技术领域
本发明荧光纳米粒子及其制备方法和应用，特别涉及一类基于稀土配合物荧光 染料的荧光纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
基于发光稀土配合物的荧光探针在生物传感、细胞及组织成像等方面具有重要 应用前景。其主要原因是稀土离子在可见或近红外区的锐线发射及较长的发光态寿 命可以减少生物材料本身产生的荧光干扰，可望使检测具有很高的灵敏度和效率， 同时避免了使用放射性元素带来的一系列问题。
由于稀土离子的f-f跃迁受电偶极选率的限制，稀土离子本身的光吸收能力很弱， 摩尔消光系数很小，因此要获得较大的光致发光效率，需要对其进行敏化，即通过 配体(或电荷转移态)吸光，并使能量转移至稀土离子发光态以实现稀土离子的高 效发光。许多稀土配合物能被紫外光激发，获得较好的发光强度。然而，紫外激发 光对生物体损伤及干扰较大，紫外光穿透深度小，同时会产生较强的背景荧光，使 紫外激发荧光探针的应用受到很多限制。因此，向长波方向扩展稀土配合物的激发 窗口，获得具有优良可见光或近红外光激发发光能力的稀土配合物荧光探针成为稀 土配合物荧光生物探针的重要发展方向之一。具有优良可见光和近红外光激发发光 性能的稀土配合物非常有限。
近年来，本发明的发明人设计、合成了铕配合物[Eu(tta)3dpbt](dpbt＝2-(N，N-二 乙基苯胺-4-基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑-1-基)-1，3，5-三嗪，tta为噻吩甲酰 三氟丙酮负离子)(Y.Wang，et al.，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010)。在此基础 上，我们设计、合成了一系列新型稀土配合物，它们均具有优良的可见光和近红外 光激发发光性能(Y.Wang，et al.，Adv.Funct.Mater.2007，17，3663；王远，郝锐，具 有可见光激发发光性能的铕配合物及其合成方法，CN 101066974A)。若以此类稀 土配合物为基础制备生物荧光探针应用于生物分析，采用长波光激发，将使得生物 分析具有高灵敏度、高信噪比、穿透深度大、对生物体损伤与干扰小、分析成本低 等优点。然而，已知的具有可见与近红外光高效激发发光性能的稀土配合物为疏水 性分子，且其在水溶液中的稳定性不高，因而难以在水溶液中直接使用这些配合物 分子作为生物荧光探针。此外，即使是能被紫外光激发高效发光的以多齿羧基为配 体的稀土配合物，由于稀土配合物与生物大分子之间可能存在的配体交换反应，也 使其在生物检测及成像方面的应用受到很大限制。
解决此类问题的一个较可行方案是将稀土配合物包埋于聚合物树脂或无机纳米 粒子中。西鹏(西鹏、顾晓华、黄象安、何玉鲜，无机-有机核壳式稀土聚合物材 料及其制备方法，CN1966534；)等采用乳液聚合法以及溶胀包埋法将具有紫外光 激发发光性能的疏水稀土配合物包埋于聚合物树脂中，制备了具有紫外光激发发光 性能的纳米粒子；陈扬和袁景利等(陈扬，基于荧光能量转移原理发光的稀土纳米 粒子及制备方法，CN 1304523C；袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，一种功能性纳 米稀土微粒及其制备和应用，CN1298807C)分别采用微乳液法或法将亲水性 的稀土配合物包埋于二氧化硅为基质的纳米粒子中，制备了具有紫外光激发发光性 能的稀土配合物基纳米材料。通常疏水高分子为基质的纳米粒子在水溶液中的分散 性不理想，易发生团聚，而在许多有机溶剂中因高分子溶胀，易导致纳米粒子内荧 光分子泄漏。二氧化硅基质与非水溶性稀土配合物的浸润性较差，以水解反应形成 的氧化硅包裹非水溶性稀土配合物合成纳米粒子时，由于难以形成致密包裹层常常 导致形成的荧光纳米粒子的稳定性不高。此外，当以水解反应形成的氧化硅或其衍 生物包裹稀土配合物时，Si-OH与荧光分子之间往往存在相互作用，从而降低稀土 配合物的荧光量子产率，使发光强度减弱。袁景利等(Jingli Yuan，et.al.，Chem.Comm. 2008，365-367)对本发明人设计、合成的稀土配合物[Eu(tta)3dpbt]进行了结构调变， 以含有-Si(OR’)3基团的CDHH代替[Eu(tta)3dpbt]中的辅助配体tta，利用微乳法制备 了一种能被可见光激发发光的稀土配合物基荧光纳米粒子，虽然其激发窗口尾部扩 展至可见光区，但其激发峰兰移至紫外区，可见区的消光系数小，荧光量子产率约 0.2(激发波长为335nm)，表明其可见光激发发光能力较弱。
理想的稀土配合物基纳米荧光探针应具有以下特征：1)在水溶液中具有良好的 分散性和稳定性；2)纳米粒子中的稀土配合物或其聚集体具有强的光致发光能力， 特别是可见光及近红外光激发发光能力；3)纳米粒子表面具有可供与生物分子键合 的活性基团。
