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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810002782.0 (22)申请日 2018.01.02 (71)申请人 武汉启丰生物技术有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖高新区当 代科技园 （华夏创业中心） 一期2号楼 11层19号房 (72)发明人 佘群新梁运祥李英俊韩文元 彭楠 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 龚莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的 快捷核酸检测定量法 。
2、(57)摘要 本发明属于核酸检测与定量领域， 具体涉及 到一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快 捷核酸检测定量法。 本发明利用CRISPR-Cas核酸 蛋白复合物既特异性切割靶标RNA， 又能高效地、 非特异性地切割单链DNA的双重核酸切割活性， 进行核酸检测及定量； 利用单链DNA作为报告探 针， 使得该方法更为稳定、 成本更低； 本方法能对 6.4pM-2nM浓度范围内的靶标核酸进行精准定 量， 将核酸蛋白复合物进行突变， 可提高核酸检 测灵敏度到100fM， 是一种全新的更为简便的核 酸定量技术。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 108220400 A 2018。
3、.06.29 CN 108220400 A 1.一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法， 包括以下步骤： （a） 确定待检样品靶标核酸序列； （b） 如果待检核酸样品中的靶标核酸为单链RNA， 即可直接进行步骤 （c） ， 如果受检核酸 样品中的靶标核酸为双链或者单链DNA， 则需要利用RNA聚合酶将其转录成单链RNA， 再进行 步骤 （c） ； （c） 生产携带与步骤 （b） 中靶标核酸RNA序列配对的crRNA的CRISPR-Cas10核酸蛋白复 合物， 所述的CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物通过原核生物细胞内源表达共纯化方式获得； （d） 在检测反应体系。
4、中加入适量待检测样品、 步骤 （C） 生产的CRISPR-Cas10核酸蛋白 复合物以及单链DNA探针； 所述的单链DNA探针的5 端和3 端分别标记荧光基团和淬灭基团； （e） 将检测反应体系放置在20-75下反应30-90分钟， 待检测反应结束后， 通过荧光酶 标仪或荧光分光光度计， 检测反应的荧光值， 进行定性分析； （d） 对靶标RNA进行定量： 配制不同浓度的靶标核酸标准品， 绘制荧光值与浓度对应的 标准曲线， 再根据受检样品的荧光值计算其靶标核酸的浓度。 2.根据权利要求1所述的方法， 当做定性分析时， CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物为突变 型的结构蛋白或核酸酶亚基与crR。
5、NA的复合体。 3.根据权利要求1所述的方法， 所述的单链DNA探针为5-HEX/TTTTT/3Dabcyl。 4.根据权利要求1所述的方法， 所述的CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物通过冰岛硫化叶 菌表达制备得到。 5.根据权利要求1所述的方法， 所述的CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物为与靶标核酸RNA 序列配对的crRNA的Cmr- 核酸蛋白复合物或Cmr- 核酸蛋白复合物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108220400 A 2 一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定 量法 技术领域 0001 本发明属于核酸检测领域， 具体涉及到一种基于CRISP。
6、R-Cas10核酸蛋白复合物的 快捷的核酸检测及定量方法。 背景技术 0002 核酸检测是应用分子生物学的手段检测受检样品的遗传物质或携带的病毒、 病原 体的基因， 是体外诊断的重要分支。 核酸检测技术目前主要分为核酸扩增技术(PCR)、 原位 杂交技术(ISH)、 基因芯片以及二代高通量基因测序技术四大类。 目前应用最多的为实时定 量PCR， 恒温扩增(RPA)， 其次是原位杂交和基因芯片技术， 而高速发展的二代测序技术也为 更精准的核酸检测提供技术支撑。 目前， 核酸检测产品应用在临床疾病如病原菌感染、 肿 瘤、 遗传等的诊断占比达到70以上。 面对体外诊断行业的高速增长和极为广阔的市场前。
