技术领域
本发明属于微生物合成生物学、基因组工程和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及染色体融合改造的酵母工程菌株。
背景技术
酿酒酵母是单细胞真核生物，是第一个被测序的真核模式生物，其基因组大小为12Mb，含有16条线型染色体。酿酒酵母很早就被用于酒精酿造和食品发酵，在遗传、分子生物学及生理方面等多方面的研究都表明酿酒酵母野生型菌株对人类是安全的。酿酒酵母由于易于培养，遗传背景清晰，且遗传操作相对简单，此外具有真核生物的蛋白翻译后加工和修饰系统，因此成为常用的异源的高等生物基因表达的宿主菌，在工业、医药和能源等方面有重要应用。近年来，随着合成生物学技术的快速发展，已实现以酿酒酵母为人工细胞工厂来发酵生产如青蒿素、紫杉醇和人参皂苷等植物来源的天然产物药物的前体物质，极大提高了这些珍稀药物的产量。
目前，本领域已经利用酿酒酵母染色体的自主复制区、中心粒及端粒发展了可以克隆高等生物复杂基因组超大片段DNA的酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome，YAC)。YAC载体在酿酒酵母中可以容纳300kb～1Mb的超大异源DNA。从植物到小鼠乃至人的基因组都已构建了相应的YAC文库。在酿酒酵母中构建的各类YAC文库极大方便了高等生物复杂基因组的功能研究及疾病基因的定位。
然而，作为异源基因和表达大片段克隆宿主，酿酒酵母天然存在的16条线型染色体，其大小范围在230kb到1500kb，将导致携带大片段DNA(>200kb)的线型表达或克隆质粒难以与天然的线型染色体分离。此外，酿酒酵母染色体的端粒附近存在多处重复序列，容易同源重组进而影响其作为异源基因表达宿主或超大片段DNA的克隆宿主的稳定性。比如，携带高等生物复杂基因组DNA的各类YAC克隆文库在酿酒酵母中容易产生重组删减或嵌合克隆。酿酒酵母的这些缺陷限制了其作为异源基因表达和大片段DNA克隆宿主的应用。因此，本领域有必要构建新的基因组简约化且遗传稳定的酿酒酵母宿主菌。
发明内容
本发明的目的在于提供染色体融合、基因组简约化且遗传稳定的酿酒酵母工程菌株。
在本发明的第一方面，提供染色体融合的酵母工程菌株，所述工程菌株中两条或两条以上的染色体发生融合，具有1～15个中心粒，0～30个端粒区；并且，该工程菌株的近端粒处的多拷贝重复序列被删减为单拷贝序列。
在一个优选例中，所述的多拷贝重复序列是大于2kb的序列，例如2～30kb；更特别地2.7-26.2kb。
在另一优选例中，所述的重复序列选自：
重复序列组1：染色体VIII:525437-539926；I:13089-27923；I:203448-219229；
重复序列组2：染色体I:219230-229411；VIII:539927-543610,549638-556001；
重复序列组7：染色体XIII:917474-923540；XV:1078061-1083736；XVI:7409-13083；
重复序列组9：染色体XV:10454-13126；IX:8286-10347；X:8269-10330；
重复序列组10：染色体XV:22397-27006；IX:16656-25250；X:16639-21229；
重复序列组3：染色体VII:1076381-1083886；II:805133-812631；
重复序列组4：染色体XIV:7429-17224；VI:5531-14039；
重复序列组5：染色体XI:658572-665429；III:4327-11225；
重复序列组6：染色体VII:5545-9584；IX:430983-434367；
重复序列组8：染色体XV:1073988-1078544；XVI:12601-17099；
重复序列组11：染色体V:18067-23447；XIV:772693-777126；
重复序列组12：染色体IV:905-18681；X:727164-744901；
重复序列组13：染色体XII:1059296-1064280；III:303903-308316；
重复序列组14：染色体IX:21251-25254；XV:27007-30676；和/或
重复序列组15：染色体IX:10348-16655；X:10331-16638。
在另一优选例中，所述的重复序列中，进行如下删减：
重复序列组1：保留I:13089-27923，删除其它2条；
重复序列组2：保留VIII:539927-543610、549638-556001，删除另1条；
重复序列组7：保留XVI:7409-13083，删除其它2条；
重复序列组9：保留IX:8286-10347，删除其它2条；
重复序列组10：保留IX:16656-25250，删除其它2条；
重复序列组3：保留805133-812631，删除另1条；
重复序列组4：保留VI:5531-14039，删除另1条；
重复序列组5：保留III:4327-11225，删除另1条；
重复序列组6：保留IX:430983-434367，删除另1条；
重复序列组8：保留XVI:12601-17099，删除另1条；
重复序列组11：保留XIV:772693-777126，删除另1条；
重复序列组12：保留X:727164-744901，删除另1条；
重复序列组13：保留III:303903-308316，删除另1条；
重复序列组14：保留IX:21251-25254，删除另1条；和/或
重复序列组15：保留IX:10348-16655，删除另1条。
在另一优选例中，所述的工程菌株选自：
SY15，其在SY14的基础上，删除了染色体XVI的左端粒，X的右端粒；
SY14，其在SY13的基础上，删除了染色体IV的中心粒，XI的右端粒及重复序列5，I的左端粒；
SY13，其在SY12的基础上，删除了染色体XIV的右端粒，XVI的中心粒，XIII的左端粒；
SY12，其在SY11的基础上，删除了染色体IV的右端粒，VII的左端粒及中心粒；
SY11，其在SY10的基础上，删除了染色体XII的中心粒、右端粒及重复序列13，XV的左端粒；
SY10，其在SY9的基础上，删除了染色体I的中心粒，II的右端粒，III的左端粒；
SY9，其在SY8的基础上，删除了染色体VIII的右端粒，IX的左端粒，X的中心粒；
SY8，其在SY7的基础上，删除了染色体XV的右端粒及重复序列8和7，XI的中心粒及左端粒；
SY7，其在SY6的基础上，删除了染色体V的右端粒，VI的左端粒，XIV的中心粒；