本发明发明人曾采用已见诸报道的稀土配合物基荧光纳米粒子合成方法包裹所 设计、合成的具有优异可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物以合成新型稀 土配合物基荧光纳米粒子，例如微乳聚合法、RSi(OR’)3水解包埋法等，但均难以获 得令人满意的结果。其主要原因之一是具有优良可见光与近红外激发发光性能的稀 土配合物的配体与稀土金属离子的配位作用较弱，通常的配合物包埋方法容易导致 其发生配体交换反应，失去原有的激发发光特性。
发明内容
本发明的目的是提供新的基于稀土配合物荧光染料的荧光纳米粒子及其制备方 法与应用。
本发明所提供的荧光纳米粒子，包括基质材料和分散在所述基质材料中的荧光 染料；所述基质材料为由主链为碳氢链的疏水聚合物、有机硅氧烷和有机硅聚合物 形成的复合物；所述荧光染料为具有光致发光性能的稀土配合物。所述荧光纳米粒 子中主链为碳氢链的疏水聚合物、有机硅氧烷、稀土配合物的摩尔比为0.1～10∶ 0.005～3∶1，所述荧光纳米粒子中有机硅聚合物的质量百分含量为0.5％～40％。
上述主链为碳氢链的疏水聚合物可为聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、 甲基丙烯酸酯苯乙烯共聚物、丙烯酸酯苯乙烯共聚物、聚马来酸二烷基酯、马来酸 二烷基酯苯乙烯共聚物和甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物中的一种或一种以 上的任意组合的混和物。
上述有机硅氧烷为RSi(OR’)3；其中R为C碳原子数为3～18的烷基、烯基、 苯基或氟取代的烷基，R’为C碳原子数为1～2的烷基。上述有机硅聚合物为所述有 机硅氧烷化合物RSi(OR’)3水解并通过硅羟基缩合形成的网状有机硅聚合物。
上述纳米粒子表面还含有具有可供接枝反应的活性基团。所述可供接枝反应的 活性官能团为羟基、氨基、羧基或巯基。
上述纳米粒子的外层还可包裹有氧化硅壳层。所述氧化硅壳层厚度为1～20nm。
上述具有氧化硅壳的荧光纳米粒子的表面还可含有具有可供接枝反应的活性基 团，所述可供接枝反应的活性官能团为羟基、氨基、羧基或巯基。
上述纳米粒子的粒径为10-200nm。
上述分散于纳米粒子基质材料中的稀土配合物为具有在可见光和/或近红外光和 /或紫外光激发下发射可见光或近红外光性能的稀土配合物；所述稀土配合物包括铕 配合物和/或铽配合物和/或镱配合物和/或铒配合物和/或钕配合物。所述铕配合物可 为结构如式I或式II所示的化合物。
式I 式II
上述式I和式II中，R1、R2是碳原子数为1至4的烷基，R3、R4、R5、R6为甲 基或H，R7、R8为H、甲基或三氟代甲基；
本发明所提供的上述荧光纳米粒子的制备方法，包括下述步骤：
1)将稀土配合物、主链为碳氢链的疏水聚合物以及化合物RSi(OR’)3溶解于能 与水混溶的有机溶剂中，制成含有浓度为1.0×10-6～1.0×10-3mol/L的上述的稀土配 合物，浓度为1.0×10-6～1.0×10-2mol/L的主链为碳氢链的疏水聚合物；浓度为 1.0×10-6～1.0×10-2mol/L的化合物RSi(OR’)3的溶液；
2)在搅拌或超声条件下，将步骤1)得到的溶液加入到体积为其1～100倍的含 有分散剂的水溶液中，得到以主链为碳氢链的疏水聚合物、有机硅氧烷和有机硅聚 合物形成的复合物为基质材料的，基于稀土配合物的荧光纳米粒子的溶胶，将其记 为溶胶C。当分散剂为表面活性剂时或水溶性有机高分子时，其水溶液浓度1.0×10-4～ 1.0×10-2mol/L；当分散剂为蛋白质时，其水溶液浓度为0.1～5.0mg/mL。
所述的能与水混溶的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺和四 氢呋喃中的一种或一种以上任意混合；所述的分散剂包括表面活性剂、水溶性蛋白 质或水溶性有机高分子；所述的表面活性剂包括阳离子型、阴离子型、非离子型或 两性表面活性剂或它们的混合物；所述蛋白质包括血清白蛋白或卵清蛋白等；所述 水溶性有机高分子包括聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)等；所述主链 为碳氢链的疏水聚合物为聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、甲基丙烯酸酯 苯乙烯共聚物、丙烯酸酯苯乙烯共聚物、聚马来酸二烷基酯、马来酸二烷基酯苯乙 烯共聚物和甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物中的一种或一种以上的任意组合 的混和物，RSi(OR”)3中R为C碳原子数为3～18的烷基、烯基、苯基或氟取代的 烷基，R”为C碳原子数为1～2的烷基。
上述步骤2)中，所述分散剂水溶液可为浓度为1.0×10-4～1.0×10-3mol/L的表面 活性剂水溶液，所述表面活性剂水溶液与所述步骤1)得到的溶液的体积比可为1-50∶ 1。
