技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种萘酰亚胺-氨基酸化合物及其制备、应用，同时涉及一种萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点及其应用。
背景技术
由于癌细胞与正常细胞DNA的差异性，将DNA作为抗肿瘤药物的靶点是一种理想的选择。DNA嵌入剂在治疗肿瘤方面作用显著，其中萘酰亚胺类衍生物可以作为切断剂和嵌入剂，从而产生抗肿瘤活性。萘酰亚胺类衍生物绝大部分都具有DNA嵌入作用，嵌入DNA以后，可见DNA双螺旋被拉长，DNA溶液粘度增加，从而进一步产生明显的生物活性。天然产物的结构修饰及生理活性研究一直是新药研发的重要途径。由于结构上的特殊性以及本身具有的生物活性，以氨基酸为基础的药物合成以及新药研发比较活跃。氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酶。例如谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸等氨基酸可以单独作用治疗一些疾病，主要用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科营养和解毒等。此外氨基酸衍生物在癌症治疗上也表现出比较好的功能。因此，在抗肿瘤药物的结构中引入氨基酸结构，设计合成新型结构的萘酰亚胺衍生物，利用这些结构新颖的萘酰亚胺来实现抗肿瘤的靶向作用。
此外，用于生物分子和细胞上的一种重要的标志物——量子点(Quantum Dots, DQs)，也在肿瘤研究中有广泛的应用。量子点(CdSe, CdS, ZnS等)作为一种新型的荧光材料，比起传统的有机染料，更适合偶联到生物分子上作为生物荧光探针应用于免疫生物学和临床检验学等医学领域，在生命科学研究中起到定性和定量标识生物分子和细胞的作用。量子点的这些特点，符合目前肿瘤研究的需要。并且现有技术中的肿瘤靶向性量子点还存在着有如发射光谱宽、尺寸分布不均匀、荧光量子产率低等。因此，功能化量子点的改进成为目前肿瘤研究的重要趋势之一。
发明内容
本发明提供一种靶向性抗肿瘤的萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点及其制备方法和应用。
本发明采用以下技术方案：
一种萘酰亚胺-氨基酸化合物，具有如下通式：
其中n = 1或2，x = 1或2；R为氨基酸残基。
所述量子点为CdSe、CdSe/CdS或CdSe/ZnS；所述R为L-赖氨酸残基、L-精氨酸残基、a-氨基戊酰胺酸残基或a-氨基丁酰胺酸残基。
萘酰亚胺-氨基酸化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1) 以1,8-萘二甲酰亚胺和二溴代烷烃为原料，在碱性物质、KI和十六烷基三甲基溴化铵的作用下，在有机溶剂中反应后经过柱层析得到化合物a；
(2)以氨基酸为原料，在NaHCO3作用下，与二碳酸二叔丁酯反应后经过萃取得到化合物b；
(3) 将反应所得的化合物b溶于二甲基亚砜中，在碱性物质作用下，加入所得的化合物a反应，过滤、蒸馏得到化合物c；
(4) 将得到的化合物c溶于甲醇中，加入二碳酸二叔丁酯反应，反应结束经萃取得到化合物d；
(5) 将化合物d溶于乙醇中，加入盐酸反应得到萘酰亚胺-氨基酸化合物e。
萘酰亚胺-氨基酸化合物的制备方法，所述步骤(1)中，有机溶剂为丙酮，反应条件为20-45℃下反应2-3 d；1,8-萘二甲酰亚胺与二溴代烷烃、十六烷基三甲基溴化铵、KI的摩尔比为1：2-5：0.25-0.5:0.1-0.3；碱性物质为K2CO3或Na2CO3，碱性物质的用量以调节溶液pH为8-10为准。
所述步骤(2)中，二碳酸二叔丁酯和氨基酸的摩尔比为1:1.5-3；反应时分别将氨基酸、二碳酸二叔丁酯溶于水、二恶烷中，-5-5℃将二碳酸二叔丁酯的二恶烷溶液加入氨基酸水溶液中，先在-5-5℃反应1 h，升温至20-45℃，在20-45℃下反应12-24 h；氨基酸为L-赖氨酸、L-精氨酸、a-氨基戊酰胺酸或a-氨基丁酰胺酸；NaHCO3与氨基酸的摩尔比为1:0.5-1。
