技术领域
本发明涉及一种新型的改变型脂肪酶及其制造方法以及使用该酶 的各种反应。更详细而言，涉及一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的 改变型脂肪酶。进而，涉及一种使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯 化合物的方法。
另外，本发明涉及一种使用已知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯 化合物的方法。
背景技术
目前，将脂肪酶用作催化剂得到氨基甲酸酯化合物的方法（氨基 甲酸酯化）例如已知有在脂肪酶的存在下通过3’,5’-二氨基核苷（脂肪 族胺化合物）和碳酸二乙酯化合物的反应来合成氨基甲酸酯的方法（非 专利文献1）。
但是，脂肪酶相对于底物的添加量多、反应时间长且产物的收率 也低，使用脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的制造方法难以说是满足产业 化的制造方法。从这些方面考虑，寻求一种具有优异的氨基甲酸酯化 活性的脂肪酶。
另一方面，进行了改变脂肪酶的氨基酸序列来提高活性、稳定性 的研究（非专利文献2和3）。但是，尚未得知通过改变氨基酸序列提 高了氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。
另外，专利文献1记载了通过改变脂肪酶（CALB）的氨基酸序列 来增加丙烯酸酯活性，但记载了将104位的色氨酸单独取代为苯丙氨酸 会造成活性的降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献：WO2009/080676A1
非专利文献
非专利文献1：J.Org.Chem，2004年69卷p.1748-1751
非专利文献2：ChemBioChem2010年11卷p.789-795
非专利文献3：J.Amer.Chem.Soc.，2005年127卷p.13466-13467
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改 变型脂肪酶、以及使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
另外，本发明的目的在于，提供一种使用公知的改变型脂肪酶制 造氨基甲酸酯化合物的方法。
用于解决课题的方法
本发明的发明者们的目的在于，通过选择CALB作为脂肪酶，制作 CALB的突变体来提高氨基甲酸酯化活性从而降低制造氨基甲酸酯化 合物所需的成本。而且，进行了潜心研究，结果成功制成具有高于野 生型的氨基甲酸酯化活性的突变CALB。另外，本发明的发明者们还发 现，公知的改变型CALB具有较高的氨基甲酸酯化活性。即本发明提供 下面的发明。
（1）一种改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将 序列编号1的193位谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变 型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插 入、添加或倒位且显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸 酯化活性。即，具有Q193X（在此，X表示谷氨酰胺以外的任意的氨基 酸）的序列编号1的单独改变型脂肪酶或其突变体。
（2）根据（1）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变 型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改 变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、 插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。 即，具有Q193E或Q193D的序列编号1的单独改变型脂肪酶或其突变体。
（3）根据（1）或（2）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中， 该改变型脂肪酶进一步将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸，该改变型脂 肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即， 具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F的序列编号1的双重改变型脂肪 酶或其突变体。
（4）根据（1）或（2）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中， 该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改 变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、 插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。 即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+[L278K或L278R]的序列编号1的双 重改变型脂肪酶或其突变体。
（5）根据（3）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变 型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂 肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即， 具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F+[L278K或L278R]的序列编号1 的三重改变型脂肪酶或其突变体。
（6）根据（5）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变 型脂肪酶进一步将283位的丙氨酸取代为缬氨酸，该改变型脂肪酶的突 变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒 位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有 [Q193X、Q193E或Q193D]+W104F+[L278K或L278R]+A283V的序列编 号1的四重改变型脂肪酶或其突变体。
（7）一种DNA，其编码（1）～（6）中任一项记载的改变型脂肪 酶或其突变体。
（8）一种转化微生物，其含有（7）所述的DNA。
（9）一种改变型脂肪酶或其突变体的制造方法，其特征在于，在 培养基中培养（8）所述的转化微生物，使改变型脂肪酶或其突变体在 培养基中和/或微生物中积累。
（10）一种改变型脂肪酶或其突变体，其是将（1）～（6）中任 一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（9）所述的方法得到的 改变型脂肪酶或其突变体在载体中固定化得到的。
（11）（1）～（6）和（10）中任一项所述的改变型脂肪酶或其 突变体或者通过（9）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在氨 基甲酸酯化反应中的使用。
（12）根据（11）所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳 酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
（13）一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在（1）～ （6）和（10）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（9） 所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体的存在下，使碳酸二烷基 酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
（14）根据（13）所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中， 碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
（15）将序列编号1的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的改变 型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改 变型脂肪酶的突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。
（16）根据（15）所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳 酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
（17）一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在将序 列编号1的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸的改变型脂肪酶、或进一步 具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与 该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体 的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
（18）根据（17）所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中， 碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
（19）一种改变型脂肪酶或其突变体，显示高于序列编号1所示的 野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性，其中，该改变型脂肪酶是将序列 编号1的278位的亮氨酸取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂 肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位。即，具有L278X1（在此，X1表示亮氨酸以外的任意的氨 基酸）的序列编号1的改变型脂肪酶或其突变体。
（20）如（19）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变 型脂肪酶是将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸得到的，该改变型 脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即， 具有L278K或L278R的序列编号1的改变型脂肪酶或其突变体。
（21）如（19）或（20）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中， 该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺进一步取代为谷氨酸或天冬氨 酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸 的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨 基甲酸酯化活性。即，具有[Q193E或Q193D]+[L278X1、L278K或L278R] 的序列编号1的改变型脂肪酶或其突变体。
（22）一种DNA，其编码（19）～（21）中任一项记载的改变型 脂肪酶或其的突变体。
（23）一种转化微生物，其含有（22）所述的DNA。
（24）一种改变型脂肪酶或其突变体的制造方法，其特征在于， 在培养基中培养（23）所述的转化微生物，使改变型脂肪酶或其突变 体在培养基中和/或微生物中积累。
（25）一种改变型脂肪酶或其突变体，其是将（19）～（21）中 任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（24）所述的方法得 到的改变型脂肪酶或其突变体在载体中固定化得到的。
（26）（19）～（21）和（25）中任一项所述的改变型脂肪酶或 其突变体或者通过（24）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体 在氨基甲酸酯化反应中的使用。
（27）根据（26）所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳 酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
（28）一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在（19）～ （21）和（25）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（24） 所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体的存在下，使碳酸二烷基 酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
（29）根据（28）所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中， 碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
发明的效果
本发明的改变型脂肪酶或其突变体显示比野生型脂肪酶优异的氨 基甲酸酯化活性。
附图说明
图1表示包含与SUC2的信号序列连结的成熟野生型CalB基因的表 达载体pYES2CT（pYES2CT/SUC2sig/mCALB）；
图2表示载有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母的酯化合 物分解活性。“-CALB”表示载有不具有CalB基因的pYES2CT/SUC2sig 载体的转化酵母（对照）。“+CALB”表示载有具有CalB基因的 pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母；