所述方法中，还可包括将浓度为1.0×10-6～1.0×10-4mol/L的XRSi(OR”)3的醇溶 液加入到所述步骤2)得到的荧光纳米粒子的溶胶(溶胶C)中，使所述RSi(OR’)3与所述XRSi(OR”)3的使用量摩尔比为1-200∶1，于0～80℃反应1～24hr，制得所 述的表面含有可用于与其它化合物共价键合的活性官能团的，以主链为碳氢链的疏 水聚合物、有机硅氧烷和有机硅聚合物形成的复合物为基质材料的，基于稀土配合 物荧光染料的荧光纳米粒子的溶胶，将其记为溶胶E；所述化合物XRSi(OR”)3中， X为氨基、NH2CH2CH2NH-基、羧基或巯基，XR是碳原子数为2～5的含X取代基 的烷基，OR”为甲氧基、乙氧基、OH或ONa。
上述方法还可包括在步骤1)所述的溶液中加入终浓度为1.0×10-6～1.0×10-4mol/L的XRSi(OR”)3，并于步骤2)将所述的该溶液加入所述分散剂水溶液之后，于 0～80℃反应1～24hr，制得所述的表面含有可用于与其它化合物共价键合的活性官 能团的，以主链为碳氢链的疏水聚合物、有机硅氧烷和有机硅聚合物形成的复合物 为基质材料的，基于稀土配合物荧光染料的荧光纳米粒子的溶胶，将其记为溶胶G； 所述化合物XRSi(OR”)3中，X为氨基或巯基，XR是碳原子数为2～5的含X取代基 的烷基，OR”为甲氧基、乙氧基。
所述方法中，还包括将浓度为5.0×10-3mol/L～5.0×10-1mol/L的正硅酸酯醇溶液 按照1∶5～100的体积比加入到上述荧光纳米粒子的溶胶(溶胶C、溶胶E或溶胶 G)中，于0～80℃反应1～24hr，离心分离，将沉淀分散于水中，制得具有壳-核 结构的荧光纳米粒子的溶胶；然后，加入1.0×10-6～1.0×10-4mol/L的XRSi(OR”)3的 醇溶液，于0～80℃反应1～24hr，制得具有壳-核结构、表面含有可用于与其它化 合物共价键合的活性官能团的荧光纳米粒子的溶胶；其中，所述的正硅酸酯的醇溶 液为正硅酸甲酯或正硅酸乙酯的甲醇或乙醇溶液。所述化合物XRSi(OR”)3中，X为 氨基、NH2CH2CH2NH-基、羧基或巯基，XR是碳原子数为2～5的含X取代基的烷 基，OR”为甲氧基、乙氧基、OH或ONa。
上述方法中，所述主链为碳氢链的、化合物RSi(OR’)3以及稀土配合物使用量之 摩尔比为0.1～10∶0.1～10∶1。
所述方法中，还包括对获得的荧光纳米粒子进行纯化，所述纯化的方法为将得 到的荧光纳米粒子的溶胶离心并收集沉淀，然后将沉淀在水中分散，或者用色谱分 离法进行纯化。
本发明的荧光纳米粒子具有如下优点：
1、具有优异的发光性能。基于稀土配合物的荧光纳米粒子具有发射峰窄、强度 大、Stocks位移大的优点。当采用本发明所述具有可见与近红外激发发光的稀土配 合物为荧光染料时，所制得的荧光纳米粒子在可见光和近红外光激发下具有非常高 的稀土荧光量子产率，例如本发明的许多基于[Eu(tta)3dpbt]和[Eu(fod)3dpbt]的荧光 纳米粒子在可见光激发下的荧光量子产率大于0.3，其可见光激发发光亮度远高于其 它文献与专利报道的稀土配合物基纳米粒子在相同条件下的发光亮度。本发明的一 些稀土配合物基荧光纳米粒子较溶解于溶剂中的同种稀土配合物具有更好的长波可 见光激发发光性能，例如，与溶于甲苯中的[Eu(tta)3dpbt]相比，本发明的基于 [Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的可见光区激发峰及激发窗口红边发生显著红移，这种 由稀土配合物聚集体导致的激发峰和激发窗口红边显著红移的现象尚未见报道。上 述荧光纳米粒子同时具有优异的双光子激发发光性能，在近红外激光激发下，可发 出明亮的红光。具有优异的双光子激发发光性能并能满足合成纳米荧光生物探针需 要的，基于稀土配合物荧光染料的荧光纳米粒子尚未见报道。此外，本发明解决了 具有近红外光发射性能的疏水稀土配合物的纳米包埋问题，所合成的包有此类稀土 配合物荧光染料的纳米粒子具有优良的近红外光发射性能。上述优异光致发光性能 使本发明的稀土配合物基荧光纳米粒子非常适用于合成灵敏度高、穿透深度大、对 生物样品损伤小的纳米荧光生物探针。
2、稳定性能好。在本发明的荧光纳米粒子中，稀土配合物分散于主链为碳氢链 的疏水聚合物、有机硅氧烷和有机硅聚合物形成的复合物基质材料中，由于聚合物 良好的疏水性能，水分子以及水溶液中的离子难以透过聚合物层与配合物作用，基 质材料中的稀土配合物也难以泄漏出去。上述特殊结构使本发明的发光纳米粒子具 有优良的发光性能稳定性。另一方面，本发明的荧光纳米粒子外层的硅羟基具有良 好的亲水性，使得本发明的荧光纳米粒子在水溶液中具有良好的分散性，其胶体溶 液具有良好的分散稳定性。而表面活性剂的使用进一步提高了其分散稳定性，胶体 溶液经长期放置不会产生沉淀。
3、本发明的制备方法可控性强，荧光纳米粒子表面的官能团可用于生物分子的 键合。