所述步骤(3)中，化合物a和化合物b的摩尔比为3-5:5；碱性物质为K2CO3或Na2CO3，用量以调节溶液pH为8-10为准；反应时在40-60℃下反应12-24 h。
所述步骤(4)中，化合物c与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:3-6；反应时20-45 ℃反应12-24 h。
所述步骤(5)中，化合物d与盐酸的摩尔比为1:20-30；反应时将化合物d溶于乙醇中，降温至-5-5℃，加入盐酸，然后升温至20-45℃反应12-24 h。
一种由萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点，其特征在于，具有如下通式：
其中n = 1或2，x = 1或2；R为氨基酸残基。
萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点的方法：将萘酰亚胺-氨基酸化合物e溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入含量子点的氯仿溶液， pH值大于10后进行反应，经过纯化得到萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点f。
量子点为CdSe、CdSe/CdS或CdSe/ZnS，量子点的量与萘酰亚胺-氨基酸化合物的摩尔比为1:5-20；反应条件为超声条件下20-45℃反应2-8 h。
萘酰亚胺-氨基酸化合物在制备靶向性抗肿瘤药物上的应用。
萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点在制备靶向性抗肿瘤药物上的应用。
萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点的合成路线如下：
本发明是基于天然氨基酸的结构，合成了一类新的萘酰亚胺-氨基酸化合物，把氨基酸和萘酰亚胺结合在一起，可以改善萘酰亚胺类化合物的水溶性和生物性能，制成具有生物靶向性的纳米材料，实现抗肿瘤的靶向作用。
本发明还通过一种有效的方法将萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰到量子点表面，使得这些荧光量子点可以特异性地识别癌细胞，制成具有生物靶向性和特异性高的纳米材料，实现抗肿瘤的靶向作用，其标记的肿瘤细胞则可以通过多种检测方法进行检测，因此可有效降低单一检测方法中产生的假阳性结果。
本发明制备萘酰亚胺-氨基酸化合物以及修饰量子点的方法简单易行，成本较低，在一般化学实验室均可完成。
附图说明
图1是本发明中化合物e的MS谱。
图2是本发明中化合物e的1H NMR谱。
图3是本发明实施例1修饰的CdSe量子点的紫外吸收光谱。
图4是本发明实施例1修饰的CdSe量子点的荧光光谱。
图5是本发明实施例2产品f修饰的CdSe/CdS量子点的紫外吸收图谱。
图6是本发明实施例2产品f修饰的CdSe/CdS量子点的荧光图谱。
图7是本发明实施例3产品f修饰的CdSe/ZnS量子点的紫外吸收图谱。
图8是本发明实施例3产品f修饰的CdSe/ZnS量子点的荧光图谱。
实验仪器名称与型号：
德国Bruker AV-400型核磁共振仪；
美国Thremo公司Liquid Chromatography-Mass Spectrometry质谱仪；
美国Perkin-Elmer Lambda-850紫外分光光度计；
美国Perkin-Elmer Ls55荧光分光光度计。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
制备n = 2，x = 1，量子点（QDs）为CdSe时，萘酰亚胺-氨基酸化合物及其修饰的量子点的合成步骤：
