.8mmol， 化合物 1na) 溶于 100 毫升的 DMSO 中， 加入 NaOH(3.76g， 94.0mmol)， 在 20 ℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时， 得到反应溶液 (A)。2) 将溴乙酸 (2.512g， 18.8mmol) 溶于 4 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。在 20 ℃的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌 1 小 时。将反应液倒入 200 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 200 毫升水中， 用 6N 盐酸调溶液的 pH 值至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.2 克 (5.7mmol) 化合物 1na， 用 6N 盐酸调滤 液的 pH 值至 2， 过滤得到 0.91 克 (3.4mmol) 化合物 2na， 产率 18％。该产物的核磁结构表 1 征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 13.04(s， 1H， -OH)， 11.67(s， 1H， -NH)， 8.71(s， 1H， -naph-H)， 8.15(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -naph-H)， 7.95(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -naph-H)， 7.63(t， 1H， J ＝ 8.0Hz， -naph-H)， 7.59(s， 1H， -naph-H)， 7.48(t， 1H， J ＝ 8.0Hz， -naph-H)， 4.90(s， 13 2H， -CH2)， 2.35(s， 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 161.7， 149.8， 136.4， 134.9， 131.2， 129.6， 129.5， 128.6， 126.8， 125.1， 114.2， 110.4， 41.4 ； ESI-MS m/z( ％ ) ： 269.1(M-H ， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体 的中间体 ( 化合物 2na)。
其中， 上述制备方法步骤 1) 中所用反应物化合物 1na 是按照如下方法制备而得 ： 将 市售 2- 氨基 -5 甲基 - 苯甲酸 (5.61g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160 ℃下加热过夜， 降温到 100 ℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收 集沉淀得到所述化合物 1na(5.2g， 24.5mmol)， 产率 82 ％。该产物的结构表征数据如下 ： 1 H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.31(s， 1H， -NH)， 11.20(s， 1H， -NH)， 8.64(s， 1H， -naph-H)， 8.10(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -naph-H)， 7.90(d， 1H， J ＝ 8.4Hz， -naph-H)， 7.61(t， 1H， J ＝ 13 8.0Hz， -naph-H)， 7.52(s， 1H， -naph-H)， 7.47(t， 1H， J ＝ 8.0Hz， -naph-H) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 162.9， 150.3， 136.5， 136.3， 129.5， 129.2， 129.0， 128.5， 126.7， 124.9， 115.2， 110.2 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 212.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为所述化合物 1na。
所述碱基为 Tpy-8(R 为 H) 的肽核酸为化合物 9 是按照如下方法制备而得 ：