本发明的荧光纳米粒子的制备方法为共沉淀包裹法，即将稀土配合物、主链为 碳氢链的与化合物RSi(OR’)3溶解于能与水混溶的有机溶剂，将其加入含所述分散剂 的水溶液中，利用沉淀及水解缩合反应，形成包有稀土配合物荧光染料的所述基质 的纳米粒子；本发明同时提供了具有氧化硅外壳且表面具有活性基团的所述荧光纳 米粒子及其合成方法。将本发明中的稀土配合物换成其它荧光染料，也可通过本发 明提供的方法制备其它荧光染料的荧光纳米粒子。通过调变稀土配合物、带疏水链 的硅氧烷、主链为碳氢链的三者比例以及有机溶剂和分散剂类型可以很方便对荧光 纳米粒子中稀土配合物含量、颗粒尺寸等参数进行调控。而荧光纳米粒子表面活性 官能团的种类与含量可以通过选择硅氧烷种类及其加入量来控制。
本发明的荧光纳米粒子在水溶液中分散稳定性良好，且表面具有可用于与生物 分子共价键合的活性官能团，因此可以直接用于生物分子的标记。各种蛋白，如免 疫球蛋白IgG以及抗IgG，均可采用本发明所提供的荧光纳米粒子进行标记。标记 后获得的纳米荧光生物探针可以用于高灵敏荧光免疫分析，生物荧光成像以及生物 芯片等领域。
附图说明
图1为基于[Eu(tta)3dpbt]配合物的荧光纳米粒子的透射电镜照片；图1中a为实 施例11制备的荧光纳米粒子的透射电镜照片(纳米粒子尺寸范围10～50nm，平均 粒径27nm)；b为实施例1制备的荧光纳米粒子的透射电镜照片(尺寸范围50～90 nm，平均粒径74nm)。
图2为实施例1制备的基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的激发谱(λem＝614nm)。
图3为实施例1制备的基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的发射谱(λex＝412nm)。
图4为荧光纳米粒子与经有机荧光染料FITC标记的山羊抗人IgG共价键合后获 得的纳米粒子胶体中[Eu(tta)3dpbt]的激发谱(A)(λem＝614nm)与发射谱(B) (λex＝412nm)以及FITC的激发谱(A)(λem＝530nm)与发射谱(B)(λex＝470nm)。
图5为实施例29中荧光强度随人IgG浓度变化图。
具体实施方式
为了更具体地说明本发明，现给出若干实施例，但本发明所涉及的内容并不仅 仅局限于这些实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
下述实施例中，tta为噻吩甲酰三氟丙酮负离子，fod为6，6，7，7，8，8，8-七氟-2，2-二 甲基辛烷-3，5-二酮负离子。
实施例1：以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
将辛基三甲氧基硅烷(OTS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以及[Eu(tta)3dpbt](其 结构式如式III所示；Y.Wang，et al.，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010)溶解于丙 酮中，配制成OTS浓度为7.6×10-4mol/L，PMMA浓度为1.6×10-5mol/L，[Eu(tta)3dpbt] 浓度为1.6×10-4mol/L的丙酮溶液，记为溶液A1。在室温及搅拌条件下，将25mL 溶液A1滴加入75mL浓度为1.0×10-3mol/L的十六烷基三甲氧基溴化铵(CTAB)的水 溶液(记为溶液B1)中(溶液A1与溶液B1体积比为1∶3)，搅拌10min，得到以 PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物(OTS水解并通过硅羟基缩合形成的网状聚合 物)的复合物为基质的，包有[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的溶胶(记为溶胶C1)。
将1mL浓度为3.7×10-5mol/L的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)甲醇溶液D1加 入100mL溶胶C1中，于60℃反应1小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水 中，制得表面接有可供接枝反应的氨基基团的荧光纳米粒子的溶胶(记为溶胶E1)。
透射电子显微镜(TEM)测试结果表明，上述制备的溶胶C1中荧光纳米粒子的 平均粒径为74nm。上述制备的溶胶E1中的荧光纳米粒子的透射电镜照片如图1中 b所示，所制得荧光纳米粒子的尺寸分布范围在50～90nm，平均粒径74nm。由于 APS的加入量远小溶胶C1中荧光纳米粒子的总质量，因此电镜表征实验测得的C1 溶胶和E1溶胶中纳米粒子的尺寸非常接近。
