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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510956127.5 (22)申请日 2015.12.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105483038 A (43)申请公布日 2016.04.13 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M2014457 2014.10.08 (73)专利权人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 赵方杰黄科 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷徐。
2、冬涛 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 CN 104004691 A,2014.08.27, CN 103834589 A,2014.06.04, Yan Jia et al.Microbial Arsenic Methylation in Soil and Rice Rhizosphere. Environ. Sci. Technol. .2013,第43卷全文. Marie Vahter.Mechanisms of arsenic biotransformation. 。
3、Toxicology .2002,全文. David J. Thomas et al.Elucidating the pathway for arsenic methylation. Toxicology and Applied Pharmacology .2004,全文. 王娟 等.Shewanella oneidensis MR-1 对 不同价态砷的生物转化与甲基化. 中国环境科 学 .2015,第35卷(第11期),全文. 审查员 赵鹏 (54)发明名称 一株嗜纤维菌科的好氧砷甲基化细菌SM-1 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株嗜纤维菌科的好氧砷甲 基化细菌SM-1及其应用。 本。
4、发明分离、 鉴定得到 了一株具有超强砷甲基化和挥发能力的革兰氏 阴 性 细 菌 ，该 菌 株 是 嗜 纤 维 科 细 菌 ( Cytophagaceae )的一株新属新种， 命名 ArsenicibacterpalustrisSM-1， 于2014年10 月15日保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏号 为： CCTCCM2014457。 与现有技术相比， 本发明具 有如下有益效果： 提供了一株具有超强砷甲基化 和挥发能力的细菌菌株， 该菌株可用于稻田土壤 砷污染修复， 最终减轻稻田砷污染的危害。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 105483038 B 2018.06.08 CN 1。
5、05483038 B 1.一株具有砷甲基化和挥发能力的嗜纤维科细菌SM-1， 其特征在于： 于2014年10月15 日保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏号为： CCTCC NO： M2014457。 2.权利要求1所述的嗜纤维科细菌SM-1在治理三价砷污染中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 权利要求1所述的嗜纤维科细菌SM-1在治 理三价砷污染土壤中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105483038 B 2 一株嗜纤维菌科的好氧砷甲基化细菌SM-1及其应用 技术领域 0001 本发明涉及环境微生物技术领域， 具体涉及一株嗜纤维菌科的好氧砷甲基化细菌 SM-1。
6、及其应用。 背景技术 0002 砷(As)是一种有毒有害的类金属元素， 同时也是一种可怕的致癌物。 全世界大约 有超过100万的人口受到了这种有害元素的毒害。 近几十年来， 人类的生产活动如采矿、 化 工冶炼、 焚烧化石燃料等加剧了砷在水体、 大气、 土壤环境中的传播与扩散。 东南亚地区， 这 个以稻米为主要膳食的地区， 稻田砷污染的情况与日剧增。 稻田土壤中高浓度的砷含量不 仅会影响水稻的生长和产量； 还会通过水稻的累积作用进入人体， 对长期食用人群造成健 康危害， 因而非常有必要在这些地区开展有效的稻田砷污染的修复和治理。 0003 传统的物理、 化学修复土壤砷污染的方法包括了混凝过滤、 。