7、 景， 现有的核酸检测技术还面临着工序复杂、 成本高等问题， 因此还需开发更方便高效、 成 本更低廉的核酸检测新技术。 0003 CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR-associat ed)是一种原核生物所特有的获得性免疫系统， 主要用于抵御病毒、 质粒 等外源遗传物质的入侵。 CRISPR-Cas系统目前已被分为六个不同的类型， 即I型、 II型、 III 型、 IV型、 V型和VI型。 目前， 基于II型CRISPR-Cas9和V型CRISPR-Cpf1系统的基因组编辑工 。
8、具广泛地应用于生命三域的科学研究中。 基于VI型CRISPR-Cas13a系统的核酸检测应用也 为体外分子诊断提供了新的技术手段， 但该技术同样具有原料生产困难复杂、 使用成本高、 难于对核酸进行定量等问题。 0004 针对上述问题， 申请人发现， 由多蛋白组成的III型CRISPR-Cas系统核酸蛋白复合 物 (CRISPR-Cas10)识别配对的靶标RNA长度达到32-47个核苷酸， 其不仅能切割靶标RN A， 结合靶标RNA之后还能对序列非特异的单链DNA进行切割(冰岛硫化叶菌Cmr- 复合物的单 链DNA切割活性还能被ATP进一步激活提高)； 研究还发现， 对CRISPR-Cas10 。
9、核酸蛋白复合 物的一个亚基进行突变改造能使其丧失对靶标RNA的切割活性。 因此， CRI SPR-Cas10核酸 蛋白复合物与只能切割单链RNA的单蛋白CRISPR系统Cas13a相比， 在核酸检测应用上具有 诸多明显优势。 此外， 由于靶标RNA能被CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物切割后解离从而使得 复合物丧失单链DNA切割活性， 所以单链DNA探针被切割后所释放的信号强弱可以准确反映 受检样品中靶标RNA的含量， 基于此原理， 我们可以利用该核酸蛋白复合物开发一种全新的 核酸定量技术。 发明内容 0005 鉴于核酸检测的市场需求巨大， 而现有技术和方法在检测工序、 检测时间周期、 检。
10、 测灵敏度和检测成本方面都有待优化和提高。 本发明的目的在于提供一种基于CRISPR- Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法。 说明书 1/6 页 3 CN 108220400 A 3 0006 一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法， 包括以下步骤： 0007 (a)确定待检样品靶标核酸序列； 0008 (b)如果待检核酸样品中的靶标核酸为单链RNA， 即可直接进行步骤(c)， 如果受检 核酸样品中的靶标核酸为双链或者单链DNA， 则需要利用RNA聚合酶将其转录成单链 RNA， 再进行步骤(c)； 0009 (c)生产携带与步骤(b)中靶标核酸RNA序列配。
11、对的crRNA的CRISPR-Cas10核酸蛋 白复合物， 所述的CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物通过原核生物细胞内源表达共纯化方式获 得； 0010 (d)在检测反应体系中加入适量待检测样品、 步骤(C)生产的CRISPR-Cas10核酸蛋 白复合物以及单链DNA探针； 0011 所述的单链DNA探针的5 端和3 端分别标记荧光基团和淬灭基团； 0012 优选的， 所述的单链DNA探针为5-HEX/TTTTT/3Dabcyl； 0013 (e)将检测反应体系放置在20-75下反应30-90分钟， 待检测反应结束后， 通过荧 光酶标仪或荧光分光光度计， 检测反应的荧光值， 进行定性分析。。
12、 0014 (d)对靶标RNA进行定量： 配制不同浓度的靶标核酸标准品， 绘制荧光值与浓度对 应的标准曲线， 再根据受检样品的荧光值计算其靶标核酸的浓度。 0015 以上所述的方案中， 优选的， 当做定性分析时， CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物为突 变型的结构蛋白或核酸酶亚基(Cmr/Csm蛋白)与crRNA的复合体。 0016 以上所述的方案中， 优选的， 使用CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物通过冰岛硫化叶 菌表达制备得到。 0017 以上所述的方案中， 优选的， 所述的CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物为携带与靶标 核酸RN A序列配对的crRNA的Cmr- 核酸蛋白复合。