将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的 OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷OTS与Eu摩尔比为 0.5，荧光纳米粒子中疏水高分子PMMA与Eu离子的摩尔比为0.1，有机硅聚合物 (OTS水解并通过硅羟基缩合形成的网状聚合物)的质量百分含量为32％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C1中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到480nm。上述制备的荧 光纳米粒子溶胶E1的荧光激发谱(λem＝614nm)如图2所示，上述制备的荧光纳米粒 子溶胶E1的荧光发射谱(λem＝412nm)如图3所示。结果表明，上述荧光纳米粒子具 有优异的可见光激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到480 nm。以4-dicyanomethylene-2-methyl-6-p-dimethylaminostyrl-4H-pyran(DCM)的丙醇 溶液为参考物(Φ＝0.57)，在波长为410nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的铕 离子荧光量子产率为0.30。在波长为832纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳米 粒子可发出明亮的红光，以Rhodamine B为参考物测得其双光子激发作用截面为40 GM(1GM＝10-50cm4 s photo-1molecule-1)。
(式III)
实施例2：以甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复 合物为基质的基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照实施例1中的方法，用甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物(P(St-co-MMA))替 代PMMA配制A2，该溶液中各溶质浓度为：OTS，7.6×10-4mol/L；P(St-co-MMA)， 1.6×10-4mol/L；[Eu(tta)3dpbt]，1.6×10-4mol/L；在室温及搅拌条件下，将30mL溶 液A2滴加入70mL浓度为1.4×10-3mol/L的CTAB的水溶液(记为溶液B2)中搅 拌10min，得到以P(St-co-MMA)、有机硅氧烷和有机硅聚合物(OTS水解并通过硅 羟基缩合形成的网状聚合物)的复合物为基质的，包有[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子 的溶胶(记为溶胶C2)。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶C1中荧光纳米粒子的尺寸分布范围在22～ 85nm，平均粒径为45nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥， 以丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧 烷OTS与Eu的摩尔比为1.1，纳米粒子中疏水高分子P(St-co-MMA)与Eu离子的摩 尔比为1，有机硅聚合物的质量百分数含量为32％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C 1中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于415nm，尾部延展到475nm。以DCM的丙 醇溶液为参考物(Φ＝0.57)，在波长为415nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的 铕离子荧光量子产率为0.31。在波长为830纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳 米粒子可发出明亮的红光，以Rhodamine B为参考物测得其双光子激发作用截面为 50GM(1GM＝10-50cm4 s photo-1molecule-1)。