图3表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸 二甲酯（DMC）和正己胺合成氨基甲酸酯化合物的活性。（A）表示 使用W104F/Q193E改变型脂肪的8hr后的反应液的GC色谱。IS表示内 标。（B）表示己基氨基甲酸甲酯的收率（%）。w.t.，W104F、Q193E 和W104F/Q193E分别表示野生型脂肪酶、W104F改变型脂肪酶、Q193E 改变型脂肪酶和W104F/Q193E改变型脂肪酶；
图4表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸 二甲酯（DMC）和1,3-二氨基甲基环己烷（1,3BAC）合成氨基甲酸酯 化合物的活性；
图5表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸 二甲酯（DMC）和1,12-二氨基十二烷（DMD）合成氨基甲酸酯化合物 的活性；
图6表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸 二甲酯（DMC）和苯二甲基二胺（XDA）合成氨基甲酸酯化合物的活 性；
图7表示使用W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、 W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V 改变型脂肪酶由碳酸二甲酯（DMC）和正己胺合成的氨基甲酸酯化合 物的活性。
具体实施方式
本发明的脂肪酶表示来源于Candida antarctica（南极假丝酵母）的 脂肪酶（CALB、Genebank ACCESSION No.P41365）。本发明的CALB 优选指成熟CALB，将其氨基酸序列示于序列编号1。另外，本发明的 CALB也可以包括保持其功能的片段。而且，本发明的改变型脂肪酶或 其的突变体也可以包含保持其功能的片段。下面，将具有序列编号1的 氨基酸序列的脂肪酶称为野生型脂肪酶。
本发明的改变型脂肪酶是指显示高于野生型脂肪酶的氨基甲酸酯 化活性且将序列编号1中的193位的谷氨酰胺取代为其它氨基酸残基 （Q193X，X为除谷氨酰胺以外的任意的氨基酸）得到的改变型脂肪酶 （下面，称为Q193X改变型脂肪酶）。另外，也可以包含将104位的色 氨酸取代为苯丙氨酸（W104F）得到的改变型脂肪酶（下面为W104F 改变型脂肪酶（序列编号3））。
优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸（Q193E 或Q193D）得到的单独改变型脂肪酶（下面，称为Q193E改变型脂肪酶 （序列编号2）或Q193D改变型脂肪酶（序列编号19））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸，进而 将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的双重改变型脂肪酶（下面，称 为Q193E/W104F改变型脂肪酶（序列编号4）或Q193D/W104F改变型脂 肪酶（序列编号20））。
本发明的改变型脂肪酶是指显示高于野生型脂肪酶的氨基甲酸酯 化活性且将序列编号1中的278位的亮氨酸取代为其它的氨基酸残基 （L278X1，X1为除亮氨酸以外的任意的氨基酸）得到的改变型脂肪酶 （下面，称为L278X1改变型脂肪酶）。
优选为将上述278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸（L278R或 L278K）得到的单独改变型脂肪酶（下面，称为L278R改变型脂肪酶（序 列编号21）或L278K改变型脂肪酶（序列编号22））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸，进而 将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸得到的双重改变型脂肪酶（下 面，称为Q193E/L278K改变型脂肪酶（序列编号24）、Q193E/L278R 改变型脂肪酶（序列编号23）、Q193D/L278K改变型脂肪酶（序列编 号26）或Q193D/L278R改变型脂肪酶（序列编号25））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸、将 104位的色氨酸取代为苯丙氨酸、将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖 氨酸得到的三重改变型脂肪酶（下面，称为Q193E/W104F/L278K改变 型脂肪酶（序列编号28）、Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列 编号27）、Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号30）或 Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号29））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸、将 104位的色氨酸取代为苯丙氨酸、将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖 氨酸、将283位的丙氨酸取代为缬氨酸得到的四重改变型脂肪酶（下面， 称为Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号32）、 Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号31）、 Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号34）或 Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号33））。
本发明的改变型脂肪酶的特征在于具有在上述193位、104位、278 位和/或283位进行了氨基酸取代的氨基酸序列，但也可以在上述193位、 104位、278位和/或283位以外的位置进一步含有氨基酸突变。由此，本 发明也提供如下的突变体，其在与具有上述193位、104位、278位和/ 或283位的氨基酸取代的改变型脂肪酶进行比较的情况下其功能相同 但与具有上述193位、104位、278位和/或283位的氨基酸取代的改变型 脂肪酶相比一部分氨基酸序列不同。
一部分氨基酸序列不同典型而言是指通过构成氨基酸序列的一 个～多个氨基酸的缺失、取代、添加、插入，倒位或它们的组合在氨 基酸序列上产生突变。
因此，本发明包括193改变型脂肪酶的突变体，其在193位的谷氨 酰胺取代为其它的氨基酸残基的基础上，进一步含有一个或者多个氨 基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与193改变型脂肪酶相同 的氨基甲酸酯化活性。
另外，本发明包括W104F改变型脂肪酶的突变体，其在W104F取 代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位，显示与W104F改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
另外，本发明包括Q193E改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E取代 的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添 加或倒位，显示与Q193E改变型脂肪酶显示相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括Q193D改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D取代的基 础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或 倒位，显示与Q193D改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
另外，本发明还包括Q193E/W104F改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193E/W104F取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、 缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F改变型脂肪酶相同的 氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193D/W104F取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、 缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F改变型脂肪酶相同的 氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193E/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、 缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/L278K改变型脂肪酶相同的 氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193E/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、 缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/L278R改变型脂肪酶相同的 氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193D/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、 缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/L278K改变型脂肪酶相同的 氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193D/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、 缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/L278R改变型脂肪酶相同的 氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193E/W104F/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸 的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F/L278K改变 型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193E/W104F/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸 的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F/L278R改变 型脂肪酶显示相同氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193D/W104F/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸 的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F/L278K改变 型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在 Q193D/W104F/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸 的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F/L278R改变 型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变 体，其在Q193E/W104F/L278K/A283V取代的基础上，进一步含有一个 或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与 Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变 体，其在Q193E/W104F/L278R/A283V取代的基础上，进一步含有一个 或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与 Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变 体，其在Q193D/W104F/L278K/A283V取代的基础上，进一步含有一个 或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与 Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变 体，其在Q193D/W104F/L278R/A283V取代的基础上，进一步含有一个 或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与 Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括278改变型脂肪酶的突变体，其在278位的亮氨酸取代 为其它的氨基酸残基取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸 的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与278改变型脂肪酶相同的氨 基甲酸酯化活性。
本发明包括L278R改变型脂肪酶的突变体，其在L278R取代的基础 上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒 位，显示与L278R改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括L278K改变型脂肪酶的突变体，其在L278K取代的基础 上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒 位，显示与L278K改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