1) 将中间体 ( 化合物 3)(111mg， 0.5mmol)， HBTU(170mg， 0.5mmol) 混合于 1 毫升的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 加入 N， N- 二异丙基乙基胺 (DIEA， 0.5mmol)。 搅拌 30 分钟后， 加入化合物 7(120mg， 0.5mmol) 的 1 毫升 DMF 溶液， 室温搅拌 3 小时后， 倒入 20 毫升水中， 收 集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤、 萃取后， 有机层用无水硫酸镁干燥， 除去有机溶剂后的油状物用 硅胶过柱， 用由体积比为 10 ∶ 1 的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液淋洗， 得到产物化合 物 8(208mg， 0.46mmol)， 产率 90％。 2) 将产物化合物 8 溶于体积比为 1 ∶ 1 的由二氯甲烷和 乙醇组成的混合溶剂 5 毫升中， 加入 1 毫摩尔的氢氧化钠， 室温搅拌 2 小时， 后用 1N 盐酸中 和， 调节溶液的 pH 值到 3-5， 除去有机溶剂得到化合物 9， 产率为 100％。该化合物 9 的核磁 1 检测数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 13.03(s， 1H， -OH)， 11.46(s， 1H， -NH)， 8.70(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 8.30(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 7.31(q， 1H， J ＝ 4.8 and 6.8Hz， -pyH)， 6.5(s， 1H， -NH)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 3.85(s， 2H， -CH2)， 3.0(m， 2H， -CH2)， 2.5(m， 2H， -CH2)， 13 1.37(s， 9H， -Boc-H) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.3， 168.1， 162.2， 160.7， 154.8， 151.3， 150.4， 135.7， 118.5， 114.2， 80.5， 54.2， 52.8， 49.8， 42.3， 28.6 ； ESI-MS m/z( ％ ) ： 420.0(M-H ， 100％。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 III 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体 ( 化合物 9)。
其中， 所述中间体化合物 3 是按照如下方法制备而得 ：1) 在 30℃的加热条件下， 将化合物 2 吡啶并尿嘧啶 (4g， 24.5mmol) 溶于 120 毫升 的 DMSO 中， 加入 NaOH(2.3g， 56.8mmol)， 在 30℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时， 得到反 应溶液 (A)。
2) 将溴乙酸 (3.16g， 22.71mmol) 溶于 5 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。30℃的 加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌 12 小时。将反应液倒入 150 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 50 毫升水中， 用 6N 盐酸调溶液的 pH 值 至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.5 克 (9.2mmol) 化合物 2， 用 6N 盐酸调滤液的 pH 值至 2， 过滤得到 1 1.1 克 (5.0mmol) 产物化合物 3， 产率 20％。该产物的核磁检测数据如下 ： H-NMR(400MHz，
DMSO-d6)δ ： 13.06(s， 1H， -NH)， 11.48(s， 1H， -NH)， 8.70(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 8.26(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 7.28(q， 1H， J ＝ 4.8 and6.8Hz， -pyH)， 4.53(s， 2H， -CH2)， 3.30(s， 13 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 162.2， 152.5， 151.8， 149.3， 135.7， 126.5， 117.2， 41.2 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 221.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所 示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 3)。 其中， 上述方法步骤 1) 中所用反应物化 合物 2 吡啶并尿嘧啶是按照如下方法制备而得 ：