实施例3：以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照实施例2中的方法，用PMMA替代P(St-co-MMA)，乙腈替代丙酮配制A3； 以牛血清白蛋白替代CTAB配制溶液B3，牛血清白蛋白的浓度为3.0mg/mL。按照 实施例2中的制备方法与条件，制备得到以PMMA、OTS和有机硅聚合物(OTS水 解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质材料的，基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米 粒子的溶胶，记为溶胶C3。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶C3中荧光纳米粒子的尺寸分布为10～40 nm，平均粒径为25nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以 丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷 OTS与Eu的摩尔比为0.1，纳米粒子中疏水高分子PMMA与Eu离子的摩尔比为1， 有机硅聚合物的质量百分数含量为5％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C3中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到475nm。在波长为830 纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳米粒子可发出明亮的红光。
实施例4：以甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复 合物为基质的基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照实施例2中的方法，用P(St-co-MMA)替代PMMA，四氢呋喃替代丙酮配制 A4；人血清白蛋白替代CTAB配制溶液B4，人血清白蛋白的浓度为5.0mg/ml。按 照实施例1中的制备方法与条件，制备得到以P(St-co-MMA)、OTS和有机硅聚合物 (OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质材料的，基于[Eu(tta)3dpbt] 的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C4。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶C4中荧光纳米粒子的尺寸分布为40～100 nm，平均粒径为60nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以 丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷 OTS与Eu的摩尔比为1.0，纳米粒子中疏水高分子P(St-co-MMA)与Eu离子的摩尔 比为1，有机硅聚合物的质量百分数含量为30％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C4中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到475nm。在波长为830 纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳米粒子可发出明亮的红光。
实施例5：以聚苯乙烯、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照实施例2中的方法，用聚苯乙烯(PST)替代PMMA，二甲基甲酰胺替代 丙酮配制A5；以鸡卵清蛋白替代CTAB配制溶液B5，鸡卵清蛋白的浓度为0.5 mg/mL。按照实施例1中的制备方法与条件，制备得到以PST、OTS和有机硅聚合 物(OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质材料的，基于[Eu(tta)3dpbt] 的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C5。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶C5中荧光纳米粒子的尺寸分布为100～200 nm，平均粒径为160nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以 丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷 OTS与Eu的摩尔比为0.6，纳米粒子中疏水高分子PST与Eu离子的摩尔比为0.1， 有机硅聚合物的质量百分数含量为25％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C5中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到475nm。在波长为830 纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳米粒子可发出明亮的红光。
