技术领域
本发明涉及一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的引物、探针，以及包括该探针和引物的试剂盒，和使用该探针和引物进行检测的检测方法，属于分子检测领域。
背景技术
舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)，为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼,广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中。该菌可导致伤口感染、神经性肌膜炎，是急性腹泻的重要致病菌，严重的还会引起败血症，危及生命。在美国、欧洲及中国也发现了大量由舒伯特气单胞菌引起的食源性疾病的病例。
从2012年开始舒伯特气单胞菌相继在我国养殖的鳢科鱼类中分离报道，且在鳢科鱼类中带菌率很高，对鳢科鱼类具有较高的致病力和致死性。
细菌病病原的鉴定方法多为传统的分离纯化结合生化及分子生物学鉴定，但这种方法耗时长。而且，我们前期研究发现，携带舒伯特气单胞菌的鳢或者发病早期的鳢很难分离到细菌，阻碍了该病的发现和积极治疗，因此亟需建立快速、准确、灵敏的检测方法，给该病的早期预警提供技术支撑。
因此，建立一种快速、敏感、特异的检测和鉴定方法为鳢舒伯特气单胞菌病原的监测、早期预警、及控制，以及由舒伯特气单胞菌引起的食物中毒的早期诊断都具有重要的意义。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种特异、敏感、快速的检测鳢舒伯特气单胞菌的荧光定量PCR的引物和探针以及试剂盒和检测方法。
本发明通过以下方案达到上述目的：
在本发明的第一方面，提供一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的引物和探针。
一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的引物，所述引物包括：
rpoD-F：5′-AACATGCGCGAGATGATGGA-3′(SEQ ID NO:1)
rpoD-R：5′-CGCACTCGTTGTTGGTGAAG-3′(SEQ ID NO:2)。
一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的探针，所述探针包括：
rpoD-P：5′-(FAM)-GCTCGACACACATCTTCAGG-(Eclipse)-3′(SEQ ID NO:3)。
其中FAM为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团。
进一步地，一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的引物和探针，包括以下序列：
rpoD-F：5′-AACATGCGCGAGATGATGGA-3′(SEQ ID NO:1)；
rpoD-R：5′-CGCACTCGTTGTTGGTGAAG-3′(SEQ ID NO:2)；
rpoD-P：5′-(FAM)-GCTCGACACACATCTTCAGG-(Eclipse)-3′(SEQ ID NO:3)。
其中FAM为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团。
上述针对鳢舒伯特气单胞菌的特异性引物及探针是根据鳢舒伯特气单胞菌的rpoD基因的保守区序列设计得到。
在本发明的第二方面，提供一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和探针。
进一步地，所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应液。
进一步地，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、PCR链式反应扩增酶、缓冲液。
进一步地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
进一步地，所述试剂盒还含有阳性标准品，所述阳性标准品为含有舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒。
在本发明的第三方面，提供一种使用上述引物和探针或试剂盒对鳢舒伯特气单胞菌进行荧光定量PCR检测的方法。
进一步地，所述方法包括：提取待检测鳢科鱼类的DNA，采用上述引物和探针或试剂盒对DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，判断是否含有鳢舒伯特气单胞菌(菌阳性或菌阴性)。
进一步地，上述判断方法包括：荧光曲线呈S型曲线且Ct值≤37.0，判定为鳢舒伯特气单胞菌阳性(含有鳢舒伯特气单胞菌)；若无典型S型曲线或Ct值﹥37.0，判定为鳢舒伯特气单胞菌阴性(不含有鳢舒伯特气单胞菌)。
在一个优选的实施例中，采用上述方法得到质粒拷贝数(X)与CT值之间的线性方程为：CT＝-3.326lg X+37.072。