SY6，其在SY5的基础上，删除了染色体III的右端粒及中心粒，IV的左端粒及重复序列12；
SY5，其在SY4的基础上，删除了染色体IX的右端粒及中心粒，X的左端粒及重复序列9、10、15；
SY4，其在SY3的基础上，删除了染色体XVI的右端粒，V的左端粒及中心粒；
SY3，其在SY2的基础上，删除了染色体VI的右端粒及中心粒，XIV的左端粒及重复序列4；
SY2，其在SY1的基础上，删除了染色体I的右端粒及重复序列1和2，染色体II的左端粒及中心粒；
SY1，其在SY0的基础上，删除了染色体XIII的右端粒及重复序列7、中心粒，XII的左端粒；
SY0，其在天然酿酒酵母的基础上，删除了染色体V中重复序列11，VII右端粒及重复序列6和3，VIII中左端粒、中心粒及重复序列1，XV中重复序列9、10和14。
在另一优选例中，所述的工程菌株是SY15菌株，该菌株中融合的染色体两端的端粒被删除，环化。
在本发明的另一方面，提供一种融合的染色体，该染色体分离自所述的酵母工程菌株
在本发明的另一方面，提供一种制备染色体融合的酵母工程菌株的方法，所述方法包括：
(1)在天然酿酒酵母基础上，将染色体VII和VIII融合；并删除染色体V中重复序列11，VII右端粒及重复序列6和3，VIII中左端粒、中心粒及重复序列1，XV中重复序列9、10和14；获得SY0菌株；
(2)在SY0基础上，将染色体XIII和XII融合；并删除染色体XIII的右端粒及重复序列7、中心粒，XII的左端粒；获得SY1菌株；
(3)在SY1基础上，将染色体I和II融合；并删除染色体I的右端粒及重复序列1和2，染色体II的左端粒及中心粒；获得SY2菌株；
(4)在SY2基础上，将染色体VI和XIV融合；并删除染色体VI的右端粒及中心粒，XIV的左端粒及重复序列4；获得SY3菌株；
(5)在SY3基础上，将染色体XVI和V融合；并删除染色体XVI的右端粒，V的左端粒及中心粒；获得SY4菌株；
(6)在SY4基础上，将染色体IX和X融合；并删除染色体IX的右端粒及中心粒，X的左端粒及重复序列9、10、15；获得SY5菌株；
(7)在SY5基础上，将染色体III和IV融合；并删除染色体III的右端粒及中心粒，IV的左端粒及重复序列12；获得SY6菌株；
(8)在SY6基础上，将前面已经融合的染色体XVI-V和VI-XIV融合；并删除染色体V的右端粒，VI的左端粒，XIV的中心粒；获得SY7菌株；
(9)在SY7基础上，将XV和XI融合；并删除染色体XV的右端粒及重复序列8和7，XI的中心粒及左端粒；获得SY8菌株；
(10)在SY8基础上，将前面已经融合的染色体VII-VIII和IX-X融合；并删除染色体VIII的右端粒，IX的左端粒，X的中心粒；获得SY9菌株；
(11)在SY9基础上，将前面已经融合的染色体I-II和III-IV融合；并删除染色体I的中心粒，II的右端粒，III的左端粒；获得SY10菌株；
(12)在SY10基础上，将前面已经融合的染色体XIII-XII和XV-XI融合；并删除染色体XII的中心粒、右端粒及重复序列13，XV的左端粒；获得SY11菌株；
(13)在SY11基础上，将前面已经融合的染色体I-II-III-IV和VII-VIII-IX-X融合；并删除染色体IV的右端粒，VII的左端粒及中心粒；获得SY12菌株；
(14)在SY12基础上，将前面已经融合的染色体XVI-V-VI-XIV和XIII-XII-XV-XI融合；并删除染色体XIV的右端粒，XVI的中心粒，XIII的左端粒；获得SY13菌株；
(15)在SY13基础上，将前面已经融合的染色体XVI-V-VI-XIV-XIII-XII-XV-XI和I-II-III-IV-VII-VIII-IX-X融合；并删除染色体IV的中心粒，XI的右端粒及重复序列5，I的左端粒；获得SY14菌株；
(16)在SY14的基础上，删除染色体XVI的左端粒，X的右端粒；获得SY15菌株。
在另一优选例中，采用CRISPR/Cas9方法对染色体进行编辑，删除目标序列。
在另一优选例中，采用CRISPR/Cas9方法时，sgRNA在基因组上的靶位点选自：
步骤(1)中染色体VII和VIII融合时，靶向于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的位点；
步骤(2)中染色体XIII和XII融合时，靶向于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的位点；
步骤(3)中染色体I和II融合时，靶向于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的位点；
步骤(4)中染色体VI和XIV融合时，靶向于SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的位点；
步骤(5)中染色体XVI和V融合时，靶向于SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的位点；
步骤(6)中染色体IX和X融合时，靶向于SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的位点；
步骤(7)中染色体III和IV融合时，靶向于SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的位点；
步骤(8)中染色体XVI-V和VI-XIV融合时，靶向于SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的位点；
步骤(9)中染色体XV和XI融合时，靶向于SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的位点；
步骤(10)中染色体VII-VIII和IX-X融合时，靶向于SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的位点；
步骤(11)中染色体I-II和III-IV融合时，靶向于SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的位点；
步骤(12)中染色体XIII-XII和XV-XI融合时，靶向于SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的位点；