13、物或Cmr- 核酸蛋白复合物。 0018 以上所述的步骤中， 所述的待检测样品为含有核糖核酸RNA、 脱氧核糖核酸DNA或 两种核酸混合的样品， 进一步包括含有核酸的动植物病和人体病原样品、 人类肿瘤和遗传 疾病样品以及环境样品如土壤和水等。 0019 与现有技术相比， 本发明具有以下优点： 0020 本发明所采用的CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物是从原核生物宿主细胞中制备的， 含有 40-55个核苷酸的crRNA。 该复合物能特异性地识别并结合与其crRNA序列相匹配的靶 标R NA(32-47个核苷酸)， 形成具有双重核酸酶活性的三元CRISPR-Cas复合物(Cas蛋白、 c rR。
14、NA和靶标RNA)， 它既能特异性切割靶标RNA， 又能高效地、 非特异性地切割单链DN A。 此 外， 一旦靶标RNA被切割， CRISPR-Cas10复合物又恢复其无活性构型。 因此， 我们可以荧光标 记的单链DNA作为报告探针， 测定其DNA切割活性， 同时， 单链DNA探针被 CRISPR-Cas10核酸 蛋白复合物切割后所释放的信号强弱可以准确反映受检样品中靶标RN A的含量， 即本发明 方法的基本原理(图1)。 0021 本发明方法具有如下特点： 操作流程和仪器需求简单， 检测时间周期短； CRISPR- Cas1 0核酸蛋白复合物识别的靶标RNA较长， 既保证了核酸检测特异性， 。
15、又能区分不同的靶 标核酸突变体； 所使用的核酸蛋白复合物由原核生物内源表达生产， 更方便更稳定； 使用荧 光报告探针为单链DNA， 合成成本低， 且不易降解； 具有较高的灵敏度， 对靶标核酸的直接检 测限为10pM； 更为重要的是， 本方法能对6.4pM-2nM浓度范围内的靶标核酸进行精准定量， 说明书 2/6 页 4 CN 108220400 A 4 是一种全新的更为简便的核酸定量技术， 将核酸蛋白复合物进行突变， 可提高核酸检测灵 敏度到100fM。 该方法应用范围广， 受检核酸样品中靶标核酸为RNA时可以直接进行检测， 受 检核酸样品中靶标核酸为DNA时可以将其转录成RNA之后再进行检测。
16、， 可用于人类肿瘤标志 物(microRNAs、 lncRNAs)、 遗传疾病、 动植物和人体病原微生物的检测和诊断， 还可用于环 境样品如土壤和水中特定核酸的检测和定量。 本发明方法有望替代目前广泛应用的qPCR技 术， 使核酸检测和定量技术提高到一个新水平。 附图说明 0022 图1为本发明原核生物细胞内源表达生产CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物并利用其 进行核酸检测定量的原理示意图。 0023 图2为本发明用于共纯化CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的表达质粒pSS1-Cmr6 / 结构图。 0024 图3为冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸蛋白复合物对浓度。
17、为100nM的靶 标R NA的检测结果示意图。 0025 图4为冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸蛋白复合物对浓度分别为1nM和 10 pM的靶标RNA的检测结果示意图。 0026 图5为冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸蛋白复合物对浓度分别为1nM， 100 pM和10pM的靶标RNA的检测结果示意图。 0027 图6为冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸蛋白复合物检测浓度为1nM的靶 标R NA， 在反应体系中添加和不添加ATP的检测结果示意图。 0028 图7为冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸蛋白复合物对不同。
18、浓度靶标RNA 进行检测， 反应80分钟时的各检测反应的荧光值与靶标RNA浓度的线性关系示意图。 0029 图8为冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸蛋白复合物对不同浓度靶标RNA 进行检测， 各靶标RNA样品的浓度(2000pM,800pM,400pM,300pM,160pM,32pM, 6.4pM)与其 荧光值之间的线性方程示意图。 具体实施方式 0030 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别说明， 实施例 中的实验操作均按常规实验条件或按照材料、 试剂制造厂商说明书建议的条件。 0031 实施例1： 0032 本实施例利用冰岛硫化叶菌S.is。
19、landicus REY15A CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸 蛋白复合物对人工合成的一段小RNA进行检测为例来说明： 0033 1.本实施例选择人工合成的一段小RNA为靶标核酸， ， 因此受检核酸样品为人工配 制但其不影响该方法的在其它天然受检核酸样品的应用推广， 根据该RNA序列设计两条引 物(SS1-SpF/SS1-SpR)(表1)， 以上两条引物通过95处理5分钟后自然冷却退火生成一段 具有粘性末端的spacer片段； 0034 表1.本发明所用到引物序列 说明书 3/6 页 5 CN 108220400 A 5 0035 0036 0037 上表中形成spacer粘性末端。