7、铁化合物的交换吸附 等， 这些方法虽然对砷的去除效率较高， 但由于其使用费用昂贵， 并会对需修复的土壤造成 二次破坏， 使得它们在实际治理中难以被大规模地应用。 相比而言， 生物修复法有着无可比 拟的优势， 不仅投资较少， 并可直接进行原位修复， 且不会造成二次污染， 所以被认为是目 前最有前景的土壤污染修复手段之一。 微生物修复法在生物修复法中占有举足轻重的位 置。 目前已有的修复土壤砷污染的微生物方法主要是通过投加具有砷氧化功能的微生物使 土壤中还原态的三价砷As(III)转化为毒性更低的五价砷As(V),由于As(V)会被土壤 大量的吸附， 因而最终实现了降低土壤溶液中可利用砷总量的目的。
8、。 然而， 这种方法并不能 真正的实现净化砷污染土壤的目的， 因为(1)土壤中砷的总量并没有发生改变； (2)As(V)的 毒性依然很高； (3)在水稻长期淹水生长过程中形成的As(V)在微生物的作用下将会被逐渐 的还原， 又回复到毒性更强的As(III)， 所以我们非常有必要寻找一种更有效、 更可靠的微 生物修复方法来去除土壤中的砷污染。 0004 利用稻田土壤微生物的砷甲基化和挥发作用可以将还原态的As(III)转化为毒性 比As(V)更低的有机砷类化合物 包括五价的单甲基砷MMAs(V)、 五价的二甲基砷DMAs (V)和五价的三甲基砷氧化物TMAs(V)O， 同时在该过程中也能产生砷化。
9、氢(AsH3)、 二甲 基砷DMAs(III)H或三甲基砷TMAs(III)等挥发性气体将砷带离土壤本体， 这一转化过 程是全球砷循环的重要组成部分之一， 同时也被视为土壤砷生物修复的另一希望。 然而目 前已知的来源于稻田的砷甲基化微生物仅有两株， 一株是日本学者Masato Kuramata等分 离鉴定的Streptomyces sp.GSRB54； 另一株是王佩佩等鉴定砷甲基化功能的一株来源于稻 田的硫酸盐还原菌Clostridium sp.BXM。 这两株细菌虽然被证实都具有砷的甲基化能力， 研究人员也从它们各自体内鉴定到了一个三价砷甲基转移酶基因(arsM)， 然而这两株菌株 均不具备。
10、砷挥发的能力， 都不能产生挥发性的胂化物将砷带离土壤， 并且这两个菌株均未 开展相应的土壤培养实验以证明其在土壤生态环境系统中的效果， 因而它们很难被真正地 应用于稻田土壤砷污染的治理。 0005 先前的稻田土壤淹水培养实验中， 我们在实验室条件下发现了一份具有明显砷甲 说明书 1/5 页 3 CN 105483038 B 3 基化能力的土壤， 本发明就是从该份土壤中分离并鉴定到了一株具有超强砷甲基化和挥发 能力的微生物菌株， 该菌株可以有效的应用于稻田土壤砷污染的治理。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一株具有砷甲基化和挥发能力的嗜纤维菌科新属新菌 Arsenicibacter pa。
11、lustris SM-1。 0007 本发明的另一个目的在于提供该菌株在稻田砷污染治理中的应用示范。 0008 本发明的目的可通过以下技术方案实现： 0009 本发明分离、 鉴定得到了一株具有超强砷甲基化和挥发能力的革兰氏阴性细菌， 该菌株是嗜纤维科细菌(Cytophagaceae)的一株新属新种， 命名Arsenicibacter palustris SM-1， 于2014年10月8日保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏号为： CCTCC M2014457。 0010 (1)菌株的形态特征： 0011 采用常规的革兰氏染色和电子显微镜观察等手段来研究细菌的形态特征， 研究结 果表明菌株SM-。
12、1为杆状的革兰氏阴性菌， 不具有鞭毛， 没有游动性， 细胞的大小为0.77- 0.853.8-5 m。 在R2A培养基上培养2天后， 菌落形态呈圆形， 表面凸起， 边缘整齐， 橘黄色， 此时菌落的大小(d)为12mm。 0012 (2)菌株的生理生化特性 0013 菌株SM-1好养条件下在LB培养基中不生长； 在富集培养基中生长， 但长势较差； 该 菌的最适培养基为R2A， 该结果表明SM-1是一株好养的寡营养型细菌。 该菌株能生长的温度 范围为15-45,pH为6-8， 能耐受的盐(NaCl)浓度范围为0-0.5。 该菌的氧化酶活性为阴 性， 接触酶活性为阳性， 用试剂条ID32GN鉴定后发。