步骤(13)中染色体I-II-III-IV和VII-VIII-IX-X融合时，靶向于SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的位点；
步骤(14)中染色体XVI-V-VI-XIV和XIII-XII-XV-XI融合时，靶向于SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的位点；
步骤(15)中染色体XVI-V-VI-XIV-XIII-XII-XV-XI和I-II-III-IV-VII-VIII-IX-X融合时，靶向于SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的位点；或
步骤(16)中，靶向于SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47所示的位点。
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其中含有前面任一所述的染色体融合的酵母工程菌株。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有SY0～SY15的染色体融合的酵母工程菌株。
在本发明的另一方面，提供所述的酵母工程菌株或所述的染色体的用途，用于作为真核异源基因表达和大片段核酸的克隆宿主。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于表达真核异源基因，或用于克隆大片段核酸。
在本发明的另一方面，提供一种用于建立染色体融合酵母工程菌株的试剂盒，其中含有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:47所述的部分或全部的染色体融合的酵母工程菌株。所述的部分是指按照所需融合的染色体种类而选择的序列的套组，例如染色体VII与VIII融合时，所述的部分是指SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3小序列，其它的情形可以根据表3中相应的分类确定。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、酿酒酵母染色体融合的一系列工程菌株的构建。
图2、脉冲电泳验证染色体融合的酿酒酵母工程菌株SY0-SY10的基因组。
图3、脉冲电泳验证染色体融合的酿酒酵母工程菌株SY11-SY15的基因组。
图4、菌株SY14的1条大的线性染色体(左)与16条酿酒酵母染色体参考基因组(右)的共线性圈图。
图5、染色体融合的酿酒酵母工程菌株的SY11-13(A)及SY14，SY15(B)的生长曲线。
图6、脉冲场凝胶电泳检测生长0代和100代的SY14和SY15基因组的酶切图谱。
图7、利用CRISPR/Cas9系统在酵母中高效融合染色体的方法，该方法的原理及流程示意图。
图8、Cas9表达载体的质粒图谱。
图9、sgRNA表达载体的质粒图谱。
具体实施方式
本发明人通过大量的构建、鉴定和测试，经过设计优化，将酵母的16条天然染色体进行相互的人工融合，获得发生染色体融合的一系列菌株，包括16条融合为1条的线型或环型染色体。
术语
本发明中，所述的“核酸”可以指DNA或RNA。本文所用的术语“核酸序列”可以指DNA或RNA的序列。核酸序列可为环形。DNA包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码区序列可以是特定的编码序列的简并变异体。此处所用的“简并变异体”指与参比核酸编码相同氨基酸序列、但核酸序列不同于参比核酸的核酸变异体。
本发明中，所述的“载体”和“表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。这些载体能够在宿主体内复制和稳定。这些载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本发明中，所述的“着丝粒敲除组件”是指含有一系列元件的核酸，其用于在进行染色体融合时，敲除多余的着丝粒，使得融合后的染色体仅含有一个着丝粒。所述的“着丝粒敲除组件”含有待敲除着丝粒的两侧同源序列(同源臂)和筛选标记。所述的“着丝粒敲除组件”还含有必要的“调控元件”，从而可以被引入细胞内以及在细胞内复制、表达。
本发明中，所述的“染色体融合组件”是指含有一系列元件的核酸，其用于待融合的染色体在合适的部位(通常位于端粒区)被识别和切割后，使得待融合的染色体发生融合；所述的“染色体融合组件”含有待融合的染色体的近端粒区的同源序列和筛选标记。所述的“染色体融合组件”还含有必要的“调控元件”，从而可以被引入细胞内以及在细胞内复制、表达。
本发明中，所述的“sgRNA靶向切割组件”是指用于在细胞内生成靶向特定位点的sgRNA的核酸，其产生的sgRNA能在着丝粒两个同源序列间和近端粒区的两个同源序列处进行切割，配合“着丝粒敲除组件”、“染色体融合组件”实现染色体的融合。所述的“sgRNA靶向切割组件”还含有必要的“调控元件”，从而可以被引入细胞内以及在细胞内复制、表达。
本发明中，所述的“调控元件”可包括启动子、增强子、响应元件、信号肽、内部核糖体进入序列、聚腺苷酸信号、终止子、或调控核酸表达(如转录或翻译)的可诱导元件。
本文所用术语“基因组”指包含在一个生物体的DNA(部分病毒是RNA)中的全部遗传信息。基因组包括基因和非编码DNA。一般地，一个生物体的基因组是指一套染色体中的完整的DNA序列。例如，生物个体体细胞中的二倍体由两套染色体组成，其中一套DNA序列就是一个基因组。基因组一词可特指核DNA(例如，核基因组)，也可用于包含自身DNA序列的细胞器基因组，如粒线体基因组或叶绿体基因组。
本文所述“敲除”或“删除”指将目标基因从基因组中删除的技术。
融合方法
本发明人深入研究酵母染色体，根据酵母的16条染色体上的基因分布特点、序列重复性特点、着丝点位置、端粒区特点等等因素，在此基础上进行综合考虑，设计了本发明的融合方法以及融合菌株。
在构建菌株的过程中，本发明人采用逐步融合的方法，同时确定了一些大片段的重复序列，在融合过程中对于多拷贝的重复序列进行适当地删减，从而在确保构建成功、预期功能不受损的情况下，尽可能地缩减融合后的染色体的长度，使得融合染色体尽可能地简化。