在与氨基甲酸酯化反应相关的特性不会大幅降低的限度内（优选 实质上保持的限度）容许氨基酸序列不同。因此，只要满足该条件， 则氨基酸序列不同的位置没有特别限定。另外，也可以在多个位置产 生不同。在此，所谓多个例如为相当于低于总氨基酸的约30%的数目， 优选为相当于低于约20%的数目，进一步优选为相当于低于约10%的数 目，更进一步优选为相当于低于约5%的数目，最优选为相当于低于约 1%的数目。
因此，一部分氨基酸序列不同的蛋白质可以为与上述改变型脂肪 酶的氨基酸序列中任一序列具有例如约70%以上、优选约80%以上、进 一步优选约90%以上、更进一步优选约95%以上、最优选约99%以上的 氨基酸序列同一性的同源蛋白质。氨基酸序列同一性可以使用本领域 从业人员众所周知的BLAST以初始设定值进行计算。BLAST在网址（例 如，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp＆ BLAST_PROGRAMS=blastp＆PAGE_TYPE=BlastSearch＆ SHOW_DEFAULTS=on＆BLAST_SPEC=blast2seq＆ LINK_LOC=blasttab＆LAST_PAGE=blastn＆BLAST_INIT=blast2seq） 中公开。
上述的同源蛋白质能够优选通过使不参与氨基甲酸酯化反应的氨 基酸残基产生保守性氨基酸取代来得到。在此，保守性氨基酸取代是 指将某氨基酸残基取代为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸 残基根据其侧链分类为如下几个家族（family）：碱性侧链（例如赖氨 酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、非带 电极性侧链（例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸）、非极性侧链（例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β分支侧链（例 如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸）。保守性氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间 的取代。
因此，Q193X改变型脂肪酶突变体可以为与Q193X改变型脂肪酶 具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与193改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
另外，W104F改变型脂肪酶的突变体可以为与W104F改变型脂肪 酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与W104F改变型脂肪酶 同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
另外，Q193E改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E改变型脂肪酶 具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E改变型脂肪酶同 等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D改变型脂肪酶具有 约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
另外，Q193E/W104F改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193E/W104F改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显 示与Q193E/W104F改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/W104F改 变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与 Q193D/W104F改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/L278K改变 型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/L278K 改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/L278K改变 型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/L278K 改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/L278R改变 型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/L278R 改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/L278R改变 型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/L278R 改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一 性且显示与Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活 性的突变体。
Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193D/W104F/L2678K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同 一性且显示与Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化 活性的突变体。
Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一 性且显示与Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活 性的突变体。
Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一 性且显示与Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活 性的突变体。
Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序 列同一性且显示与Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸 序列同一性且显示与Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶同等 的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序 列同一性且显示与Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与 Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序 列同一性且显示与Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
L278X1改变型脂肪酶的突变体可以为与L278X1改变型脂肪酶具有 约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与L278X1改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与L278R改变型脂肪酶具有 约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与L278R改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与L278K改变型脂肪酶具有 约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与L278K改变型脂肪酶同等的 氨基甲酸酯化活性的突变体。
编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA是指具有编码改变型脂肪酶 或其突变体的氨基酸序列的核酸序列的DNA，核酸序列可以基于本领 域从业人员众所周知的遗传密码由氨基酸序列来确定。
由于一个以上的密码子能够编码相同的氨基酸（密码子的简并）， 所以，一个以上的核酸序列能够编码一个氨基酸序列。因此，只要是 编码改变型脂肪酶或其突变体的核酸序列，则编码改变型脂肪酶或其 突变体的DNA没有限定。
编码Q193E改变型脂肪酶（序列编号2）或Q193D改变型脂肪酶（序 列编号19）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号14或35的 序列。编码W104F改变型脂肪酶（序列编号3）的氨基酸序列的核酸序 列可以举出例如序列编号17的序列。
编码Q193E/W104F改变型脂肪酶（序列编号4）或Q193D/W104F 改变型脂肪酶（序列编号20）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如 序列编号18或36的序列。
编码Q193E/L278R改变型脂肪酶（序列编号23）、Q193E/L278K 改变型脂肪酶（序列编号24）、Q193D/L278R改变型脂肪酶（序列编 号25）或Q193D/L278K改变型脂肪酶（序列编号26）的氨基酸序列的 核酸序列可以举出例如序列编号39、40、41或42的序列。
编码Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号27）、 Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号28）、 Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号29）或 Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号30）的氨基酸序列的核 酸序列，可以举出例如序列编号43、44、45或46的序列。
编码Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号31）、 Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号32）、 Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号33）或 Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号34）的氨基酸序 列的核酸序列可以举出例如序列编号47、48、49或50的序列。
编码L278R改变型脂肪酶（序列编号21）或L278K改变型脂肪酶（序 列编号22）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号37或38的 序列。
改变型脂肪酶的突变体可以为与改变型脂肪酶基因杂交且显示与 改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
所谓杂交优选指严格条件下的杂交。特别优选是指如下条件下的 杂交：杂交缓冲液：2×SSC、10×Denhardt溶液（聚蔗糖 (Ficoll)400+PEG+BSA；比率=1：1：1、0.1%SDS、5mM EDTA、50mM Na2HPO4、250μg/ml鲱鱼精DNA、50μg/ml tRNA、或25M磷酸钠缓冲液 pH7.2；1mM EDTA；7%SDS），杂交温度：T=65～68℃，清洗缓冲 液：0.1×SSC、0.1%SDS，清洗温度：T=65～68℃。
所谓含有编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA的转化微生物是指 以将编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA导入微生物来生产改变型脂 肪酶或其突变体的方式进行转化得到的微生物。编码改变型脂肪酶或 其突变体的DNA在微生物中既可以以质粒存在也可以整合在染色体 中。
微生物没有限定，例如可以列举细菌、酵母、丝状菌等。可优选 列举：大肠杆菌（Escherichia）、棒状杆菌（Corynebacterium）、芽孢 杆菌（Bacillus）、乳酸菌（Lactobacillus(乳杆菌)、Bifidobacterium(双 歧杆菌)）、酵母（Saccharomyces(糖酵母)、Pichia(毕赤氏酵母)、 Schizosaccharomyces(裂殖糖酵母)、Kluyveromyces(克鲁维氏酵母)、 Hansenula(汉逊氏酵母)、Yarrowia(亚罗酵母)）、丝状菌（Aspergillus(曲 霉)）等。其中，更优选大肠杆菌（Escherichia co1i(大肠埃希氏菌)）、 酵母（Saceharomyces、Pichia Schizosaccharemyces、Kluyveremyces、 Hansenula、Yarrewia）、丝状菌（Aspergillus）。这些微生物可以从市 场上获得。
转化到微生物中的编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA优选位于 载体。载体可以列举：噬菌体、质粒等，优选质粒。质粒更优选具有 用于表达的启动子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号序列、 多克隆位点、复制起始点、选择标记等的表达用质粒。
作为源自大肠杆菌的质粒，例如可以列举：pBR322、pBR325、 pUC18、pUC118。作为源自酵母的质粒，例如，可以列举：pSH19、 pSH15、pYES2，作为源自丝状菌的质粒，例如，可以举出pAUR316。 这些质粒可以从市场上获得。
转化到微生物中的编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA优选与能 够在微生物中表达的启动子可操作地连结。
启动子只要在微生物中使所连结的改变型脂肪酶或其突变体表达 就没有限定。在微生物为大肠杆菌的情况下，优选trp启动子、1ac启动 子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等，在微生物为 酵母的情况下，优选PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启 动子、GAL1启动子等。在微生物为丝状菌的情况下，优选葡糖淀粉酶 基因的启动子、α-淀粉酶基因的启动子、醇脱氢酶I基因的启动子、烯 醇化酶基因的启动子等。