将 市 售 的 2- 氨 基 -3- 羧 基 - 吡 啶 (4.14g， 30mmol， 化 合 物 1) 和 尿 素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 50mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到化合物 2(2.5g， 15.33mmol)， 产率 51％。该产物的结构 1 表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.64(s， 1H， -NH)， 11.48(s， 1H， -NH)， 8.60(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 8.26(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 7.26(q， 1H， J ＝ 4.8and 6.8Hz， -pyH)， 13 3.30(s， 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 162.2， 154.8， 151.3， 150.4， 135.7， 126.5， 110.2， 20.2 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 163.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为化合物 2 吡啶并尿嘧啶。
实施例 6、 用实施例 4 制备所得肽核酸单体制备具有电位势梯度的肽核酸纳米异 质结 ： 制备 Pc-R2-CONH-AAAAA-CONH-R1-PDI-R1-NHCO-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5-NHCO-R2-Pc 肽核酸 Tna、 Tpy-5 和 Tpy-8 中的取代基 R 为 H， Tφ′ 纳米异质结 ( 其中， 碱基 Tφ 中的取代基 R ＝ -CH3， 中的取代基 R ＝ -OCH3)
1) 以 MBHA 树脂为起始单元， 用二氯甲烷溶胀后， 用 2mL 三氟乙酸 (TFA) 处理 3 次， 每次 3 分钟， 然后分别用 2mL 摩尔比为 1 ∶ 1 的 DMF/DCM 洗 3 次， 2mL 吡啶洗两次后， 将碱 基为 T1 的肽核酸单体用脱水催化剂和二异丙基乙基胺进行活化后， 与 MBHA 树脂于 125μL N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中进行反应， 用 DMF 洗涤两次， 用封端试剂 ( 乙酸酐 ) 处理并洗 涤后， 得到 MBHA-Tna 化合物 ；
2) 将 所 述 MBHA-Tna 化 合 物 与 碱 基 为 Tφ 的 肽 核 酸 单 体 进 行 脱 水 反 应， 得到 MBHA-TnaTφ 化合物 ；
3) 重复所述步骤 2)3 次， 得到 MBHA-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5 化合物 ；
4) 将 Pc 用 脱 水 催 化 剂 和 二 异 丙 基 乙 基 胺 进 行 活 化 后，与 所 述 MBHA-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5 化合物进行反应， 得到 MBHA-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5-R2-Pc 化合物 ；
5) 将 所 述 MBHA-TnaTφTφ ′ Tpy-8Tpy-5-R2-Pc 化 合 物 与 5mL 三 氟 乙 酸 和 5mL TFMSA 进 行 反 应， 并 用 乙 酸 乙 酯 沉 淀 后， 收 集 沉 淀， 得到未纯化的结构简式为 HOOC-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5-R2-Pc 的肽核酸分子 A ；
将上述未纯化的结构简式为 HOOC-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5-R2-Pc 的肽核酸分子 A 溶于 2mLDMF 中， 注入到高压液相色谱仪 (HPLC) 中， 用 TFA/H2O( 体积比 0.5％ ) 和 CH3CN/H2O( 体积 比 0.5％ ) 的混合溶剂洗脱， 收集洗脱液， 用质谱 (TOF-MS) 确定所需产物后， 冷冻干燥， 所得 固体再用 HPLC 和 TOF-MS 进行检测， 确定其结构式无误， 为 HOOC-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5-R2-Pc ；
6) 以 MBHA 树脂为起始单元， 用二氯甲烷溶胀后， 用 2mL 三氟乙酸 (TFA) 处理 3 次， 每次 3 分钟， 然后分别用 2mL 摩尔比为 1 ∶ 1 的 DMF/DCM 洗 3 次， 2mL 吡啶洗两次后， 将碱 基为 A1 的肽核酸单体用脱水催化剂和二异丙基乙基胺进行活化后， 与 MBHA 树脂于 125μL N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中进行反应， 用 DMF 洗涤两次， 用封端试剂 ( 乙酸酐 ) 处理并洗
涤后， 得到 MBHA-A1 化合物 ；
7) 将所述 MBHA-A1 化合物与碱基为 A2 的肽核酸单体进行脱水反应， 得到 MBHA-A1 A2 化合物 ；
8) 重复所述步骤 7)3 次， 得到 MBHA-A1 A2…… An 化合物 ；
9) 将 Pc 用脱水催化剂和二异丙基乙基胺进行活化后， 与所述 MBHA-A1 A2……An 化 合物进行反应， 得到 MBHA-A1 A2…… An-R2-Pc 化合物 ；