作为本发明的优选方式，所述方法包括：(1)将染色体VII和VIII融合；(2)将染色体XIII和XII融合；(3)将染色体I和II融合；(4)将染色体VI和XIV融合；(5)将染色体XVI和V融合；(6)将染色体IX和X融合；(7)将染色体III和IV融合；(8)将前面已经融合的染色体XVI-V和VI-XIV融合；(9)将XV和XI融合；(10)将前面已经融合的染色体VII-VIII和IX-X融合；(11)将前面已经融合的染色体I-II和III-IV融合；(12)将前面已经融合的染色体XIII-XII和XV-XI融合；(13)将前面已经融合的染色体I-II-III-IV和VII-VIII-IX-X融合；(14)将前面已经融合的染色体XVI-V-VI-XIV和XIII-XII-XV-XI融合；(15)将前面已经融合的染色体XVI-V-VI-XIV-XIII-XII-XV-XI和I-II-III-IV-VII-VIII-IX-X融合；(16)删除染色体XVI的左端粒，X的右端粒。以上每一步骤，获得在前一步获得的菌株的基础上，进一步发生染色体融合的菌株，逐步递进。
本发明中，优选地，利用CRISPR/Cas9系统在酵母中高效融合染色体的方法，该方法的原理及流程示意图如图7(以染色体Chr.VII和Chr.VIII为例)。通过酵母原生质体转化技术，将含有着丝粒两侧同源序列和筛选标记的组件、参与融合的染色体两个近端粒区的同源序列和筛选标记的组件以及能在着丝粒两个同源序列间和近端粒区的两个同源序列处发生切割的sgRNA质粒一次转化到酵母细胞内。染色体在着丝粒和端粒附近被切割后，含有染色体上同源序列的着丝粒敲除组件和染色体融合组件通过酵母体内的同源重组整合到染色体上，通过sgRNA载体，Cas9载体和着丝粒组件、染色体融合组件上的标记筛选出需要的转化子。
更具体地，如图7，本发明的将染色体A(如Chr.VII)和染色体B(如Chr.VIII)进行融合的方法包括：将着丝粒敲除组件(如图中标记有DR1和ura的组件)、染色体融合组件(如图中标记有DR2和ura的组件)、sgRNA靶向切割组件(如图中pCas9)、Cas9表达组件引入到酵母中，从而获得染色体A和染色体B发生融合的酵母。
所述着丝粒敲除组件用于敲除两条染色体之一的着丝粒，其含有该着丝粒(图7中以Chr.VII的着丝粒为例)两侧同源序列和筛选标记。当靶向性的sgRNA(S1)在着丝粒的一侧进行切割后，所述的着丝粒敲除组件通过同源交换，整合到染色体上。为了筛选发生交换的细胞，通常需要在着丝粒敲除组件中加上筛选标记(如ura)。根据需要，所述的筛选标记可以是抗性基因，或者也可以是一段易于被识别的核酸片段。作为本发明的优选方式，在着丝粒敲除组件中，设置一段正向重复序列(如DR1)，其设置于该组件中所述同源序列与筛选标记之间；序列为染色体上紧挨该着丝粒一侧同源序列的序列，设置该正向重复序列，有利于将来在该区段进行进一步重组操作以消除筛选标记，获得无痕融合的染色体。
所述染色体融合组件针对两条染色体待融合的端粒区，含有染色体A(如Chr.VII)近端粒区的同源序列、染色体B(如Chr.VIII)近端粒区的同源序列和筛选标记。当靶向性的sgRNA在两条染色体待融合的端粒区分别进行切割后，所述的染色体融合组件通过同源交换，整合到染色体，将两条染色体连接在一起。为了筛选发生染色体融合的细胞，通常需要在着丝粒敲除组件中加上筛选标记(如ura)。作为本发明的优选方式，所述染色体融合组件中，设置一段正向重复序列(如DR2)，设置于该组件中所述同源序列与筛选标记之间；其序列为紧挨着其中一条染色体近端粒区同源序列的序列。
所述sgRNA靶向切割组件含有能在着丝粒两个同源序列间和近端粒区的两个同源序列处进行切割的sgRNA。在实际操作中，可将一次将多个sgRNA串联在一个质粒中进行表达，以简化操作。
与常规的方法相比较，本发明在融合两条染色体时，省去了先引入失活着丝粒组件再转入染色体融合组件同时诱导着丝粒失活等繁琐操作，比传统方法更快速、高效。并且该方法还可以一次融合三条染色体、一次融合两组两条染色体。与传统方法相比，不仅仅操作步骤更加简便、大大缩短了实验时间，还可一次融合更多数目的染色体，极为显著地提高了染色体融合的效率。
染色体融合的菌株
本发明提供了染色体融合的酵母工程菌株，其特征在于，所述工程菌株中两条或两条以上的染色体发生融合，具有1～15个中心粒，0～30个端粒区；并且，该工程菌株的近端粒处大的重复序列被删减为单拷贝。作为本发明的优选方式，根据表1中所列的重复序列的信息，每组重复序列保留1个拷贝，从而获得简化的、染色体融合的活性菌株。
在本发明的具体实施例中，以酿酒酵母为出发菌株，在染色体融合过程中，酵母染色体的天然的中心粒由16个逐渐删减至1个，天然的端粒区由32个逐渐删减2个(SY0～SY14)。在此基础上进一步去除2个端粒变成含有一条人工环化的染色体的菌株SY15。在人工融合过程中同时删减了天然染色体近端粒处16处大的重复序列(2.7～26.2kb)。
本发明构建的一系列工程菌株具有简约化且遗传稳定的基因组，并且生长良好，因此其是新的真核异源基因表达和大片段DNA克隆宿主，在工业、医药和能源等方面有重要应用。
本发明构建的工程菌株，由于简化了染色体，使得在克隆鉴定方面比天然菌株具有显著的优势。例如，当将外源片段克隆入所述工程菌株的时候，重组克隆事件更易于被分辨出来。
本发明还提供了一种试剂盒，其中含有本发明所述的染色体融合的酵母工程菌株，可以是选自本发明的菌株的一种或几种或全部。优选地，其中含有SY0～SY15的染色体融合的酵母工程菌株。
通常，所述的是试剂盒中还包括使用说明书，指导本领域技术人员正确地使用本发明的含有染色体融合的酵母工程菌株的试剂盒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
Cas9表达载体的构建
Cas9表达载体的质粒图谱见图8。构建在大肠杆菌中为高拷贝复制(复制起始位点来源于pBR322，筛选标记为氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因)、在酵母中单拷贝复制(载体复制区来源于CEN6ARS4，筛选标记LEU2)且能组成型表达Cas9的质粒。PCR扩增LEU2标记(以酿酒酵母S.cerevisiae S288c基因组为模板)，通过正反向引物的5’端带上质粒pMetcas9上筛选标记MET14(Zhou,J.,et al.,Nucleic Acids Res,2016.44(14):p.e124)两侧50bp的同源序列，PCR产物纯化后和pMetcas9一起转入酵母，在亮氨酸单缺培养基上筛选，经PCR及测序验证正确后转化大肠杆菌DH10B，抽取质粒备用。
sgRNA表达载体构建