所谓与启动子可操作地连结是指在启动子的下游连结改变型脂肪 酶或其突变体，以使其在启动子的控制下生产改变型脂肪酶或其突变 体。
微生物的转化可以根据该技术领域中公知的方法进行。例如有电 穿孔法或在制成感受态细胞的微生物中通过钙法导入DNA的方法等。
本发明的改变型脂肪酶或其突变体的制造优选通过在培养基中培 养上述转化体并使上述改变型脂肪酶在培养基中和/或转化体中积累的 方法来进行。
用于培养转化体的培养基只要为该微生物繁殖的培养基就没有特 别限制，可以通过该技术领域中公知的方法进行培养。例如，在以葡 萄糖、蔗糖等糖类为碳源且含有铵盐、硝酸盐等无机氮源、或者酵母 提取物等有机氮源以及各种无机盐、维生素类等的培养液中，根据情 况也可以含有诱导剂（IPTG等）、选择剂（氨苄青霉素、氯霉素、羧 苄青霉素等抗生素等）等。培养条件（温度、时间、振荡、需氧或厌 氧）只要为微生物繁殖的条件就没有特别限定。
在培养基中分泌改变型脂肪酶或其突变体的情况下，编码改变型 脂肪酶或其突变体的DNA也可以与用于分泌的信号序列连结。信号序 列可以使用例如碱性磷酸酶、转化酶等信号序列。另外，也可以与用 于使纯化变得容易的标签序列，例如组氨酸标签序列、FLAG标签序列 等连结。另外，也可以在标签序列、信号序列与改变型脂肪酶或其突 变体之间连结切割序列，例如肽链内切酶的识别序列。
通过转化体生产的改变型脂肪酶或其突变体可以直接使用培养培 养基和/或培养转化体，也可以进一步进行纯化。从培养培养基和/或培 养转化体中的纯化可以根据现有的蛋白质的纯化方法使用例如色谱法 （凝胶过滤色谱法、亲合色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法等） 等来进行。
本发明的改变型脂肪酶或其突变体优选结合于不溶性载体而成的 固定化改变型脂肪酶或其突变体。
为了进行载体结合法（物理吸附法、离子结合法、共价结合法、 生化特异性结合法），载体例如可以列举：多糖（纤维素、琼脂糖等）、 无机物质（多孔玻璃、金属氧化物等）、合成高分子（聚丙烯酰胺化 合物、聚苯乙烯树脂、离子交换树脂等）。为了进行交联法，例如可 以列举：OHC-(CH2)3-CHO（戊二醛）、O=N=C-(CH2)3-C=N=O。为了 进行包埋法，例如可以列举：多糖（褐藻酸、卡拉胶等）、聚丙烯酰 胺化合物、ENT、PU、尼龙。
改变型脂肪酶或其的突变体向载体的固定化可以根据用于蛋白质 的现有的固定化方法进行。
本发明中使用的微生物、重组DNA、突变体制作、PCR、表达、 培养、纯化，固定化等实验技术对于本领域从业人员是众所周知的， 详细记载于一般的教科书（例如，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，second edition（Sambrook et al.，1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press；（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（F.M.Ausubel et a1.，eds.，1987and annual updates）；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS（Innis et al.，1990.Academic Press，San Diego，CA）； PCR：THE POLYMERASE CHAIN REACTION（Mullis et al.，eds.， 1994）；MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOY AND BIOTECHNOLOGY，Second Edition（A.L.Demain，et al.，eds.1999）； 及BIOTECHNOLOGY：A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，（Thomas D.Brock）Second Edition（1989）Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass等）中。
氨基甲酸酯化反应中的本发明的改变型脂肪酶或其突变体的使用 是指通过本发明的改变型脂肪酶或其突变体进行氨基甲酸酯化反应。 优选改变型脂肪酶或其突变体被固定化。
如下述反应式（A）所示，氨基甲酸酯化反应是指使胺化合物与碳 酸酯化合物形成氨基甲酸酯键的反应。
反应式（A）：
（式中，R表示可以具有氢原子或取代基的烃基）。
胺化合物只要通过与碳酸酯化合物反应合成氨基甲酸酯化合物就 没有特别限定，在本发明中，优选使用单胺化合物或二胺化合物。更 优选使用脂肪族单胺化合物或脂肪族二胺化合物。脂肪族胺表示直链 状烃的氢原子取代为氨基、-NH2得到的化合物。
单胺化合物优选使用通式（I）所示的化合物。
通式（I）：
R1-(CH2)n-NH2
（式中，R1为可以具有取代基的C1～20直链或支链烷基、可以具有 取代基的C2～20直链或支链烯基、可以具有取代基的C2～20直链或支链炔 基、可以具有取代基的C4～24环烷基烷基、可以具有取代基的C7～21芳烷 基或可以具有取代基的C3～20环烷基，n为0或1）。
R1中的可以具有取代基的C1～20直链或支链烷基可以列举：甲基、 乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、 正癸基、正十一烷基、正十二烷基、异丙基、异丁基或叔丁基等。优 选C1～12直链或支链烷基，更优选甲基、乙基、正丙基、正丁基、正己 基、正十二烷基、异丙基或叔丁基。
R1中的可以具有取代基的C2～20直链或支链烯基可以列举：烯丙基、 1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基或异丙烯基等。优选C2～12直链或支链烯 基，更优选烯丙基。
R1中的可以具有取代基C2～20直链或支链炔基，可以列举：乙炔基、 炔丙基、丁炔基或1-甲基-2-丙炔基等。优选C2～12直链或支链炔基，更 优选乙炔基或炔丙基。
R1中的可以具有取代基的C3～20环烷基为可以取代有C1～4直链烷基 的单环或多环脂环式烃基，可以列举：环丙基、环丁基、环戊基、环 己基、双环[2.2.1]庚基、甲基环己基、二甲基环己基或乙基环己基等。 优选C3～12环烷基，更优选环己基或双环[2.2.1]庚基。在此，C1～4的直链 烷基可以列举：甲基、乙基、正丙基或正丁基等。
R1中的可以具有取代基的C4～24环烷基烷基为可以取代有上述所定 义的C3～20环烷基的C1～4直链烷基，可以列举例如环己基甲基、环己基 乙基、三甲基环己基甲基或降冰片基甲基等。优选取代有C3～10环烷基 的C1～4直链烷基即C4～14环烷基烷基，更优选环己基甲基。
R1中的可以具有取代基的C7～21芳烷基可以举出取代有C6～20芳基的 烷基。C6～20芳基为具有单环或多环的芳香环的基团，可以列举：苯基、 萘基、联苯基或联三苯基（例如，对联三苯基-4-基、间联三苯基-3-基） 等。另外，烷基的碳原子数为从芳烷基的碳原子数减去芳基的碳原子 数而得到的数目。由此，C7～21芳烷基可以列举：苄基、苯乙基、萘基 甲基或间联三苯基-3-基-甲基等，优选C7～13芳烷基，更优选苄基。另外， 作为R1列举的基团包含各种异构体。
作为上述R1列举的基团可以具有进一步的取代基。作为R1中的进 一步的取代基，例如可以列举：卤素原子（氟原子、氯原子、溴原子 或碘原子）；甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基等C1～4的烷氧基；二甲 基氨基、二乙基氨基或二丙基氨基等双取代有C1～6烷基的二烷基氨基； 氰基；硝基；乙酰基；及R1为芳烷基时直接键合于苯环的氨基等。
如上所述，R1优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔 丁基、正己基、正十二烷基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氰基甲 基、硝基甲基、氟乙基、三氟乙基、三氯乙基、氰基乙基、硝基乙基、 甲氧基乙基、乙氧基乙基或叔丁氧基乙基等可以具有取代基的、C1～12直链或支链烷基、C3～12环烷基、C4～14环烷基烷基、苄基、氟苄基、氯 苄基、溴苄基、碘苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、硝基苄基、二 硝基苄基或氰基苄基；及氨基苄基等可以具有取代基的C7～13的芳烷基， 特别优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正己基、 正十二烷基、环己基、环己基甲基或苄基。
如上所述，通式（1）所示的单胺化合物特别优选为正己胺化合物、 正十二烷基胺化合物、环己基甲基胺化合物或苄基胺化合物。
二胺化合物优选使用通式（II）所示的化合物。
通式（II）：
H2N-(CH2)m-R3-(CH2)p-NH2
（式中，R3为可以具有取代基的C1～20直链或支链亚烷基、可以具 有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直链亚烷基、可以具有 取代基的C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚烷基、可以具有取代 基的C3～20环亚烷基或可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷 基，m和p互相独立，为0或1）。
R3中的可以具有取代基的C1～20直链或支链亚烷基，可以列举：亚 甲基、亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基、正亚庚 基、正亚辛基、正亚壬基、正亚癸基或正亚十二烷基等直链亚烷基； 或2-甲基亚丙基、2-甲基亚己基、四甲基亚乙基等支链亚烷基。优选C1～20直链亚烷基，更优选亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚 己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基或亚十二烷基。
R3中的可以具有取代基的C3～20环亚烷基为单环或多环的烃基，可 以列举：可以取代有C1～4直链烷基的环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、 环亚己基或双环[2.2.1]庚烷-2,6-二基。优选C3～12环亚烷基，更优选环亚 己基或双环[2.2.1]庚烷-2,6-二基。
R3中的可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直 链亚烷基中的C1～4直链亚烷基，可以列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基或 亚丁基。C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直链亚烷基可以列举：亚 甲基-环亚戊基-亚甲基、亚乙基-环亚戊基-亚乙基或亚甲基-环亚己基- 亚甲基等。优选C1～4直链亚烷基-C3～12环亚己基-C1～4直链亚烷基，更优 选亚甲基-环亚己基-亚甲基。
R3中的可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基，优选取 代有C1～4直链亚烷基-C1～4直链烷基的C3～12环亚烷基，更优选亚甲基-三 甲基环亚己基。
R3中的可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链 亚烷基优选C1～4直链亚烷基-亚苯基-C1～4直链亚烷基，更优选亚二甲苯 基。另外，这些基团包含各种异构体。
R3中的烃基可以具有进一步的取代基。作为R3中的进一步的取代 基，可以举出与R1中的烃基的取代基相同的基团。另外，在R3为C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚烷基的情况下，R3中的取代基可以 举出直接键合于亚芳基的芳香族碳原子的伯氨基。
如上所述，R3优选为C1～20直链或支链亚烷基、C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直链亚烷基、C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚 烷基、C3～20环亚烷基或C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基；更优选为C1～12直链亚烷基、C1～4直链亚烷基-C3～12环亚烷基-C1～4直链亚烷基、C1～4直 链亚烷基-亚苯基-C1～4直链亚烷基、C3～12环亚烷基或取代有C1～4直链亚 烷基-C1～4直链烷基的C3～12环亚烷基；特别优选为亚甲基、亚乙基、亚 丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、 亚十二烷基、环亚己基、亚甲基-三甲基环亚己基、环亚己基二亚甲基 或亚二甲苯基。
本发明的二胺化合物优选可以得到作为二异氰酸酯的原料的双氨 基甲酸酯化合物的化合物。在本发明中，更优选选自1,6-六亚甲基二胺 化合物、1,12-十二亚甲基二胺化合物、异佛尔酮二胺化合物、1,3-双(氨 基甲基环己烷)、1,4-双(氨基甲基环己烷)、4,4’-亚甲基双(环己烷胺化合 物)、2,5-双(氨基甲基)双环[2,2,1]庚烷、2,6-双(氨基甲基)双环[2,2,1]庚 烷、1,3-双(氨基甲基)苯、1,4-双(氨基甲基)苯中的至少一种。
本发明的碳酸酯化合物优选使用通式（III）所示的化合物。
通式（III）:
（式中，R2表示可以具有取代基的烃基，R2可互相独立地形成环。）
在通式（III）中，R2的可以具有取代基的一价烃基可以举出与通 式（1）中所定义的R1相同的基团。作为R2中的烃基，优选为甲基、乙 基、正丙基、异丙基或正丁基等C1～20、优选C1～6直链或支链烷基，特 别优选的基团为甲基或乙基。
上述R2中的烃基也可以具有进一步的取代基。作为进一步的取代 基，例如可以列举：卤素原子（氟原子、氯原子、溴原子或碘原子）； 甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基等C1～4烷氧基；二甲基氨基、二乙基 氨基或二丙基氨基等双取代有C1～4的烷基的二烷基氨基；氰基或硝基。
如上所述，通式（III）所示的碳酸酯化合物优选为碳酸二甲酯化 合物或碳酸二乙酯化合物。
本发明的反应可以使用有机溶剂或在无溶剂下进行。有机溶剂只 要为能够溶解胺化合物和碳酸酯化合物且不会使改变型脂肪酶或其突 变体失活的溶剂就没有特别限定，优选饱和环状烃、不饱和环状烃类、 非环状醚类或它们的混合溶剂。