10) 将所述 MBHA-A1 A2…… An-Pc 化合物与三氟乙酸和 TFMSA 进行反应， 并用乙酸 乙酯沉淀后， 收集沉淀， 得到结构简式为 HOOC-A1 A2…… An-R2-Pc 的肽核酸分子 B ；
将上述未纯化的肽核酸纳米异质结分子 B 溶于 2mL DMF 中， 注入到高压液相色谱 仪 (HPLC) 中， 用 TFA/H2O( 体积比 0.5％ ) 和 CH3CN/H2O( 体积比 0.5％ ) 的混合溶剂洗脱， 收集洗脱液， 用质谱 (TOF-MS) 确定所需产物后， 冷冻干燥， 得到的固体再用 HPLC 和 TOF-MS 进行检测， 确定其结构式无误， 为 HOOC-A1 A2…… An-R2-Pc。
11) 将所述结构简式为 HOOC-TnaTφTφ′ Tpy-8Tpy-5-R2-Pc 的肽核酸分子 A 溶于 1mL 的 DMF 中， 用脱水催化剂和二异丙基乙基胺活化后， 与 1mL PDI 于 DMF 中反应 30 分钟后， 再加 入用脱水催化剂和二异丙基乙基胺活化的结构简式为 HOOC-A1A2…… An-R2-Pc 的肽核酸分 子 B 反应 30 分钟后， HPLC 分离， 得到所述 Pc-R2-CONH-AAAAA-CONH-R1-PDI-R1-NHCO-TnaTφT 为另一个共价偶联有 PDI 和 Pc 的肽核酸分子 ； φ′ Tpy-8Tpy-5-NHCO-R2-Pc，
12) 将所述步骤 11) 中得到的共价偶联有 PDI 和 Pc 的肽核酸分子溶于由 50μL 水 和 50μL 浓度为 200mM/L NaCl 水溶液组成的混合液中， 置于 37℃的培养器中培养 2 小时， 得到式 I 所述 PNA 为 -NHCO-Tn-NHCO-R2-Pc 的肽核酸纳米异质结 2。
所述步骤 1)- 步骤 11) 中， 所述反应均为等摩尔反应， 如所述步骤 1) 中， 所述碱基 为 T1 的肽核酸单体、 脱水催化剂、 二异丙基乙基胺和 4- 甲苯氢胺 (MBHA) 树脂的摩尔比均 为 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1。各反应步骤中， 有机溶剂的用量以完全溶解反应物为准 ； 所述脱水催化 剂为苯并三氮唑 -N， N， N′， N′ - 四甲基脲六氟磷酸盐。
该肽核酸纳米异质结 2 可按照常规方法制备生物有机光伏电池， 其制备方法如 下：
在处理干净的 ITO 玻璃表面上， 旋涂一层厚度为 40nm 的 PSS/PEDOT( 聚二氧乙基 噻吩聚对苯乙烯磺酸 ) 后， 在 150 ℃干燥 0.5 小时后， 将所述肽核酸纳米异质结 2 与硝基 苯组成的混合物中旋涂在该 PSS/PEDOT 层上， 得到生物有机光伏电池的活性层 ( 厚度为 100nm)， 于 100℃干燥 1 小时后， 在真空度为 5×10-5Pa 的条件下， 蒸镀一层厚度为 150nm 的 金属铝电极， 得到所述生物有机光伏电池。
所述碱基为 Tna(R 为 H) 的肽核酸是按照实施例 5 提供的方法制备而得。
所述碱基为 Tφ(R ＝ -CH3) 的肽核酸是按照实施例 5 提供的方法制备而得。
所述碱基为 Tpy-8(R 为 H) 的肽核酸是按照实施例 5 提供的方法制备而得。
所述碱基为 Tφ′ (R ＝ -CH3) 的肽核酸是按照如下方法制备而得 ：
将 化 合 物 2φ ′ (140mg， 0.5mmol) 和 HBTU(170mg， 0.5mmol) 混 合 于 1 毫 升 的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 加入 N， N- 二异丙基乙基胺 (DIEA， 0.5mmol) 搅拌 30 分钟后， 加入化合物 3φ′ (120mg， 0.5mmol) 的 1 毫升 DMF 溶液， 室温搅拌 3 小时后， 倒入 20 毫升水 中， 收集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤、 萃取后， 有机层用无水硫酸镁干燥， 除去有机溶剂后的油状 物用硅胶过柱， 用由体积比为 10 ∶ 1 的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液淋洗， 得到产物 化合物 4φ′ (210mg， 0.42mmol)， 产率 81 ％。将化合物 4φ′ 溶于由体积比为 1 ∶ 1 的二氯 甲烷和乙醇组成的混合溶剂 5 毫升中， 加入 1 毫摩尔的氢氧化钠， 室温搅拌 2 小时， 后用 1N 盐酸中和， 调溶液的 pH 值到 3-5， 除去有机溶剂得到化合物 5φ′， 产率为 100 ％。该化 1 H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 12.99(s， 1H， -OH)， 11.49(s， 合物 5φ′ 的核磁检测数据如下 ： 1H， -NH)， 7.29(s， 1H， -ph-H)， 6.71(s， 1H， -ph-H)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 3.85(s， 3H， -CH3)， 3.80(s， 3H， -CH3)， 3.0(d， 2H， J ＝ 5.6Hz， -CH2)， 2.5(m， 3H， -CH2)， 2.1(s， 1H， -CH2)， 1.37(s， 13 9H， -Boc-H) ；CNMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.3， 169.1， 160.7， 155.4， 150.2， 137.7， 136.7， 132.8， 127.6， 125.3， 114.2， 80.5， 56.2， 54.8， 54.2， 52.8， 49.8， 42.3， 28.6 ； ESI-MS m/ z(％ ) ： 479.0(M-H ， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 III 所示苯并尿嘧啶类肽 核酸单体 ( 化合物 5φ′ )。