sgRNA表达载体的质粒图谱见图9。构建在大肠杆菌中为高拷贝复制(复制起始位点来源于pBR322，筛选标记为氨苄青霉素抗性基因)、在酵母中多拷贝复制(载体复制区来源于2μm，筛选标记HIS3)且能组成型表达sgRNA的质粒。sgRNA包括SNR52启动子、handle Cas9序列、20bp切割位点。
ChrVII和ChrVIII融合需要S1，2，3(即SEQ ID NO:1～3)三个切割位点，分别位于ChrVII的着丝粒、右端粒和ChrVIII的左端粒附近。
着丝粒敲除组件的构建
以BY4742基因组为模板选取着丝粒左右两侧50bp序列作为敲除组件的左右同源臂，着丝粒一侧200bp序列作为打靶组件上的正向重复序列(以便日后该序列处发生重组消除筛选标记，获得无痕融合的染色体)。以S288C基因组为模板PCR URA3基因作为筛选标记。将50bp同源臂序列带在引物上，分别PCR正向重复序列和筛选标记，经融合PCR获得着丝粒敲除组件。
染色体融合组件的构建
以BY4742基因组为模板PCR一条染色体右端粒左侧、另一条染色体左端粒右侧的400bp序列作为染色体融合组件的同源臂，PCR一个端粒附近200bp序列作为融合组件上的正向重复序列(以便日后在该序列处发生重组消除筛选标记，获得无痕融合的染色体)。以S288C基因组为模板PCR LYS2基因作为筛选标记。四个片段间通过引物带上40bp同源序列，经融合PCR获得染色体融合组件。
酿酒酵母染色体融合
1.待融合的菌株从-70℃取出，划SC-leu(pleuCas9营养缺陷型标记)固体培养基，30℃培养2天长出单克隆；
2.挑单克隆接于4mL SC-leu液体培养基中，30℃培养过夜；
3.过夜菌液转接至25mL SC-leu液体培养基中，起始ODλ＝600nm＝0.2，30℃，220rpm培养至终ODλ＝600nm＝0.8-1.0；
4. 20℃，5,000rpm离心5min收菌；
5.弃上清，加入20mL无菌ddH2O重悬，20℃，5,000rpm离心5min收菌，重复一次；
6.用500μL无菌ddH2O重悬，分装5管备用；
7.将备用的酵母菌13,000g离心30秒，弃上清。依次加入(可先准备除DNA片段外的mixture，再分别加DNA片段)：
注：DNA片段:1μg融合组件(URA3)，1μg着丝粒敲除组件(URA3)，1μg gRNA-p426(HIS3)；正对照：环形的酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXX11(URA3)；负对照：只加ddH2O 34μL。
8.用上述混合液重悬酵母菌；
9. 42℃热击25分钟；
10. 13,000g离心1分钟去上清，用1mLddH2O重悬酵母菌，分别取200μL和800μL涂SC-Ura-His-Leu三缺板；
11. 30℃培养2-3天。
12.长出转化子后进行多重PCR验证；
13.PCR验证正确的菌株在SC-Ura-His-Leu三缺板上划小方块(纯化和扩大培养)，30℃培养过夜；
14.挑方块菌接到2mL半乳糖诱导培养基SC-Leu+Gal+Raff中，起始OD约0.3，30℃培养过夜(12-16小时)；
15.诱导过夜的菌液取100μL涂布含1mg/mL 5-FOA的SC-leu板，30℃培养2-3天；
16.长出的转化子按顺序在SC-His，SC-Ura，SC-leu单缺板上划小方块进行初筛确认URA3标记、gRNA-p426载体丢失；
17.再次PCR确认标记URA3删除情况；
18.将PCR正确的SC-leu上的方块菌接SC-leu，30℃过夜培养，准备次日转接，进行下一组染色体融合。
脉冲场凝胶电泳
1.从新划的酵母菌平板上挑取单克隆接YPAD培养基，30℃，240rpm过夜培养；
2.把试管内过夜培养的酵母菌转接到50mL YPAD培养基中，起始ODλ＝600nm＝0.1；
3. 30℃，240rpm培养至ODλ＝600nm＝1.0时20℃，5,000rpm收菌；
4. 50mL ddH2O重悬酵母菌，20℃，5,000rpm收菌；
5. 10mL pH8.0，10mM EDTA重悬酵母菌，20℃，5,000rpm收菌；
6. 750μL pH7.2，10mM的Tris.HCl重悬，转到1.5mL EP管中，20℃，5,000rpm收菌；
7. 150μL pH7.2，10mM的Tris.HCl重悬，放到50℃水浴锅中平衡；
8.加入150mL Zymolyse-20T溶液(20mg/mL zymolyse-20T，50％甘油，2.5％葡萄糖，50mM pH8.0Tris.HCl)和225μL 2％的TE25S溶解的低熔点琼脂糖(事先配好，在50℃水浴锅中平衡)，混匀后倒入模具，冰箱4℃冷却；
9. 30min后取出胶块，加入5mL lyticase buffer(pH7.5，10mM的Tris.HCl和pH8.0，50mM EDTA)和500μL Zymolyse-20T，37℃孵育3小时；
10. 25mLddH2O洗一次胶块，然后用wash buffer(pH7.5，20mM的Tris.HCl和pH8.0，50mM EDTA)洗涤一次；
11.每1mL胶块加入5mL蛋白酶反应液(pH8.0，100mM EDTA，0.2％sodium deoxycholate,1％sodium laurylsarcosine，1mg/mL的蛋白酶K)50℃消化36小时；
12. 50mL wash buffer洗涤胶块4次，于室温下轻柔震荡，每次30-60分钟。
13. SY0-SY10系列菌株的染色体使用Bio-Rad CHEFDRII仪器，用1％的琼脂糖凝胶在0.5*TBE缓冲液中12.5℃条件下进行分离。转换角度设置为120°，电压设置为6V/cm，先60s转换时间电泳22小时，再90s转换时间电泳12小时。
14.SY11-SY115系列菌株的染色体使用Bio-Rad CHEFDRII仪器，用0.8％的琼脂糖凝胶在1*TAE缓冲液中6℃条件下进行分离。转换角度设置为106°.，电压设置为1.5V/cm，转换时间1800s电泳27小时，再将转换角度设置为100°.，电压设置为2V/cm，转换时间1500s电泳27小时，转换角度设置为96°.，电压设置为2.5V/cm，转换时间1200s电泳27小时。
生长曲线测定
1.从-70℃冰箱划冻存菌株于SC-leu平板上，30℃培养箱中培养2-3天；
2.挑取单克隆接到含YPAD液体培养基的试管中30℃培养过夜，转速240rpm；