采用上述方程式可以计算检测样品的质粒拷贝数。
采用本发明提供的引物和探针进行检测，PCR的扩增效率可以达到99.8％以上。
采用本发明提供的引物和探针进行检测，检测的灵敏度可达4拷贝/μL，具有高度的灵敏性。
采用本发明提供的引物和探针进行检测，检测同一次实验内的30个鳢舒伯特气单胞菌样品，30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，提示具有非常好的重复性。
本发明的有益效果在于：
本发明可以对鳢科鱼类的舒伯特气单胞菌进行快速检测，可以对鳢科鱼类的舒伯特气单胞菌进行定量分析，可以简化操作程序、节约成本，对鳢舒伯特气单胞菌的流行病学调查、病原监测、以及由舒伯特气单胞菌引起的食物中毒及其早期诊断都具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明的实施例的荧光定量PCR检测方法检测鳢舒伯特气单胞菌的灵敏度实验曲线图。
图2为本发明的实施例的荧光定量PCR检测方法的特异性实验曲线图。
图3为本发明的实施例的荧光定量PCR检测方法中质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线。
图4为本发明的实施例的荧光定量PCR检测方法的重复性实验曲线图。
图5为本发明的实施例的荧光定量PCR检测方法中的样品检测实验曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
针对鳢科鱼类舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的特异性引物及探针的设计
根据从Genbank上检索到的鳢舒伯特气单胞菌rpoD基因(SEQ ID NO:4)，通过blast比对，在基因保守片段(Aeromonas schubertii rpoD70[HQ731467.1]:424bp-750bp)，设计用于检测鳢舒伯特气单胞菌的引物和探针，其序列如下：
rpoD-F：5′-AACATGCGCGAGATGATGGA-3′(SEQ ID NO:1)；
rpoD-R：5′-CGCACTCGTTGTTGGTGAAG-3′(SEQ ID NO:2)；
rpoD-P：5′-(FAM)-GCTCGACACACATCTTCAGG-(Eclipse)-3′(SEQ ID NO:3)。
其中FAM为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团。
实施例2
针对鳢科鱼类舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的方法，步骤如下：
1、阳性标准品的制备
提取鳢舒伯特气单胞菌基因组，用PCR方法扩增鳢舒伯特气单胞菌rpoD基因保守序列，利用常规方法将其接入T载体中，即为阳性标准品。
舒伯特气单胞菌rpoD基因标准品序列(SEQ ID NO:4)：
CACCTCTTCTTCCATGGCTGCGAGCGGGGCAGACCAGGCCTTGCCGGCCTGCTTCTGGTACTCGAACCAGGCGGTCTCGCACTCGTTGTTGGTGAAGGCGGAGACGAAGGTCTTCTTCGGCATCTTGGCCTGCTCGACACACATCTTCAGGATGAGGCGCTCTTGCACGCGCACGCGCTCCATCATCTCGCGCATGTTGTTGACCAGGCGGTCGAACTGCTTGGGCATCAGACGGAATTGACGGAACACGTCGGCCAGCTGGGCAATGGCGGCCTGAGTCTCTTCGTGAGCACGACCGTTAGAGCGGATCGACTGACGAGTGAATCTC
2、鳢舒伯特气单胞菌DNA的提取
按照细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)的说明书步骤，从感染相应细菌的鱼体内脏组织或细菌纯培养物中提取DNA，作为荧光定量PCR反应的模板。
3、荧光定量PCR扩增
每个测试反应体系为20μL，体系配制如下：待检测样品的DNA模板2μL、上、下游引物和荧光探针各0.4μL，2×Tapman universal PCR Master Mix 10μL、无菌去离子水补足至20μL。
同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性标准品(阳性对照)或无菌去离子水2μL(阴性对照)进行扩增。
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称，设定反应条件为95℃预变性10s，然后经95℃，5s和60℃，30s，40个循环，于60℃采集荧光信号。
4、结果分析和判定
反应结束后，得到荧光曲线。
当荧光曲线呈S型曲线且Ct值≤37.0，判定为鳢舒伯特气单胞菌阳性；若无典型S型曲线或Ct值﹥37.0，判定为鳢舒伯特气单胞菌阴性。
实施例3
灵敏度实验
提取含有目的片段的质粒，该质粒的DNA拷贝数为：4.76×108拷贝/μL，10倍等比稀释为4.76×107、4.76×106、4.76×105、4.76×104、4.76×103、4.76×102、4.76×10、4.76拷贝/μL，采用实施例2的检测方法进行灵敏度实验。