饱和环状烃类溶剂可以列举：环戊烷、环己烷、环庚烷或异丙基 环己烷等C5～10非取代环烷烃类；氯代环戊烷或氯代环己烷等取代有卤 素的C5～10环烷烃类等。优选为C5～10非取代环烷烃类，更优选为环己烷。
不饱和环状烃类溶剂可以列举：苯、甲苯、二甲苯或均三甲苯等 芳香族烃类；环戊烯或环己烯等C5～10环烯烃类等。优选为芳香族系烃 类，更优选为甲苯或二甲苯。
作为非环状醚，可以列举脂肪族醚类、例如二乙醚、叔丁基甲基 醚或二异丙基醚等C2～8二烷基醚类；环戊基甲基醚或环戊基乙基醚等 C5～18环烷基烷基醚类；苄基苯基醚、苄基甲基醚、烷基苯基醚、二苯 基醚、二(对甲苯基)醚或二苄基醚等C7～18芳香族醚类等。优选为脂肪族 醚类或者芳香族醚类，更优选为二异丙基醚或苯甲醚。这些有机溶剂 可以单独使用或混合使用两种以上。
上述有机溶剂的使用量相对于1g单胺化合物或二胺化合物，优选 为1～200mL，更优选为1～50mL，特别优选为1～20mL。
如下述反应式（B）和（C）所示那样，本发明的氨基甲酸酯化反 应例如混合单胺化合物或二胺化合物、碳酸酯化合物、有机溶剂和改 变型脂肪酶或其突变体（优选固定化改变型脂肪酶或其突变体），一 边搅拌一边进行反应。或者利用在填充了固定化改变型脂肪酶或其突 变体的柱中，使含有单胺化合物或二胺化合物以及碳酸酯化合物的有 机溶剂通过的流通连续式等方法来进行。
在以流通连续式进行反应的情况下，反应溶液中的单胺化合物或 二胺化合物的浓度优选设为相对于反应体系的总质量为10～50质量%。 另外，反应液的通液线速度优选为0.5～400mm/分钟，进一步优选为1～ 200mm/分钟。该通液线速度（mm/分钟）是指由每分钟的送液量（mm3/ 分钟）（或称为送液速度（10-3mL/分钟））除以填充层剖面面积（mm2） 而得到的商所表示的值。随着填充塔内压力因通液线速度提高而增大， 液体通过变得困难，需要高耐压性的酶填充塔，除此以外，有时也会 发生固定化酶因塔内压力的增加而破碎的情况，因此通液线速度优选 设为400mm/分钟以下。另外，从生产率的方面考虑，通液线速度优选 设为1mm/分钟以上。固定化酶的表达活性根据通液线速度发生变化， 因此，通过选择最适的通液线速度确定反应条件，可以进行符合所期 望的生产能力、制造成本的反应。反应容器中的反应溶液的流通时间 可以设为30秒～6小时的范围。
反应式（B）：
（式中，R1、R2、m、n与上述的意义相同。）
反应式（C）：
（式中，R2、R3、m、n、p与上述的意义相同。）
本发明的反应中的温度只要为改变型脂肪酶或其的突变体不会失 活的温度就没有特别限制，为了收率良好地得到所期望的氨基甲酸酯 化合物，优选30℃～120℃，更优选60℃～90℃，特别优选65℃～90℃。 另外，批式反应中的反应压力没有特别限制，优选在常压下或减压下 进行。批式反应时的反应时间没有特别限定，优选0.5小时～120小时， 更优选为0.5小时～72小时。
本发明的反应优选根据使用的各改变型脂肪酶或其突变体的特性 在其不会失活的范围内进行。
在本发明中，反应通常为非均相体系，在催化剂可再利用且后处 理简便的方面有利。即，反应结束时通过过滤除去催化剂，浓缩所得 到的滤液，由此能够得到产物。另外，也可以通过对所得到的滤液进 行晶析操作而得到产物。
用于本发明反应的制造装置没有特别限制，例如可以列举：反应 容器、加热（冷却）装置等一般的制造装置。优选本发明的改变型脂 肪酶或其突变体被固定化于载体、作为固定床内装于反应容器的装置。 因此，本发明的反应优选为包括使单胺化合物或二胺化合物与碳酸酯 化合物通过该反应容器的工序的反应。
而且，通过本发明的制造方法得到的通式（IV）所示的单氨基甲 酸酯化合物或通式（V）所示的双氨基甲酸酯化合物也可以通过蒸馏、 分液、提取、晶析、重结晶和柱层析法等一般的方法进一步纯化。
通式（IV）：
（式中，R1、R2、n与上述的意义相同。）
通式（V）：
（式中，R2、R3、m、p与上述的意义相同。）
通过本发明的制造方法得到的单氨基甲酸酯化合物、双氨基甲酸 酯化合物使用本发明的改变型脂肪酶或其的突变体制造。因此，现有 的氨基甲酸酯化合物制造方法中可能引起的在制品中混入金属盐或卤 化物等杂质的可能性极低，可以得到化学上更安全的制品。
氨基甲酸酯化反应中的本发明的改变型脂肪酶或其突变体的使用 是指通过本发明的改变型脂肪酶或其突变体进行氨基甲酸酯化反应。 改变型脂肪酶或其的突变体优选被固定化。
下面，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不受这些实施例 任何限定。
[实施例1]
源自Candida antarctica的脂肪酶B（野生型、序列编号1）的通过酵 母的表达
1）编码源自酵母转化酶（SUC2）的信号序列（序列编号6）的DNA 片段的扩增
为了将源自SUC2的信号序列（序列编号6的核酸序列和序列编号7 的氨基酸序列）克隆至酵母表达用载体，使用下面两种引物，即SUC2-F （序列编号8）：5’-gggaatattaagcttggtaccatgcttttgcaagctttccttttc-3’（无下 划线的部分为与pYES2/CT载体相同的序列，下划线部分为编码SUC2 信号序列的N末端侧的碱基序列）和SUC2-R（序列编号9： 5’-tgctggatatctgcagaattctgcagatattttggctgcaaaac-3’（无下划线部分为与 pYES2/CT载体相同的序列，下划线部分为编码SUC2信号序列的C末端 侧的碱基序列），通过PCR进行DNA片段的扩增。以Saccharomyces cerevisiae S288C（啤酒糖酵母S288C）株（Open Biosystems公司制）的 染色体DNA作为模板，使用KOD Plus（东洋纺公司制）在94℃加热5 分钟之后，进行94℃15秒、54℃30秒、68℃18秒的循环30次。引物等 寡核苷酸可以由株式会社FASMAC获得。
2）pYES2/CT载体的利用限制酶的线性化
在GAL1启动子下游的位置用限制酶Kpn I（东洋纺公司制）切割 （37℃、5小时）pYES2/CT载体（Invitrogen公司制）。切割后的DNA 片段使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN公司制）进行纯化。将 KPnI切割后的DNA片段进一步使用限制酶EcoR I（东洋纺公司制）进 行切割（37℃、16小时），使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN 公司制）纯化DNA片段。由此得到线性化的pYES2/CT载体。
3）编码源自SUC2的信号序列的DNA片段向载体的克隆
向1）中得到的PCR产物5μL中加入利用同源序列的克隆法即 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer（Clontech公司 制）中所附带的Cloning Enhancer2μL，在37℃处理15分钟后，在80℃ 进行15分钟的处理，得到Cloning Enhancer处理PCR产物。按照试剂盒 中所附的方法使所得到的Cloning Enhancer处理PCR产物与2）中得到的 线性化的pYES2/CT载体进行反应（在37℃反应15分钟之后，在50℃反 应15分钟）。反应后，加入TE缓冲液40μL进行稀释，然后使用一部分 液体（2.5μL）对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制） 50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB 琼脂培养基，在37℃培养16小时。从得到的菌落中分离菌，在含有 50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。 对得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号6）。将得到 的导入有源自SUC2的信号序列的载体称为pYES2/CT-SUC2sig。
4）编码源自Candida antarctica的脂肪酶B基因（序列编号5）的DNA 片段的扩增
为了将编码源自Candida antarctica的脂肪酶B（CALB）基因（序列 编号5）的DNA片段克隆至作为表达载体的pYES2/CT-suc2sig，使用以 下两种引物：SUC2-mCALBf（序列编号10）： 5’-gccaaaatatctgcactaccttccggttcggac-3’（无下划线部分为与编码SUC2信 号序列的C末端侧的碱基序列相同的序列，下划线部分为编码成熟型 CALB的N末端侧的碱基序列）和CalBterminal-r（序列编号11）： 5’-cttaccttcgaagggccctctagactcgagtcagggggtgacgatg-3’（无下划线部分为 与pYES2/CT-SUC2sig相同的序列，下划线部分为编码成熟型CALB的C 末端侧的碱基序列），通过PCR进行DNA片段扩增。以克隆有CALB 基因（购入在（株）Takara-bio通过定制合成序列编号5的序列的DNA、 所克隆得到的质粒）的载体为模板，使用KOD Plus（东洋纺公司制） 在94℃加热2分钟之后，进行94℃15秒、55℃30秒、68℃60秒的循环30 次。
5）pYES2/CT-SUC2sig载体的利用限制酶的线性化
通过限制酶EcoR I（东洋纺公司制）切割（37℃、15小时）pYES2/CT －SUC2sig载体。切割后的DNA片段使用QIAquick Gel Extraction Kit （QIAGEN公司制）进行纯化。将EcoR I切割后的DNA片段进一步通过 限制酶Xba I（东洋纺公司制）进行切割（37℃、16小时），使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN公司制）纯化DNA片段。由此得到线性化 pYES2/CT-SUC2sig载体。
6）源自Candida antarctica的脂肪酶B基因向pYES2/CT-SUC2sig载 体的克隆
向4）中得到的PCR产物5μL中加入In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer（Clontech公司制）中所附带的Cloning Enhancer2μL，在37℃处理15分钟后，在80℃处理15分钟，得到Cloning Enhancer处理PCR产物。按照试剂盒中所附的方法使所得到的Cloning Enhancer处理PCR产物与5）中得到的线性化pYES2/CT-SUC2sig载体进 行反应（在37℃反应15分钟后，在50℃反应15分钟）。反应后，加入 TE缓冲液40μL进行稀释，然后使用一部分液体（2.5μL）对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全 部量涂布于含有50μg/L羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小 时。从得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培 养基中培养16小时后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。对所得到的质粒分析碱基序列， 确认为目标序列（序列编号5）。将所得到的导入有源自SUC2的信号 序列的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB（图1））。
7）利用pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的酵母的转化和野生型 CALB表达
向酵母的转化使用S.cerevisiae Direct Transformation Kit Wako（和 光纯药公司制），按照试剂盒说明书进行。将酵母S.cerevisiae BY4742 株（由Open Biosystems，Inc.购买）以OD600=0.01的方式悬浮在YPD 液体培养基（1%yeast extract(酵母提取物)，2%peptone(蛋白胨)，2% glucose(葡萄糖)）中，取1mL在30℃、180rpm培养27.5小时。制备转化 液（在试剂盒所附带的Sc Tansformation Reagent20μ1中加入试剂盒所 附带的Carrier DNA2μl和1μg质粒DNA而成），在42℃保温2小时。制 备含有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体和酵母培养液的混合液，进行转 化。将转化液涂布于SC-Ura琼脂培养基（0.67%yeast nitrogen base(酵 母氮源)（不含氨基酸）、2%葡萄糖、0.01%（腺嘌呤(adenine)、精氨 酸(arginine)、半胱氨酸(cysteine)、亮氨酸(leucine)、赖氨酸(lysine)、 苏氨酸(threonine)、色氨酸(tryptophan)）、0.005%（天冬氨酸(aspartic acid)、组氨酸(histidine)、异亮氨酸(isoleucine)、甲硫氨酸(methionine)、 苯丙氨酸(phenylalanine)、脯氨酸(proline)、丝氨酸(serine)、酪氨酸 (tyrosine)、缬氨酸(valine)）、2%琼脂(agar)、pH5.6）后，在30℃培 养3天，得到转化后的酵母菌落。
将载有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母接种于5mL的 SC-Ura液体培养基，在30℃、200rpm培养16小时。将得到的预培养液 加入到100mL的表达用YPD液体培养基（1%酵母提取物，4%蛋白胨， 2%葡萄糖）中，使用500mL的坂口烧瓶（Sakaguchi flask）在20℃、130rpm 的条件下培养3天。加入YG溶液（20%酵母提取物，40%半乳糖）2mL， 直接在20℃、130rpm的条件下培养3天。离心分离培养液之后，回收上 清液，通过下述所示的方法测定培养上清液中的酶活性（酯化合物分 解活性）。
将560μL的底物溶液（50mM Tris-HC1，1%DMSO，2.1mM对硝基 苯丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate)，pH7.0）放入比色皿并在25℃预保温 3分钟。接着加入培养上清液140μL并搅拌，利用分光光度计经时测定 405nm的吸光度，算出反应的初始速度。其结果，在载有 pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母中确认到高的酯化合物分 解活性（图2）。
8）脂肪酶的纯化