3.转接过夜培养的菌液到50ml YPAD培养基中至起始ODλ＝600nm＝0.1，每个样品转接三瓶，30℃，240rpm培养；
4.间隔两小时取样在分光光度计上测定ODλ＝600nm，选用YPAD培养基作为参比，4小时后每隔1小时取样测定ODλ＝600nm；
5.待连续两次测定ODλ＝600nm值不再变动后再测定一次过夜ODλ＝600nm，停止测定；
6.用记录的数据绘制菌株生长曲线图表；
酿酒酵母染色体酶切验证
1.从新划的酵母菌平板上挑取单克隆接YPAD培养基，30℃，240rpm过夜培养；
2.把试管内过夜培养的酵母菌转接到50mL YPAD培养基中，起始ODλ＝600nm＝0.1；
3. 30℃，240rpm培养至ODλ＝600nm＝1.0时20℃，5,000rpm收菌；
4. 50mL ddH2O重悬酵母菌，20℃，5,000rpm收菌；
5. 10mL pH8.0，10mM EDTA重悬酵母菌，20℃，5,000rpm收菌；
6. 750μL pH7.2，10mM的Tris.HCl重悬，转到1.5mL EP管中，20℃，5,000rpm收菌；
7. 150μL pH7.2，10mM的Tris.HCl重悬，放到50℃水浴锅中平衡；
8.加入150mL Zymolyse-20T溶液(20mg/mL zymolyse-20T，50％甘油，2.5％葡萄糖，50mM pH8.0Tris.HCl)和225μL 2％的TE25S溶解的低熔点琼脂糖(事先配好，在50℃水浴锅中平衡)，混匀后倒入模具，冰箱4℃冷却；
9. 30min后取出胶块，加入5mL lyticase buffer(pH7.5，10mM的Tris.HCl和pH8.0，50mM EDTA)和500μL Zymolyse-20T，37℃孵育3小时；
10. 25mLddH2O洗一次胶块，然后用wash buffer(pH7.5，20mM的Tris.HCl和pH8.0，50mM EDTA)洗涤一次；
11.每1mL胶块加入5mL蛋白酶反应液(pH8.0，100mM EDTA，0.2％sodium deoxycholate，1％sodium lauryl sarcosine，1mg/mL的蛋白酶K)50℃消化36小时；
12. 50mL wash buffer洗涤胶块4次，于室温下轻柔震荡，每次30-60分钟。
13.切1/3胶块于1.5ml EP管中，加1mL wash buffer和1mM PMSF置于冰盒中，震荡30-60分钟；
14.倒尽wash buffer，加1mL TE冰上放置30分钟，期间多次颠倒混匀；
15.加1mL TE冰上30min，期间多次颠倒混匀；
16.用1mL移液枪小心吸去TE溶液，轻弹试管让琼脂糖块落入管底。加入500μL酶切反应缓冲液，冰上放置30-60分钟，平衡反应体系；
17.用1mL移液枪小心吸去酶切反应缓冲液，再加入10μL酶切反应缓冲液和22U FseI内切酶，37℃消化2小时；
18.酶切反应完毕，将离心管置于冰上，吸去酶和缓冲液。在管中加入1mL电泳缓冲液，于冰上平衡15-30min，并不时颠倒EP管；
19.酶切后的胶块使用Bio-Rad CHEFDRII仪器，用1％的琼脂糖凝胶在0.5*TBE缓冲液中8℃条件下进行分离。转换角度设置为120°.，电压设置为6V/cm，先60s转换时间电泳23小时，再90s转换时间电泳12.5小时。
酿酒酵母基因组de novo测序
酿酒酵母野生型出发菌株BY4742(含16条天然染色体)及“染色体16合1”的工程菌株SY14送武汉菲沙基因信息有限公司进行基因组的de novo测序。对每个样品进行PacBio平台建库，每个样本构建1个20kb大片段文库。采用PacBio Sequel平台数据采集模式，每个样品DNA文库测序1个细胞，单个细胞数据量在4-5G。对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理后进行基因组组装。
实施例1、菌株构建
本发明构建的一系列染色体融合的工程菌株的出发菌株为酿酒酵母野生型菌株S288C的衍生菌株BY4742，其基因型为MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0(Brachmann，C.B.等(1998)；Yeast，14，115-132)。
菌株BY4742的16条天然染色体近端粒区存在13处主要的重复序列(表1)，其中重复序列1，7，9，10为3个拷贝，其余11个重复序列为2个拷贝。这些重复序列长度为2.7～26.2kb，容易成为染色体同源重组的热点进而影响整个基因组的稳定性，此外也会干扰染色体融合的定点同源重组。为了消除了近端粒的主要重复序列，本发明人共删除了19处重复序列，包括2个拷贝的重复序列1，7，9，10和1个拷贝的重复序列2，3，4，5，6，8，11，12，13，14，15。
表1、酿酒酵母天然染色体近端粒区重复序列的信息
一系列染色体融合的工程菌株的构建流程如图1所示。利用DNA双链定点切割的CRISPR-Cas9系统介导的高效染色体融合方法，从菌株BY4742出发通过删除5处靠近染色体端粒区的重复序列及融合2条天然染色体VII和VIII得到了菌株SY0(14条天然染色体及1条“2合1”融合染色体)。另外11处的重复序列的删除是在染色体融合过程中通过删除待融合染色体的端粒来实现的(表2)。
如图1所示，在SY0的基础上继续累积融合天然染色体XIII和XII，I和II，VI和XIV，IVI和V，IX和X，III和IV得到菌株SY1(12条天然染色体及2条“2合1”融合染色体)，SY2(10条天然染色体及3条“2合1”融合染色体)，SY3(8条天然染色体及4条“2合1”融合染色体)，SY4(6条天然染色体及5条“2合1”融合染色体)，SY5(4条天然染色体及6条“2合1”融合染色体)，SY6(2条天然染色体及7条“2合1”融合染色体)。在SY6的基础上将2条“2合1”融合染色体XVI-V和VI-XIV进行融合得到SY7(2条天然染色体，5条“2合1”融合染色体，及1条“4合1”融合染色体)。将SY7的最后2条天然染色体XV和XI融合后得到SY8(6条“2合1”融合染色体及1条“4合1”融合染色体)。在SY8基础上累积融合“2合1”融合染色体VII-VIII和IX-X，I-II和III-IV，XIII-XII和XV-XI得到菌株SY9(4条“2合1”融合染色体及2条“4合1”融合染色体)，SY10(2条“2合1”融合染色体及3条“4合1”融合染色体)，SY11(4条“4合1”融合染色体)。在SY11的基础上累积融合“4合1”融合染色体I-II-III-IV和VII-VIII-IX-X，XVI-V-VI-XIV和XIII-XII-XV-XI得到菌株SY12(2条“4合1”融合染色体及1条“8合1”融合染色体)，SY13(2条“8合1”融合染色体)。将SY13的2条“8合1”融合染色体XVI-V-VI-XIV-XIII-XI-XV-XI和I-II-III-IV-VII-VIII-IX-X融合为1条“16合1”融合染色体，得到菌株SY14。以上得到的菌株SY0-SY14的染色体均为线型染色体。将菌株SY14的1条大的“16合1”线型染色体环化后得到了仅含1条大的环型染色体的菌株SY15。本发明构建的酿酒酵母工程菌株的详细信息请见表2。