实验结果见图1，从1-9依次为4.76×106、4.76×105、4.76×104、4.76×103、4.76×102、4.76×101、4.76×10、4.76×10-1拷贝/μL的标准品和阴性对照的扩增结果。
检测结果表明，本发明方法检测的灵敏度可达4拷贝/μL，并且Ct值随浓度减少呈梯度改变，精确性优于普通PCR方法，表明本发明检测方法对鳢舒伯特气单胞菌的诊断具有高度的灵敏性。
实施例4
特异性实验
采用本发明的实施例2的鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测方法来分别检测嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华菌、金黄葡萄球菌、无乳链球菌、海豚链球菌、诺卡氏菌和阴性对照组(无菌离子水)，分析本发明方法对鱼类其它常见细菌和鳢舒伯特气单胞菌的检测情况。
检测结果表明：
从图2中可以看出，嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华菌、金黄葡萄球菌、无乳链球菌、海豚链球菌、诺卡氏菌和阴性对照组均为阴性，仅特异性扩增出鳢舒伯特气单胞菌。
上述结果说明，本发明检测试剂盒和检测方法能特异性扩增出鳢舒伯特气单胞菌，而不与其它细菌核酸发生交叉反应。这说明，本发明方法及试剂盒的特异性好，未出现假阳性。
实施例5
绘制标准曲线
用双蒸水对标准品进行10×倍比稀释，采用实施例2的方法进行荧光定量PCR反应，建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线。
实验结果显示，标准曲线在4.76×102copy/μL-4.76×108copy/μL之间有较好的线性关系，如图3所示，相关系数：R2＝0.998，斜率：Slope＝－3.326，截距：Y-lnter＝37.072，扩增效率：Eff％＝99.818％。得到质粒拷贝数(X)与CT值之间的线性方程为：CT＝-3.326lg X+37.072。
实施例6
重复性实验
采用实施例2的方法，取鳢舒伯特气单胞菌在一次实验中重复30次，结果表明，同一次实验内的30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，说明本发明的检测方法所建立的鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR快速检测方法重复性好。
实施例7
样品检测
采用实施例2的检测方法，取10份样品进行检测，具体检测结果见图5。
从图5中可以看出，10份样品中，检测到阳性样品为2份，检测到阴性为8份。将所有参与检测的临床样品同时结合细菌分离和常规的PCR检测来相互验证，其检测结果和本发明申请的检测结果一致。
对比例
发明人通过多对引物的筛选，对比，得到本发明的具有高特异性、高敏感性、高重复性的引物，用于鳢科鱼类的舒伯特气单胞菌的荧光定量PCR检测。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种鳢舒伯特气单胞菌荧光定量PCR检测的引物和探针以及试剂盒和检测方法
<141> 2017-12-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物rpoD-F
<400> 1
aacatgcgcg agatgatgga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物rpoD-R
<400> 2
cgcactcgtt gttggtgaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 探针rpoD-P
<400> 3
gctcgacaca catcttcagg 20
<210> 4
<211> 328
<212> DNA
<213> 舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(328)
<223> rpo基因
<400> 4
cacctcttct tccatggctg cgagcggggc agaccaggcc ttgccggcct gcttctggta 60
ctcgaaccag gcggtctcgc actcgttgtt ggtgaaggcg gagacgaagg tcttcttcgg 120
catcttggcc tgctcgacac acatcttcag gatgaggcgc tcttgcacgc gcacgcgctc 180
catcatctcg cgcatgttgt tgaccaggcg gtcgaactgc ttgggcatca gacggaattg 240
acggaacacg tcggccagct gggcaatggc ggcctgagtc tcttcgtgag cacgaccgtt 300
agagcggatc gactgacgag tgaatctc 328