13、现， 在32种不同碳源中， 该菌株只能利用 其中的7种(D 葡萄糖、 水杨素、 D-蜜二糖、 N-乙酰葡萄糖胺、 蔗糖、 麦芽糖、 糖原)， 其碳源利 用的底物谱比较狭窄。 0014 (3)16S rRNA序列和系统发育分析 0015 首先使用CTAB法提取细菌总DNA， 以该DNA为模板， 采用通用引物F27和R1492PCR来 扩增获得该菌株的16S rRNA基因， 回收纯化该1500bp左右的PCR产物， 将其与载体PMD18T连 接后转化进入大肠杆菌DH5 中,挑选阳性克隆子送测序公司进行测序， 测回的序列输入 NCBI中与其他16S rRNA基因序列进行Blast比对。 比对结果显示。
14、该菌株与嗜纤维素菌科的 所有细菌的同源性均小于88， 可以认为是嗜纤维素菌科的一株新属新种。 结合上述的生 理生化特性、 16S rRNA序列的结果， 该菌株应归属于嗜纤维素菌科， 命名为Arsenicibacter palustris SM-1。 0016 所述的保藏号为CCTCC NO： M2014457的嗜纤维科细菌SM-1在治理三价砷污染中的 应用。 0017 所述的保藏号为CCTCC NO： M2014457的嗜纤维科细菌SM-1在治理三价砷污染土壤 中的应用。 0018 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 提供了一株具有超强砷甲基化和挥 发能力的细菌菌株， 该菌株可用于稻田。
15、土壤砷污染修复， 最终减轻稻田砷污染的危害。 说明书 2/5 页 4 CN 105483038 B 4 附图说明 0019 图1： 菌株SM-1的扫描电镜图片。 0020 图2： 菌株SM-1的系统发育分析。 0021 图3： 菌株SM-1对As(III)的转化曲线图。 (A)R2A培养基中砷的形态变化； (B)挥发 性砷的含量变化图。 0022 图4： 土壤溶液(A)和挥发物(B)中砷的形态和含量。 0023 生物材料保藏信息 0024 Arsenicibacter palustris SM-1保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏地址中 国武汉武汉大学， 保藏日期2014年10月8日， 保藏。
16、号为： CCTCC NO： M2014457。 具体实施方式： 0025 实施例1： 土壤样品的富集和砷甲基化细菌SM 1的分离、 纯化、 保藏 0026 取来自石门砷污染地区的稻田土壤2g加入100mL的富集培养基中， 富集培养基的 组成为(g/L)： ST10-1(0.5g蛋白胨,0.05g酵母膏),0.5葡萄糖， 10 M As(III)。 将培养基放 置于200rpm、 30的摇床培养一周， 一周后从富集液中取出5mL转接于新的100mL富集培养 集中， 在相同培养条件继续培养， 上述转接过程重复两次， 最后从富集液中取出2mL用于砷 的形态分析， 样品用于检测之前要先用离心机1200。
17、0rpm离心2min， 然后过0.22 M的滤膜。 采 用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS)来检测富集液中是否有有机砷 化合物例如DMAs(V)、 MMAs(V)、 TMAs(V)O等的产生， 检测的流动相为8.5mM(NH4)2HPO4、 8.5mM NH4NO3,pH 6.0， 工作流速为1.2ml min-1， 工作内标为锗。 确定富集液具有砷的甲基化功能 后， 稀释涂布于富集培养基固体平板上， 将平板放置于30培养箱中培养， 5天后从这些平 板上挑取单菌落进行分离纯化， 分别验证这些菌株的砷的甲基化活性。 用甘油管保存确定 具有砷甲基化活性的菌株， 所用甘油。
18、的终浓度为20， 最后将甘油管保藏于-70的冰箱 中。 0027 实施例2： 菌种的鉴定 0028 (1)生理生化性质的测定： 0029 表1.菌株SM-1的生理生化特性 说明书 3/5 页 5 CN 105483038 B 5 0030 0031 注： +表示可以利用； 表示不能利用 0032 (2)分子生物学鉴定 0033 使用CTAB法提取细菌总DNA， 以该DNA为模板， 采用通用引物F27和R1492PCR来扩增 获得该菌株的16S rRNA基因， 回收纯化该1500bp左右的PCR产物， 将其与载体PMD18T连接后 转化进入大肠杆菌DH5 中,挑选阳性克隆子送测序公司进行测序， 。