表2、染色体融合的工程菌株的详细信息
表3、染色体融合时的靶向切割位点
利用脉冲场凝胶电泳(PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis)来鉴定本发明构建的一系列酿酒酵母工程菌株的染色体大小。如图2所示，PFGE检测到的酿酒酵母菌株SY0-SY10的染色体条带的变化与理论计算(表2)相符。约108个细胞被分别收集并用于制备相应的低熔点琼脂糖胶块。胶块经过溶壁酶及蛋白酶K处理后进行脉冲电泳。使用Bio-Rad CHEFDRII仪器，在0.5×TBE缓冲液中12.5℃条件下进行分离。电泳条件为转换角度设置为120°，电压设置为6V/cm，60s转换时间电泳22小时，再90s转换时间电泳12小时。
菌株SY11-SY15的融合染色体较大(2.5～11.8Mb)，因此需要改换PFGE条件来进行染色体分离鉴定(图3)。菌株SY11的4条融合染色体的理论大小为2523、2747、2821和3682kb；菌株SY12的3条融合染色体的理论大小为2523、3682和5558kb；菌株SY13的2条融合染色体的理论大小为5558和6191kb。如图3所示，菌株SY11-SY13的染色体大小与理论计算一致。菌株SY14的1条线型染色体的理论大小为11737kb，在图3中可见SY14的一条大染色体远在5.7Mb的DNA标准带之上。菌株SY15的1条环型染色体的理论大小为11727kb，但是大的环型染色体由于无法跑出胶块(染色体DNA仍留在点样孔中)，因此在图3中SY15未跑出可见的DNA条带。
对每一个菌株，约108个细胞被分别收集并用于制备相应的低熔点琼脂糖胶块。胶块经过溶壁酶及蛋白酶K处理后进行脉冲电泳。使用Bio-Rad CHEFDRII仪器，在1×TAE缓冲液中6℃条件下进行分离。电泳条件为转换角度设置为106°，电压设置为1.5V/cm，转换时间1800s电泳27小时，再将转换角度设置为100°，电压设置为2V/cm，转换时间1500s电泳27小时，转换角度设置为96°，电压设置为2.5V/cm，转换时间1200s电泳27小时。
基因组de novo测序表明SY14的染色体与酿酒酵母参考基因组的共线性很好(图4)，且染色体融合顺序与设计一致。菌株SY14的基因组测序结果请见附件。
实施例2、菌株性能
菌株生长
本发明构建的一系列染色体融合的酿酒酵母工程菌株具有良好的生长。线型天然染色体的逐一融合不影响菌株的生长。图5的生长曲线表明菌株SY11-SY13(图5，A)及SY14(图5，B)的生长与野生型出发菌株BY4742几乎一致。而染色体的环化使得菌株SY15的生长较野生型菌株BY4742略慢(图5，B)。
实施例3、基因组稳定性
本发明构建的一系列染色体融合的酿酒酵母工程菌株具有遗传稳定的基因组。图6所示为生长0代和连续生长100代后，菌株的SY14和SY15的基因组的酶切验证图。菌株SY14染色体用限制性内切酶FseI理论上可以切出23条带，分别为1569、1446、1125、1050、892、891、778、587、548、414、412、381、363、318、258、210、141、133、82、78、27、25.7和0.9kb。菌株SY15染色体为SY14染色体环化而来，因此SY15的FseI酶切图谱与SY14的比较，将减少两条差异带1125和82kb。这两条带在SY15中合并为一条，即为新增一条1193kb差异带。
菌株SY14的de novo测序全基因组序列如SEQ ID NO:48所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 染色体融合改造的酵母工程菌株
<130> 174566
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 1
cctttagatc ggcaagagat t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 2
ccgagtagaa tctatggcta 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 3
ttggggtaag aatactgcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 4
ggattttttg gattttaact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 5
tggcaaaggt ttagatccgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 6
atctaaagag ctgccgaagg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 7
taggatacaa gtgtctgtgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 8
ctggtaaaga gctctgcagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 9
agcgtagtta acccctctgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 10
acacacgttt acgatgatat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 11
tcgaacgtga tcctaacgag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 12