20、的四个碱基被黑色加粗显示。 0038 2.将上面得到的spacer片段与经BspMI酶切处理的载体pSe-Rp(Peng et al., 2015) 酶连并转化大肠杆菌DH5 菌株， 得到人工mini-CRISPR质粒pAC-SS1； 0039 3.用表1中的引物对Cmr6 -F/Cmr6 -R从冰岛硫化叶菌基因组DNA上扩增出cmr6 基因片段， 随后用NdeI/SalI克隆到冰岛硫化叶菌表达载体pSeSD1(Deng et al.,2009) 上 得到Cmr- 系统亚基之一Cmr6 的表达质粒pSeSD-Cmr6 ； 0040 4.用表1中的引物对Cmr6-Insert-F/Cmr6-In。
21、sert-R以步骤3得到的表达质粒 pSeSD- Cmr6 为模板扩增整个Cmr6 的表达元件， 用SalI/XhoI克隆到步骤2得到的人工 mini-CRI SPR质粒pAC-SS1上， 得到Cmr- 核酸蛋白复合物的共纯化表达质粒pSS1-Cmr6 (图2)； 0041 5.将上面得到的共纯化表达质粒pSS1-Cmr6 转化到冰岛硫化叶菌中， 表达纯化得 到 Cmr- 核酸蛋白复合物； 0042 6.选择黑色酶标板做检测反应， 在反应体系中分别加入10L 10cleavage buffer (500mM Tris-HCl,100mM MgCl2,100mM DTT)， 其它反应组分及终浓度。
22、分别为： 20 0nM荧光核酸报告探针(/5-HEX/TTTTT/3Dabcyl/)， 50nM Cmr- 核酸蛋白复合物， 不同浓度 的靶标核酸(100nM,1nM,100pM,0nM)， 最后用无菌水补至100 L； 说明书 4/6 页 6 CN 108220400 A 6 0043 7.在室温下反应5min后用多功能酶标仪检测荧光值(Ex/Em535/556nm)， 每5 分 钟检测一次， 连续检测1小时； 0044 8.绘制反应时间和接收荧光值的曲线(图3， 图4)， 结果显示检测灵敏度能达到10 pM。 0045 实施例2： 0046 本实施例利用冰岛硫化叶菌S.islandicus。
23、 REY15A CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸 蛋白复合物对人工合成的一段小RNA进行检测为例来说明： 0047 1.本实施例同样选用实施例1中的靶标核酸， 0048 2.用表1中的引物对Cmr6 -F/Cmr6 -R从冰岛硫化叶菌基因组DNA上扩增出cmr6 基因片段， 随后用NdeI/SalI克隆到冰岛硫化叶菌表达载体pSeSD1(Deng et al.,2009) 上 得到Cmr- 系统亚基之一Cmr6 的表达质粒pSeSD-Cmr6 ； 0049 3.用表1中的引物对Cmr6-Insert-F/Cmr6-Insert-R以步骤3得到的表达质粒 pSeSD- Cmr6 为模板。
24、扩增整个Cmr6 的表达元件， 用SalI/XhoI克隆到实施例1步骤2得到的 人工 mini-CRISPR质粒pAC-SS1上， 得到Cmr- 核酸蛋白复合物的共纯化表达质粒pSS1- Cmr6 ； 0050 4.将上面得到的共纯化表达质粒pSS1-Cmr6 转化到冰岛硫化叶菌中， 表达纯化得 到Cmr- 核酸蛋白复合物； 0051 5.选择黑色酶标板做检测反应， 在反应体系中分别加入10L 10cleavage buffer (500mM Tris-HCl,100mM MgCl2,100mM MnCl2,100mM DTT)， 其它反应组分及终浓度 分别为： 200nM荧光核酸报告探针(/。
25、5-HEX/TTTTT/3Dabcyl/)， 50nM Cmr- 核酸蛋白复合物， 不同浓度的靶标核酸(1nM,100pM,10pM,0nM)， 200nM ATP， 最后加无菌水补至100 L； 0052 6.在室温下反应5min后用多功能酶标仪检测荧光值(Ex/Em535/556nm)， 每5 分 钟检测一次， 连续检测1小时； 0053 7.绘制反应时间和接收荧光值的曲线(图5， 图6)， 结果显示检测灵敏度能达到10 pM， 同时ATP能提高Cmr- 核酸蛋白复合物切割核酸报告探针的活性， 提高荧光检测信号。 0054 实施例3： 0055 本实施例利用冰岛硫化叶菌S.islandic。
26、us REY15A CRISPR-Cas10系统Cmr- 核酸 蛋白复合物对人工配制的核酸溶液进行靶标RNA定量分析为例来说明： 0056 1.人工配制不同浓度的靶标核酸溶液(4000pM,2000pM,800pM,400pM,300 pM, 160pM,32pM,6.4pM,1.28pM,0.256pM)， 利用野生型Cmr- 核酸蛋白复合物做检测反应； 0057 2.选择黑色酶标板做检测反应， 在反应体系中分别加入10L 10cleavage buffer (500mM Tris-HCl,100mM MgCl2,100mM MnCl2,100mM DTT)， 其它反应组分及终浓度 分别为：。