19、测回的序列输入NCBI中 与其他16S rRNA基因序列进行Blast比对。 该序列已经提交至NCBI GenBank， 注册号为 KT989310。 结合上述的生理生化特性、 16S rRNA序列的结果， 该菌株应归属于嗜纤维素菌 科， 命名为Arsenicibacter palustris SM-1。 0034 实施例3： 实验室条件下菌株砷甲基化和挥发能力的检测 0035 R2A培养基的组分为(g/L):酵母粉0.5g,胰蛋白胨0.5g,酪蛋白氨基酸0.5g,葡萄 糖0.5g,可溶性淀粉0.5g,磷酸氢二钾0.3g,七水硫酸镁0.05g,丙酮酸钠0.3g。 将菌株SM-1 接种于100m。
20、L上述液体培养基中， 37、 200rpm摇床培养一昼夜使菌体的OD600值达到1.0， 此 时从种子培养基中取出1mL的种子液加入新的100mL加入了10 M As(III)的R2A液体培养基 中， 处理分别设置三个重复， 转接液在上述相同培养条件下继续培养， 每隔4个小时取一次 溶液样品， 取出的溶液12000rpm离心2min之后， 上清过0.22 M的滤膜， 存放在4度冰箱中准 备用于上机测定砷含量和形态。 在取溶液样品的同时使用浸泡了10AgNO3的硅胶粒收集 从培养基中逃逸的挥发性胂化合物， 使用气体装置收集挥发性胂的具体方式及后续样品的 酸洗脱可参照本人先前的研究工作(Ke Hu。
21、ang et al .Genetically Engineering Bacillus subtilis with a Heat-Resistant Arsenite Methyltransferase for B i o r e m e d i a t i o n o f A r s e n i c - C o n t a m i n a t e d O r g a n i c Waste.Appl.Environ.Microbiol.2015,81(19),6718-6724.)。 试验结果如图3所示， 从图中 我们可以看出菌株SM-1具有超强的砷甲基化和挥发能力， 溶液中As(III)的。
22、浓度随着培养 说明书 4/5 页 6 CN 105483038 B 6 时间的延长而降低， 经过24h的培养， 菌株SM-1不仅可以将溶液中几乎所有的As(III)转化 为2.8 M毒性极低的DMAs(V)和2.3 M几乎无毒的TMAs(V)O,同时还可以将大约一半的As (III)(48)以36 g TMAs(III)的形式挥发带离液体培养基。 0036 实施例4： 菌株SM-1对石门砷污染土壤的修复效果 0037 将100g砷污染土壤(总砷浓度约为25mg L-1)和100mL去离子水置于100mL的三角瓶 中混匀， 实验处理设置两组， 一组是接入20mL灭菌处理过的R2A液体培养基； 另。
23、一组则接入 20mL新鲜的SM-1菌悬液， 两组处理均置于28200转的摇床中培养5天， 每组实验设置四个 重复。 培养结束后， 用5mL的移液枪从每瓶土壤泥浆液中取出5mL的混合液， 将这些混合液 13,000rpm进行离心处理， 吸取上清液过0.22 m滤膜上HPLC-ICP-MS检测其中的砷含量及形 态。 与液体培养基培养该菌株一致的是： 我们在这次土壤修复实验的最后时刻也收集了从 实验土壤中逃逸出来的挥发性胂， 这些挥发性的砷同样会用HPLC-ICP-MS来进行分析和定 量。 试验结果如图4所示。 从图4可知， 在未接菌的土壤溶液仅有很少量的有机砷15.6 g/L DMAs(V)产生，。
24、 溶液中大部分的砷形态仍然是以无机砷为主。 然而， 在接菌的土壤中DMAs (V)含量明显上升， 到达了245.7 g/L,同时我们还在土壤溶液检测到了13.1 g/L TMAs(V) O,与未加菌的土壤相比， 加菌的土壤中无机三价砷的量明显降低， 同时加入菌株SM-1也使 得土壤产生了少量的挥发性砷9.9ng TMAs(III)， 从而降低了土壤中总砷的浓度。 这个实 验表明菌株SM-1可以有效作用于砷污染的稻田土壤， 可以明显的降低剧毒无机砷的含量， 产生毒性较低的有机砷和挥发性的砷。 说明书 5/5 页 7 CN 105483038 B 7 图1 说明书附图 1/4 页 8 CN 105483038 B 8 图2 说明书附图 2/4 页 9 CN 105483038 B 9 图3 说明书附图 3/4 页 10 CN 105483038 B 10 图4 说明书附图 4/4 页 11 CN 105483038 B 11 。