在10mL的SC-Ura液体培养基中接种菌，在30℃、180rpm的条件下 振荡培养一晩（16小时）。在2L的带挡板的烧瓶中准备的YPD培养基 （1%酵母提取物，4%胰蛋白胨，2%葡萄糖）500mL加入预培养液10mL， 在30℃、95rpm的条件下振荡培养8小时。添加20%酵母提取物25mL和 40%半乳糖25mL，在20℃、95rpm的条件下振荡培养3天（约72小时）， 诱导表达。通过离心分离（8000g、10分钟）回收培养上清液之后，使 培养上清液通过用20mM Tris-HC1缓冲液（pH7.5）平衡化的 Butyl-TOYOPEARL650M（东曹制），使脂肪酶吸附于载体。用相同 缓冲液清洗后，使用含有50%（v/v）EtOH的20mM Tris-HCl缓冲液 （pH7.5）洗脱脂肪酶。使洗脱液通过用20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5） 平衡化的SuperQ-650S（东曹制），回收直接通过后的溶液。
使用离心式超滤过滤器（Amicon（注册商标）Ultra-15Centrifugal Filter Devices、10000MWCO、Millipore制）将含有脂肪酶的溶液浓缩 至1.0mL之后，加入20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）10mL并混合，进 一步浓缩至1.0mL。合计实施该操作三次，得到将溶剂置换为缓冲液的 脂肪酶浓缩液。使脂肪酶浓缩液通过用20mM Tris-HC1缓冲液（pH7.5） 平衡化的SuperQ-650S（东曹制），将直接通过后的溶液作为纯化脂肪 酶溶液。
9）脂肪酶固定化酶的制备
在试管中准备作为载体的离子交换树脂的Lewatitt VPOC l600 （LANXESS公司制）0.60g，加入3mL的乙醇并搅拌之后，使用移液器 除去乙醇。加入蒸馏水3mL并搅拌之后，同样地除去水。进一步进行 两次水洗，加入到1.5mg/mL的纯化脂肪酶溶液6mL（20mM Tris-HCI 缓冲液、pH7.0）中，在10℃、180rpm的条件下搅拌19小时。分离溶液 和载体之后，将回收的载体用3mL的蒸馏水清洗，然后进行减压干燥 16小时，得到载体重量比担载酶量3wt%的固定化酶。
在固定化处理前后，通过BCA法（标准蛋白BSA）测定脂肪酶溶 液中的蛋白质浓度，将因固定化处理减少的蛋白量作为向载体的固定 化蛋白量，将除以所得到的固定化酶重量而得到的量作为酶担载量。
[实施例2]
Q193E改变型脂肪酶（序列编号2）的制作
1）Q193E突变的导入
为了构建Q193E改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB载 体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东 洋纺公司制），按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
以下面两种引物CalB-Q193E-F（序列编号12）： 5’-CCTGAGGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下划线 部分为相当于Q193E突变的序列）和CalB-Q193E-R（序列编号13）： 5’-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’为模板，使用 pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体进行突变导入反应（在94℃加热2分钟 钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。在反应液20μL中加入 限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分 反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司 制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的 LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取 质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号14）。 将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E。
2）酵母转化、Q193E改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制 备
与实施例1的7）～9）中记载的方法同样地进行。
[实施例3]
W104F改变型脂肪酶（序列编号3）的制作
1）W104F突变的导入
为了构建W104F改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB 载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit （东洋纺公司制），按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
以下面两种引物CalB-W104F-F（序列编号15）： 5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相 当于W104F突变的序列）和CalB-W104F-R（序列编号16）： 5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’为模板，使用 pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体进行突变导入反应（在94℃加热2分钟 之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。向反应液20μL中加入 限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分 反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司 制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的 LB琼脂培养基上，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在 含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取 质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号17）。 将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F。
2）酵母转化、W104F改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制 备
与实施例1的7）～9）中记载的方法同样地进行。
[实施例4]
W104F/Q193E改变型脂肪酶（序列编号4）的制作
1）W104F/Q193E突变的导入
为了构建W104F/Q193E改变型脂肪酶，对于 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行位点突变导入。位点突变 导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制），按照所附的手 册中记载的方法进行突变导入操作。
以下面两种引物CalB-W104F-F（序列编号15）和Ca1B-W104F-R （序列编号16）为模板，使用pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体 进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分 钟的循环10次）。向反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反 应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL）对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全 部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16 小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液 体培养基中培养16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号18）。 将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E。
2）酵母转化、W104F/Q193E改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化 酶的制备
与实施例1的7）～9）中记载的方法同样地进行。
[实施例5]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸 酯化合物和作为单胺化合物的正己胺合成氨基甲酸酯化合物的活性进 行评价。
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的 玻璃制容器中加入正己胺200mg（1.97mmol）、碳酸二甲酯0.536g （5.95mmol）、作为内标物质的四乙二醇二甲醚20.0mg，然后加入甲 苯并定容至2.0m1，向得到的反应液中混合实施例1～4中制备的固定化 脂肪酶（担载酶量3wt%）10.0mg，一边搅拌一边在70℃反应24小时。 反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl甲醇并过滤，将1.0μl供于气 相色谱分析（图3A）。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对 产物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
色谱柱：DB-530m×0.25mmID0.25μm
柱温：80℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
进样室（INJ）：200℃，检测器（DET）：FID在250℃
载气（Carrier Gas）：He，线速度30cm/sec
分流比（Sprit ratio）50：1，进样量：1.0μ
保留时间：四乙二醇二甲醚：12.3min，
正己胺：3.15mim
氨基甲酸正己酯：8.84min
结果
[表1]
如上述表1和图3B所示，Q193E改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相 比，氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约1.5倍（反应时间3、6、8h）。 另一方面，W104F改变型脂肪酶与野生型脂肪酶活性基本相同。令人 惊讶的是，与野生型脂肪酶相比，W104F/Q193E改变型脂肪酶的氨基 甲酸酯化合物的合成活性提高约2.0倍（反应时间3、6、8h）。
[实施例6]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸 酯化合物和作为二胺化合物合成的1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC） 合成的氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的 玻璃制容器中加入1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC）200mg （1.41mmol）、碳酸二甲酯760mg（8.43mmol）、作为内标物质的十 四烷20.0mg，然后加入甲苯并定容至2.0ml，向得到的反应液中混合实 施例1～4中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10.0mg，一边搅拌 一边在70℃反应48小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl的 DMF并进行过滤，将1.0μl供于气相色谱分析。反应收率由产物标准品 和内标比的校准曲线对产物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
色谱柱：DB-530m×0.25mmID0.25μm
柱温：80℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
INJ：200℃DET：FID在250℃
载气：He，线速度30cm/sec
分流比50：1，进样量：1.0μ
保留时间：十四烷：11.0min，
1,3BAC-单氨基甲酸酯（异构体混合物）：14.9min，
1,3BAC-二氨基甲酸酯（异构体混合物）：18.9、19.2min，
结果
[表2]
如上述表2和图4所示，与野生型脂肪酶相比，Q193E改变型脂肪酶 的氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约1.5倍（反应时间24、48h）。另 一方面，相对于本底物，W104F改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比， 合成活性稍微降低。令人惊讶的是，与野生型脂肪酶相比， W104F/Q193E改变型脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约2.0 倍（反应时间24、48h）。
[实施例7]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸 酯化合物和作为二胺化合物的1,12-二氨基十二烷合成氨基甲酸酯化合 物的活性进行评价。
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的 玻璃制容器中加入1,12-二氨基十二烷200mg（1.0mmol）、碳酸二甲酯 540mg（6.0mmol），然后加入甲苯并定容至2.0ml，向得到的反应液中 混合实施例1～4中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10mg，一边 搅拌一边在70℃反应44小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl 甲醇以停止反应。接着，通过离心浓缩器进行减压浓缩，然后加入甲 醇1.0ml使其溶解，然后利用0.45μm过滤器过滤并供给HPLC分析。反 应收率根据预先由产物标准品的峰面积制作的校准曲线，对产物量进 行定量来算出。
HPLC分析条件
色谱柱（Column）：Inertsil ODS-3V4.6mm×250mm（GLScience Inc）
流动相（Mobile Phase）：MeOH/H2O（20mM KH2PO4pH7.0）=70/30