1）制备化合物a：在100 mL圆底烧瓶中加入1.97 g (10 mmol) 1,8-萘二甲酰亚胺 ()，4.14 g (30 mmol) 无水K2CO3，0.249 g (1.5 mmol) KI，1.20 g (3.3 mmol) 十六烷基三甲基溴化铵和50 mL丙酮，然后以滴加6.48 g (30 mmol) 1,4二溴丁烷，20℃搅拌反应3 d，硅胶板薄层层析（TCL），抽滤弃去上层固体，减压蒸出溶剂，残留物用石油醚和乙酸乙酯经快速柱层析梯度洗脱，得到黄白色结晶a；
2）制备化合物b：以赖氨酸为例，取1.46 g (10 mmol) 赖氨酸 ()溶于5 mL水中，加入2 mL饱和NaHCO3溶液，冷却至0℃，冷却条件下慢慢加入0.88g (4 mmol) 的二碳酸二叔丁酯 ((BOC)2O)溶液，混合溶液在0℃反应1 h，然后自然升温到20℃，搅拌反应24 h；反应结束后，加入10 mL水，水相用氯仿萃取2次，取水相用饱和NaHCO3溶液调pH值至碱性，再用氯仿萃取2次，干燥旋蒸水相得到化合物b；
3）制备化合物c：取0.492 g (2 mmol) 化合物b溶于少量水中，加入二甲基亚砜 (DMSO)，再把水蒸出来，加入0.414 g (3 mmol)无水K2CO3，20℃搅拌15 min，升温到45℃，分3批加入0.754 g (1.6 mmol) 化合物a，在45℃温度下反应24 h，过滤，萃取得到化合物c；
4）制备化合物d：取0.497 g (1 mmol) 化合物c溶于100 mL甲醇溶液中，加入1.09 g (5 mmol) (BOC)2O，20℃搅拌反应24 h，减压蒸出溶剂，残余物用氯仿萃取，用水洗涤，收集有机层用无水Na2SO4干燥，减压蒸出氯仿，得到淡黄色固体d；
5）制备化合物e：取0.597 g (1 mmol) 化合物d溶于200 mL乙醇溶液中，冷却至0℃，加入6 mL 4 M盐酸的乙醇溶液，自然升温至20℃，搅拌反应24 h至有大量固体生成，蒸出溶剂，干燥，得淡黄色固体萘酰亚胺-氨基酸化合物e。
6）制备化合物f：取0.397 g (1 mmol) 化合物e溶于N,N-二甲基甲酰胺中形成20 mg/mL的溶液，然后加入4.0 mL CdSe浓度为0.016 M的氯仿溶液，混匀，然后加入少量25% (v/v)的三乙醇胺调节溶液的pH值大于10以促使化合物e与量子点表面的有机物发生交换反应，超声反应4 h；然后在反应液中加入乙酸乙酯，离心弃去上清，得到固体沉淀，并再用乙酸乙酯洗涤固体三次，得到纯净的萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点f。
如图1所示，是实施例1产品e的ESI-MS图谱，图中397.4为的峰。
如图2所示，是实施例1产品e的1H NMR图谱，实验数据如下：
C22H27N3O4，产率65.4%，淡黄色固体。1H NMR(D2O+DMSO, 400MHz)：2.70-2.83(m, 8H)，2.85-2.92(m, 8H)，3.42-3.55(m, 4H)，7.20-7.43(m, 2H)，7.70-7.93(m, 4H)，8.24(s, 1H)。
利用紫外光谱和荧光光谱对化合物e修饰的CdSe量子点进行表征，如图3所示为修饰的CdSe量子点的紫外吸收光谱，其吸收峰的位置为346 nm，如图4所示为修饰的CdSe量子点的荧光光谱。
实施例2
制备n = 2，x = 1，量子点为CdSe/CdS时，萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点的合成：
1）制备化合物a：在100 mL圆底烧瓶中加入1.97 g (10 mmol) 1,8-萘二甲酰亚胺 ()，4.14 g (30 mmol) 无水K2CO3，0.166 g (1.0 mmol) KI，0.91 g (2.5 mmol) 十六烷基三甲基溴化铵和50 mL丙酮，然后以滴加4.32g (20 mmol) 1,4二溴丁烷，30℃搅拌反应2d，硅胶板薄层层析（TCL）检测，抽滤弃去上层固体，减压蒸出溶剂，残留物用石油醚和乙酸乙酯经快速柱层析梯度洗脱，得到黄白色结晶a；