其中， 所述化合物 2φ′是按照如下方法制备而得 ：
1) 在 20℃的加热条件下， 将二甲氧基苯并尿嘧啶 (4g， 18mmol， 化合物 1φ′ ) 溶于 90 毫升的 DMSO 中， 加入 NaOH(3.6g， 90mmol)， 在 20℃的加热条件下， 搅拌反应 1 个小时后， 得到反应溶液 (A)。2) 将溴乙酸 (2.5g， 18mmol) 溶于 5 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。 在 20℃的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌 12 小时。将 反应液倒入 150 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 100 毫升水中， 用 6N 盐酸 调溶液的 pH 值至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.6 克 (7.2mmol) 化合物 1φ′， 用 6N 盐酸调滤液的 pH 产率 16 ％。该产物的核磁结构表 值至 2， 过滤得到 0.81 克 (2.9mmol) 产物化合物 2φ′， 1 征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 12.94(s， 1H， -OH)， 11.36(s， 1H， -NH)， 7.29(s，
13 1H， -ph-H)， 6.71(s， 1H， -ph-H)， 4.53(s， 2H， -CH2)， 3.85(s， 3H， -CH3)， 3.80(s， 3H， -CH3) ； C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 161.6， 149.8， 137.2， 136.4， 132.1， 126.8， 115.3， 113.2， 56.2， 54.3， 41.3 ； EI-MS m/z(％ ) ： 280.1(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 2φ′ )。其中， 所述步骤 1) 中所用反应 物化合物 1φ′是按照如下方法制备而得 ： 将市售 2- 氨基 -4， 5- 二甲氧基 - 苯甲酸 (5.92g， 30mmol) 和尿素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160 ℃下加热过夜， 降 温到 100 ℃， 加入 150mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到所述化合物 1φ′ (5.8g， 1 26.1mmol)， 产率 87％。 该产物的结构表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.36(s， 1H， -NH)， 11.21(s， 1H， -NH)， 7.29(s， 1H， -ph-H)， 6.71(s， 1H， -ph-H)， 3.85(s， 3H， -CH3)， 13 3.80(s， 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 161.6， 149.8， 137.2， 136.4， 132.1， 126.8， 115.3， 113.2， 56.2， 54.3 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 222.2(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正 确， 为所述化合物 1φ′。
所述碱基为 Tpy-5(R 为 H) 的肽核酸为化合物 11， 是按照如下方法制备而得 ：
1) 将中间体 ( 化合物 6)(111mg， 0.5mmol)， HBTU(224.4mg， 0.66mmol) 混合于 3 毫 升的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 加入 N， N- 二异丙基乙基胺 (DIEA， 0.66mmol)。搅拌 40 分钟后， 加入化合物 7(144mg， 0.66mmol) 的 3 毫升 DMF 溶液， 室温搅拌 5 小时后， 倒入 30 毫 升水中， 收集沉淀， 用乙酸乙酯洗涤、 萃取后， 有机层用无水硫酸镁干燥， 除去有机溶剂后的 油状物用硅胶过柱， 用由体积比为 10 ∶ 1 的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液淋洗， 得到 产物化合物 10(188mg， 0.42mmol)， 产率 84％。 