流速（Flow Rate）：1.0ml/min
检测器（Detecter）：RI
柱温（Column Temp）：40℃
进样体积（Injection Vol.）10μl
保留时间：DMD-二氨基甲酸酯：17.4min，
结果
[表3]
如上述表3和图5所示，与野生型脂肪酶相比，Q193E改变型脂肪酶 的二氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约2倍（反应时间20、44h）。 另一方面，相对于本底物，W104F改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比， 合成活性稍微降低。令人惊讶的是，与Q193E改变型脂肪酶相比， W104F/Q193E改变型脂肪酶的二氨基甲酸酯化合物的合成活性提高。
[实施例8]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸 酯化合物和作为二胺化合物的苯二甲基二胺（XDA）合成氨基甲酸酯 化合物的活性进行评价。
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的 玻璃制容器中加入苯二甲基二胺化合物200mg（1.46mmol）、碳酸二甲 酯0.79g（8.81mmol）、作为内标物质的十四烷20.0mg，然后加入甲苯 并定容至2.0ml，向得到的反应液中混合实施例1～4中制备的固定化脂 肪酶（担载酶量3wt%）10mg，一边搅拌一边在70℃反应24小时。反应 中，经时采集反应液50μl，加入150μl DMF并过滤，将1.0μl供于气相色 谱分析。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对产物量进行定 量来算出。
气相色谱分析条件
色谱柱：DB-530m×0.25mmID0.25μm
柱温：80℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
INJ：200℃DET：FID在250℃
载气：He，线速度30cm/sec
分流比50：1、进样量：1.0μ
保留时间：十四烷：11.0min，
XDA-单氨基甲酸酯：15.5min，
XDA-二氨基甲酸酯：19.6min，
结果
[表4]
如上述表4和图6所示，在以作为二胺化合物的苯二甲基二胺化合 物为底物的情况下，与野生型相比，Q193E改变型脂肪酶和W104F改变 型脂肪酶的二氨基甲酸酯化合物的合成活性提高3倍左右，进而，作为 双重改变体的W104F/Q193E改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，确认 活性提高5倍以上。
[实施例9]
Q193D（序列编号19和35）、L278R（序列编号21和37）、L278K （序列编号22和38）和A283V（序列编号60和61）改变型脂肪酶的合 成
1）改变的导入
为了构建各改变型脂肪酶，相对于实施例1中制作的 pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体（图1）进行位点突变导入。位点突变 导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制），按照所附的手 册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下表5中记载的引物（下划线部分为相当于突变的序列）进行 突变导入反应（在94℃加热2分钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循 环10次）。
[表5]
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时培养之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有改变 的载体分别称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193D、 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278R、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K 及pYES2CT/SUC2sig/mCALB-A283V。
2）酵母转化、Q193D、L278R、L278K和A283V改变型脂肪酶的 表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例10]
Q193E/L278R改变型脂肪酶（序列编号23和39）的合成
1）突变的导入
为了构建Q193E/L278R改变型脂肪酶，对于实施例2中制作的 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行位点突变导入。位点突变 导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册 中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Rf（序列编号53）：5’-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTC-3’（下划线部分为相当于L278R 突变的序列）和CalB-L278r（序列编号54）： 5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃ 加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。在反应液 20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得 到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧 苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分 离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时后， 使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System （Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278R。
2）酵母转化、Q193E/L278R改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化 酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例11]
Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号28和44）的合成
1）改变的导入
为了构建改变型脂肪酶，首先对于实施例9中制作的 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行L278K位点突变导入。位点 突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的 手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Kf（序列编号55）： 5’-CTCAAGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下划线部分为 相当于L278K突变的序列）和CalB-L278r（序列编号56）：5’ -CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃加 热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278K。
接着，为了导入W104F突变，对于 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278K载体进行位点突变导入。位 点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附 的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-W104Ff（序列编号15）：5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相当于W104F 突变的序列）和Ca1B-W104r（序列编号16）： 5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’进行突变导入反应（在94℃加 热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278K。
2）酵母转化、W104F/Q193E/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和 固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例12]
Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号30和46）的合成
1）改变的导入
为了构建改变型脂肪酶，首先对于实施例9中制作的 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K载体进行W104F位点突变导入。位 点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附 的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即Ca1B-W104Ff（序列编号15）： 5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相 当于W104F突变的序列）和CalB-W104r（序列编号16）： 5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’进行突变导入反应（在94℃加 热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-WF104F/L278K。
接着，为了导入Q193D突变，相对于 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278K载体进行位点突变导入。位 点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附 的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-Q193Df（序列编号51）： 5’-CCTGACGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下划线 部分为相当于Q193D突变的序列）和CalB-Q193r（序列编号52）： 5’-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’进行突变导入反应（在94℃加热 2分钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μl），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193D/L278K。
2）酵母转化、W104F/Q193D/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和 固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例13]
Q193E/W104F/L278R/A283V突变型脂肪酶（序列编号31和47）的 合成
1）改变的导入
为了构建各改变型脂肪酶，对于实施例4中制作的 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E载体进行位点突变导入。位 点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附 的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278R/A283Vf（序列编号59）： 5’-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGTAGCCATCGTG-3’（下划线部分分 别为相当于L278R突变和A283V突变的序列）和CalB-L278r（序列编号 54）：5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’，进行突变导入反应 （在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。 在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过 该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞 （Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有 50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到 的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养 16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purificatien System （Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278R/A283V。
2）酵母转化、W104F/Q193E/L278R/A283V改变型脂肪酶的表达、 纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例14]
使用实施例9～13中制备的改变型脂肪酶 （W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、 W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V）， 与实施例5同样地对由碳酸酯化合物（碳酸二甲酯）和单胺化合物（正 己胺化合物）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
结果
[表6]
为了比较，野生型～W104F/Q193E记载了实施例5的表1的数据。