2）制备化合物b：以赖氨酸为例，取1.46 g (10 mmol) 赖氨酸 ()溶于5 mL水中，加入2 mL饱和NaHCO3溶液，冷却至5℃，冷却条件下慢慢加入1.474g (6.7mmol) 的二碳酸二叔丁酯 ((BOC)2O)溶液，混合溶液在5℃反应1 h，然后自然升温到30℃，搅拌反应20 h；反应结束后，加入10 mL水，水相用乙醚萃取3次，取水相用饱和NaHCO3溶液调pH值至碱性，再用乙醚萃取3次，干燥旋蒸水相得到化合物b；
3）制备化合物c：取0.492 g (2 mmol) 化合物b溶于少量水中，加入二甲基亚砜 (DMSO)，再把水蒸出来，加入0.414 g (3 mmol)无水K2CO3，30℃搅拌15 min，升温到45℃，分3批加入0.566 g (1.2 mmol) 化合物a，在45℃温度下反应20 h，过滤，萃取得到化合物c；
4）制备化合物d：取0.497 g (1 mmol) 化合物c溶于100 mL甲醇溶液中，加入0.654g (3 mmol) (BOC)2O，30℃搅拌反应20 h，减压蒸出溶剂，残余物用氯仿萃取，用水洗涤，收集有机层用无水Na2SO4干燥，减压蒸出氯仿，得到淡黄色固体d；
5）制备化合物e：取0.597 g (1 mmol) 化合物d溶于200 mL乙醇溶液中，冷却至5℃，加入6 mL 3.3 M盐酸的乙醇溶液，自然升温至30℃，搅拌反应20 h至有大量固体生成，蒸出溶剂，干燥，得淡黄色固体萘酰亚胺-氨基酸化合物e。
6）制备化合物f：取0.397 g (1 mmol) 化合物e溶于N,N-二甲基甲酰胺中形成20 mg/mL的溶液，然后加入6.0 mL CdSe/CdS浓度为0.016 M的氯仿溶液，混匀，然后加入少量25% (v/v)的三乙醇胺调节溶液的pH值大于10以促使化合物e与量子点表面的有机物发生交换反应，超声反应4 h；然后在反应液中加入乙酸乙酯，离心弃去上清，得到固体沉淀，并再用乙酸乙酯洗涤固体三次，得到纯净的萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点f。
如图5所示，是实施例2产品f修饰的CdSe/CdS量子点的紫外吸收图谱。
如图6所示，是实施例2产品f修饰的CdSe/CdS量子点的荧光图谱。
实施例3
制备n = 2，x = 1，量子点为CdSe/ZnS时，萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点的合成：
1）制备化合物a：在100 mL圆底烧瓶中加入1.97 g (10 mmol) 1,8-萘二甲酰亚胺 ()，4.14 g (30 mmol) 无水K2CO3，0.498 g (3mmol) KI，1.82 g (5 mmol) 十六烷基三甲基溴化铵和50 mL丙酮，然后以滴加10.8 g (50 mmol) 1,4二溴丁烷，45℃搅拌反应3 d，硅胶板薄层层析(TCL)检测，抽滤弃去上层固体，减压蒸出溶剂，残留物用石油醚和乙酸乙酯经快速柱层析梯度洗脱，得到黄白色结晶a；
2）制备化合物b：以赖氨酸为例，取1.46 g (10 mmol) 赖氨酸 ()溶于5 mL水中，加入2 mL饱和NaHCO3溶液，冷却至-5℃，冷却条件下慢慢加入0.733 g (3.3 mmol) 的二碳酸二叔丁酯 ((BOC)2O)溶液，混合溶液在-5℃反应1 h，然后自然升温到45℃，搅拌反应12 h；反应结束后，加入10 mL水，水相用氯仿萃取3次，取水相用饱和NaHCO3溶液调pH值至碱性，再用氯仿萃取3次，干燥旋蒸水相得到化合物b；
3）制备化合物c：取0.492 g (2 mmol) 化合物b溶于少量水中，加入二甲基亚砜 (DMSO)，再把水蒸出来，加入0.414 g (3 mmol)无水K2CO3，45℃搅拌15 min，升温到45℃，分3批加入0.94g (2 mmol) 化合物a，在45℃温度下反应12 h，过滤，萃取得到化合物c；