2) 将产物化合物 10 溶于体积比为 1 ∶ 1 的由 二氯甲烷和乙醇组成的混合溶剂 6 毫升中， 加入 1.2 毫摩尔的氢氧化钠， 室温搅拌 3 小时， 后用 1N 盐酸中和， 调节溶液的 pH 值到 3-5， 除去有机溶剂得到化合物 11， 产率为 100％。该 1 化合物 11 的核磁检测数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 13.08(s， 1H， -OH)， 11.49(s， 1H， -NH)， 8.71(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 8.28(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 7.28(q， 1H， J ＝ 4.8 and 6.8Hz， -pyH)， 6.5(s， 1H， -NH)， 4.55(s， 2H， -CH2)， 3.85(s， 2H， -CH2)， 3.0(m， 2H， -CH2)， 13 2.5(m， 2H， -CH2)， 1.37(s， 9H， -Boc-H) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.3， 168.5， 160.7， 154.4 ， 152.2 ， 148.7 ， 138.7 ， 135.2 ， 117.6 ， 115.3 ， 80.5 ， 54.2 ， 52.8 ， 49.8 ， 42.3 ， 28.6 ； ESI-MSm/z(％ ) ： 420.0(M-H ， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 III 所示苯并尿 嘧啶类肽核酸单体 ( 化合物 11)。
其中， 所述中间体化合物 6 是按照如下方法制备而得 ：
1) 在 20℃的加热条件下， 将吡啶并尿嘧啶 (4g， 24.5mmol， 化合物 5) 溶于 100 毫升 的 DMSO 中， 加入 NaOH(9.0g， 227.1mmol)， 在 20℃的加热条件下， 搅拌反应 3 个小时， 得到反 应溶液 (A)。 2) 将溴乙酸 (3.48g， 24.9mmol) 溶于 3 毫升 DMSO 中， 得到反应溶液 (B)。 在 20℃ 的加热条件下， 将反应溶液 B 加入到反应溶液 A 中， 加完后， 继续搅拌 10 小时。将反应液倒 入 130 毫升乙酸乙酯中， 收集得到的沉淀， 将沉淀溶于 130 毫升水中， 用 6N 盐酸调溶液的 pH 值至 pH ＝ 7， 过滤得到 1.5 克 (9.2mmol) 化合物 5， 用 6N 盐酸调滤液的 pH 值至 2， 过滤得到 1 0.81 克 (3.7mmol) 产物化合物 6， 产率 15％。该产物的核磁检测数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 13.04(s， 1H， -NH)， 11.48(s， 1H， -NH)， 8.60(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 8.30(d， 3.30(s， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 7.3 1(q， 1H， J ＝ 4.8 and 6.8Hz， -pyH)， 4.53(s， 2H， -CH2)， 13 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 169.4， 161.9， 154.8， 151.3， 149.4， 135.7， 118.5， 114.2， 41.2 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 221.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为式 I 所 示苯并尿嘧啶类肽核酸单体的中间体 ( 化合物 6)。 其中， 上述方法步骤 1) 中所用反应物化 合物 5 吡啶并尿嘧啶是按照如下方法制备而得 ：
将 市 售 的 2- 氨 基 -3- 羧 基 - 吡 啶 (4.14g， 30mmol， 化 合 物 4) 和 尿 素 (18g， 300mmol) 混合在一个 100mL 的圆底烧瓶中， 160℃下加热过夜， 降温到 100℃， 加入 50mL 水， 搅拌 30 分钟后， 过滤， 收集沉淀得到化合物 5(3.5g， 21.5mmol)， 产率 71％。该产物的结构 1 表征数据如下 ： H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ ： 11.64(s， 1H， -NH)， 11.48(s， 1H， -NH)， 8.60(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 8.30(d， 1H， J ＝ 8.0Hz， -pyH)， 7.31(q， 1H， J ＝ 4.8and 6.8Hz， -pyH)， 13 3.30(s， 3H， -CH3) ；C NMR(DMSO-d6， 100MHz)δ ： 162.2， 154.8， 151.3， 150.4， 135.7， 126.5， 110.2， 20.2 ； GCT-MS m/z(％ ) ： 163.0(M， 100％ )。由上可知， 该化合物结构正确， 为化合物 5。