aacagcatgc atccttgact 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 13
tgtttagtgc aagccactgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 14
tgcgtttgaa tagcgacatg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 15
tttcacatgc tcgaccgttt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 16
tttcacgaat acgagataca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 17
aaggagacaa attcagcgag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 18
catgagctac acgagttgac 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 19
tacatttcat aaacatggca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 20
aatgagcatg gttaggcagg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 21
cgctcagtca attcgtcagc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 22
ttaattgagt tgttgtgaaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 23
gtgataccac cgcacagcaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 24
aacctgtgct gaatactgga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 25
attactttca catgttttag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 26
gaatcagata taggcttccc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 27
tacaaaaccc aaggtcatta 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 28
tacgagaaga aatgattttc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 29
attcaagctc agtttcgcct 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 30
ttagatccgg aatcataacg t 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 31
gtacagaact cttaagcact 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 32
tgaagttttt cgtggcagga 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 33
ttacgttaat gacgtcatgg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 34
actctctttg taataatcca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 35
aaagcaattg tcttcgactg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 36
ggggtaaaaa ctctttacgc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 37
gataattata atgcaaggaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 38
atgctctaaa cgattgccgc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 39
cttttacatt aatgacgtca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 40
tggctcacta tacaatcggc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 41
cactctagag ggtctaagca 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 42
attggggaag tgacacacca 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 43
acagtttctt tttcttgagc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 44
gtagttcata aaattcatgc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 45
acggctaact gaacctaagt 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 46
atcgtatcaa cgaatccact 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶向切割位点(Targeting site)
<400> 47
gccatttcct ttgtggtgat 20