如上述表6和图7所述，W104F/Q193E/L278R/A283V、 W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改变型脂 肪酶与Q193E改变型脂肪酶相比，反应3、6、8小时的收率明显较高， 确认到反应速度进一步提高。
W104F/Q193E/L278R/A283V改变型脂肪酶的反应3小时的收率比 野生型脂肪酶高约4倍。
[实施例15]
使用实施例9～13中制备的改变型脂肪酶 （W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、 W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V）， 与实施例6同样地对由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的1,3-二氨基甲 基环己烷（1,3-BAC）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。其中， 实验条件在以下方面不同。
在实施例6中，使用含有2.0重量%水分的1,3-BAC，与此相对，在 实施例14中，使用含有0.03重量%水分的1,3-BAC。另外，通过卡尔·费 歇尔水分测定仪进行水分的测定。
结果
[表7]
如上述表7所示，W104F/Q193E/L278R/A283V、 W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改变型脂 肪酶与Q193E改变型脂肪酶相比，收率明显较高，确认到反应速度进一 步提高。特别是Q193E/L278R改变型脂肪酶的收率和反应速度提高显 著。
[实施例16]
使用实施例9～13制备的改变型脂肪酶 （W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、 W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V）， 与实施例8同样地对由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的苯二甲基二 胺（XDA）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
结果
[表8]
为了比较，野生型～W104F/Q193E记载了实施例8的表4的数据。
如上述表8所示，W104F/Q193E/L278R/A283V、 W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改变型脂 肪酶与Q193E改变型脂肪酶相比，确认到活性提高。但是， W104F/Q193E/L278R/A283V和W104F/Q193E改变型脂肪酶最高。显示 根据底物的不同，最适的改变型脂肪酶不同。
[实施例17]
使用实施例9～13中制备的改变型脂肪酶 （W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、 W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V）， 对由酯化合物和醇化合物进行酯交换的活性进行评价。
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的 玻璃制容器中加入正丁醇200mg（2.69mmol）、乙酸乙烯酯0.463g （5.38mmol）、作为内标物质的四乙二醇二甲醚20.0mg，然后加入甲 苯并定容至2.0ml，向得到反应液中混合实施例1和实施例9～13中制备 的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10.0mg，一边搅拌一边在30℃反应3 小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl丙酮并过滤，将1.0μl 供于气相色谱分析。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对产 物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
GC分析（GC-1700）
色谱柱：DB-170130m×0.25mm ID0.25μm
柱箱（Oven）：40℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
进样室：分流在250℃检测器：FID250℃
载气：He
线速度30cm/sec
分流比50：1
进样量：1.0μ
保留时间：四乙二醇二甲醚：17.3min
正丁基胺：3.2min
丙酸丁酯：5.6min
结果
[表9]
如上述表9所示，Q193E/L278R、L278R、L278K改变型脂肪酶较 野生型脂肪酶，确认到明显的反应速度提高。
[实施例18]
W104F/L278K改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建W104F/L278K（序列编号62和63）改变型脂肪酶，对于 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K载体进行位点突变导入。位点突变 导入使用KOD-Plus—Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册 中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-W104Ff（序列编号15）： 5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相 当于W104F突变的序列）和CalB-W104Fr（序列编号16）： 5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’进行突变导入反应（在94℃加 热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），ECOS E.coli DH5α感受态细 胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有 50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到 的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养 16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System （Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278K。
2）酵母转化、W104F/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化 酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例19]
Q193E/L278K改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建Q193E/L278K（序列编号24和40）改变型脂肪酶，对于 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行位点突变导入。位点突变 导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册 中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Kf（序列编号55）： 5’-CTCAAGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下划线部分为 相当于L278K突变的序列）和CalB-L278r（序列编号56）： 5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃ 加热2分钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System （Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278K。
2）酵母转化、Q193E/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化 酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例20]
Q193D/L278K改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建Q193D/L278K（序列编号26和42）改变型脂肪酶，对 pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K载体进行位点突变导入。位点突变 导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册 中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-Q193Df（序列编号51）： 5’-CCTGACGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下划 线部分为相当于Q193D突变的序列）和CalB-Q193r（序列编号52）： 5’-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’进行突变导入反应（在94℃加 热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System （Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193D/L278K。
2）酵母转化、Q193D/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化 酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例21]
W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建W104F/Q193E/L278R（序列编号27和43）改变型脂肪酶， 首先对pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E载体进行L278R位点 突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司 制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Rf（序列编号53）： 5’-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下划线部分为 相当于L278R突变的序列）和CalB-L278r（序列编号54）： 5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃ 加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用 通过该操作得到的一部分反应液（5μl），对ECOS E.coli DH5α感受态 细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含 有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得 到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培 养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System （Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变 的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278R。
2）酵母转化、W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶的表达、纯化和 固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例22]
使用实施例18～21中制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R、 W104F/L278K、Q193E/L278K、Q193D/L278K）与实施例5同样地对由 碳酸酯化合物（碳酸二甲酯）和单胺化合物｛正己胺化合物）合成氨 基甲酸酯化合物的活性进行评价。
结果
[表10]
为了比较，野生型～W104F/Q193E记载了实施例5的表1的数据， W104F/Q193E/L278R/A283V～A283V记载了实施例14的表6的数据。
如上述表10所示，W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶与野生型脂 肪酶相比，反应3、6、8小时的收率明显较高，确认到反应速度进一步 提高。
[实施例23]
对使用实施例18～21中制备的改变型脂肪酶 （W104F/Q193E/L278R、W104F/L278K、Q193E/L278K、 Q193D/L278K），与实施例15同样地由碳酸酯化合物和作为二胺化合 物的1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC）合成氨基甲酸酯化合物的活性 进行评价。与实施例14同样地使用含有0.03重量%水分的1,3-BAC。另 外，通过卡尔·费歇尔水分测定仪进行水分的测定。
结果
[表11]
为了比较，野生型～A283V记载了实施例15的表7的数据。
如上述表11所示，W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶与野生型脂 肪酶相比，收率明显较高，确认到反应速度提高。
[实施例24]
对使用实施例18～21制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R、 W104F/L278K、Q193E/L278K、Q193D/L278K）与实施例17同样地对 由酯化合物和醇化合物进行酯交换的活性进行评价。
结果
[表12]
为了比较，野生型～A283V记载了实施例17的表9的数据。
如上述表12所示，Q193D/L278K改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相 比，收率明显较高，确认到反应速度提高。
工业上的可利用性
本发明可以用于在工业上由碳酸酯化合物和胺化合物制造氨基甲 酸酯化合物。