4）制备化合物d：取0.497 g (1 mmol) 化合物c溶于100 mL甲醇溶液中，加入1.308g (6 mmol) (BOC)2O，45℃搅拌反应12 h，减压蒸出溶剂，残余物用氯仿萃取，用水洗涤，收集有机层用无水Na2SO4干燥，减压蒸出氯仿，得到淡黄色固体d；
5）制备化合物e：取0.597 g (1 mmol) 化合物d溶于200 mL乙醇溶液中，冷却至-5℃，加入6 mL 5 M盐酸的乙醇溶液，自然升温至45℃，搅拌反应12 h至有大量固体生成，蒸出溶剂，干燥，得淡黄色固体萘酰亚胺-氨基酸化合物e。
6）制备化合物f：取0.397 g (1 mmol) 化合物e溶于N,N-二甲基甲酰胺中形成20 mg/mL的溶液，然后加入12.0 mLCdSe/ZnS浓度为0.016 M的氯仿溶液，混匀，然后加入少量25% (v/v）的三乙醇胺调节溶液的pH值大于10以促使化合物e与量子点表面的有机物发生交换反应，超声反应4 h；然后在反应液中加入乙酸乙酯，离心弃去上清，得到固体沉淀，并再用乙酸乙酯洗涤固体三次，得到纯净的萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点f。
如图7所示，是实施例3产品f修饰的CdSe/ZnS量子点的紫外吸收图谱。
如图8所示，是实施例3产品f修饰的CdSe/ZnS量子点的荧光图谱。
活性实验：
细胞培养：HepG2 (肝癌细胞)，QGY-7701 (人胚肝细胞) 和K562 (人白血病细胞) 细胞用含10% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 的1640培养基于培养瓶中培养，其中含有1% (v/v) 的双抗 (每毫升100 单位青霉素和100 mg链霉素)。含有细胞的培养瓶置于37℃，含5% CO2且湿度为90%的培养箱中孵育。
细胞毒性测试：实施例1-3萘酰亚胺-氨基酸化合物及其所修饰的量子点在HepG2，QGY-7701和K562细胞中的细胞毒性采用MTT法测定，细胞培养传代3、4次后，当细胞生长到对数期时，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行活细胞计数，调整活细胞浓度为5 ′ 104/mL接种于96孔培养板中，每孔100 mL，于37℃，含5% CO2且湿度为90%的培养箱中培养24 h后，吸出旧培养基，再分别加入用培养基稀释的不同浓度（1-50 mM）的萘酰亚胺-氨基酸化合物及其所修饰的量子点。加入样品的96孔板置于37℃，含5% CO2的培养箱中孵育48 h，然后加入MTT 20 mL/孔 (2.5 mg/mL)，4 h后弃上清液，加入DMSO 100 mL/孔，振荡5 min左右，用M200酶标仪测定OD值，波长设置为570 nm和690 nm双波长。没有加入样品的孔的细胞存活率作为对照，设为100%，计算细胞存活率，同时作图并求得半数杀伤浓度 (IC50)，评价样品的细胞毒性，结果见表1。
表1 萘酰亚胺-氨基酸化合物及其所修饰的量子点的细胞毒性
表1中测试了实施例1-3萘酰亚胺-氨基酸化合物及其所修饰的量子点对HepG2、K562和QGY-7701细胞的体外生长抑制活性，IC50值为能使正常分裂生长的细胞数抑制到50%水平时候样品的浓度值(mM)，IC50值越小表明样品的细胞毒性越强。实验结果表明，文献报道的安奈菲特具有抗肿瘤作用，但是体外活性较弱，本发明萘酰亚胺-氨基酸化合物及其所修饰的量子点则具有较强的抗肿瘤活性，在肿瘤细胞上的表达效率提高，且肿瘤靶向性的作用比较明显，表现在对正常细胞的细胞毒性比较低。
综上，本发明中的萘酰亚胺-氨基酸化合物及其所修饰的量子点可以作为作为靶向性抗肿瘤药物使用，同时萘酰亚胺-氨基酸化合物修饰的量子点还可以达到标记肿瘤细胞的作用。