27、 400nM荧光核酸报告探针(/5-HEX/TTTTT/3Dabcyl/)， 50nM Cmr- 核酸蛋白复合物， 最后加水至100 L； 0058 3.在室温下反应5min后用多功能酶标仪检测荧光值(Ex/Em535/556nm)， 每5 分 钟检测一次， 连续检测90分钟， 结果显示荧光值随靶标RNA浓度和反应时间的增加而增加； 0059 4.选取反应时间80分钟为节点， 绘制荧光值与靶标核酸浓度的曲线(图7)， 结果显 示荧光值和靶标核酸浓度具有较高的线性相关性； 进一步选取线性相关性强的靶标核酸浓 度范围(2000pM,800pM,400pM,300pM,160pM,32pM,6.4p。
28、M)绘制标准曲线， 线性方程为y 说明书 5/6 页 7 CN 108220400 A 7 0.9267x+219.44， R20.9987； 0060 5.同实施例1中所述， 另取已知浓度为80pM的RNA溶液作为受检样品， 得到反应, 80分钟时的荧光值为287； 0061 6.根据步骤4绘制的标准曲线， 计算对应的靶标核酸浓度为72.9pM， 表明在本实施 例采用的反应体系下， 核酸浓度在6.4pM-2000pM范围内可以用该方法进行精确定量。 0062 实施例4： 0063 本实施例通过将冰岛硫化叶菌S.islandicus REY15A CRISPR-Cas10系统Cmr- 核 酸蛋。
29、白复合物中Cmr4 亚基的第27位氨基酸天冬酰胺D突变成丙氨酸A， 使得该突变型Cmr- 核酸蛋白复合物丧失对靶标RNA的切割活性， 从而提高对人工合成的一段小RNA的检测灵 敏度为例来说明： 0064 1.我们采用基于内源CRISPR-Cas系统基因组编辑技术在冰岛硫化叶菌基因组上 对c mr4 基因进行定点突变， 获得携带Cmr4 D27A的突变株(基因组编辑方法详见公开专利C N201510639204.4)， 具体步骤如下： 0065 (a)在Cmr4 第27位氨基酸即基因序列第79-81位碱基附近选取protospacer序列， 即 5 -ATAGGTTATCCAATAGTCTATG。
30、GCTCTAGCTTTAAGGGAG-3 ， 依据此protospacer 序列合成 一对引物Cmr4 D27-SpF/Cmr4 D27-SpR(表1)， 两条引物通过95处理5分钟后自然冷却退 火生成一段具有粘性末端的spacer片段然后克隆到pSe-Rp上构建成干涉靶标cmr4 上 protospacer的人工mini-CRISPR质粒pAC-4 D27； 0066 (b)分别用表1中的引物对D27A-SalIF/D27A-SOE-R和D27A-SOE-F/D27A-SalIR从 冰岛硫化叶菌基因组DNA上扩增出标记Cmr4 D27的左右臂(编码的核苷酸序列为GAT， 我们 将其变成GCT。
31、， 使得D27突变成A27)， 然后采用SOE-PCR的方法将两条同源臂连接起来， 进一 步将同源臂克隆到步骤(a)中得到的人工mini-CRISPR质粒pAC-4 D27 上， 获得基因编辑质 粒pGE-Cmr4 D27A。 0067 (c)将基因编辑质粒pGE-Cmr4 D27A电转化入冰岛硫化叶菌， 得到突变株Cmr4 D27A， 并采用添加5-FOA的培养基消除质粒。 0068 2.将实施例1中的Cmr- 核酸蛋白复合物的共纯化表达质粒pSS1-Cmr6 电转化到 本实施例步骤1得到的突变株Cmr4 D27A中， 表达共纯化得到携带Cmr4 D27A的突变型Cmr- 核 酸蛋白复合物；。
32、 0069 3.该核酸蛋白复合物能有效结合靶标RNA， 但其不能切割靶标RNA， 因此其结合靶 标RNA之后能持续具有单链DNA切割活性， 有效提高核酸检测灵敏度到100fM。 0070 本发明保护范围不限于上述实施例。 0071 尽管上文已经用一般性说明及具体实施例对本发明做了详尽的描述， 但在本发明 基础上作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是一望而知的， 毋庸赘述。 因此， 在未 偏离本发明主旨的基础上做的或多或少的修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 6/6 页 8 CN 108220400 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 108220400 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 108220400 A 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 108220400 A 11 图7 图8 说明书附图 4/4 页 12 CN 108220400 A 12 。