实施例6：以甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合 物为基质的基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照实施例2中的方法，用十八烷基三乙氧基硅烷替代OTS配制A2，该溶液 中各溶质浓度为：十八烷基三乙氧基硅烷，1.6×10-3mol/L；P(St-co-MMA)，1.6× 10-3mol/L；[Eu(tta)3dpbt]，1.6×10-4mol/L；在室温及搅拌条件下，将30mL溶液A2 滴加入70mL浓度为1.0×10-3mol/L的水溶性高分子PVP水溶液(记为溶液B2)中 搅拌10min，得到以P(St-co-MMA)、有机硅氧烷和有机硅聚合物(水解并通过硅羟 基缩合形成的网状聚合物)的复合物为基质的，包有[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的 溶胶(记为溶胶C2)。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶C1中荧光纳米粒子的尺寸分布范围在60～ 150nm，平均粒径为100nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥， 以丙酮萃取其介质中的十八烷基三乙氧基硅烷，气相色谱及ICP分析结果表明，纳 米粒子中十八烷基三乙氧基硅烷与Eu的摩尔比为3，纳米粒子中疏水高分子 P(St-co-MMA)与Eu离子的摩尔比为10，有机硅聚合物(十八烷基三乙氧基硅烷水 解并通过硅羟基缩合形成的网状聚合物)的质量百分含量为35％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C1中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于415nm，尾部延展到475nm。以DCM的丙 醇溶液为参考物(Φ＝0.57)，在波长为415nm激发光照射下，测得此荧光纳米粒子的 铕离子荧光量子产率为0.31。在波长为830纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳 米粒子可发出明亮的红光。
实施例7：以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Eu(fod)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
以Eu(fod)3替代Eu(tta)3，按文献(Y.Wang，et al.，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43， 5010)介绍的方法合成得到结构式如式IV所示的化合物，将其命名为[Eu(fod)3dpbt]。
(式IV)
按照实施例1中的方法，用上述制备的[Eu(fod)3dpbt]替代[Eu(tta)3dpbt]配制溶液 A7，该溶液中各溶质浓度为：OTS，2.0×10-4mol/L；PMMA，5.0×10-5mol/L； [Eu(fod)3dpbt]，1.0×10-4mol/L；以十二烷基三甲氧基溴化铵(DTAB)替代CTAB配 制溶液B7。按照实施例1中的制备方法与条件，制备得到以PMMA、有机硅氧烷和 有机硅聚合物(OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质材料的，基于 [Eu(fod)3dpbt]的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C7。
按照实施例1的方法，以溶胶C7替代实施例1所述的溶胶C1，制得表面具有 可供接枝反应的氨基活性基团的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶E7。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶E2中荧光纳米粒子的尺寸分布为30～80 nm，平均粒径为65nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以 丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷 OTS与Eu的摩尔比为0.3，纳米粒子中疏水高分子PMMA与Eu离子的摩尔比为0.5， 有机硅聚合物的质量百分数含量为15％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶E7中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于402nm，尾部延展到450nm。在波长为832 纳米的近红外激光激发下，上述荧光纳米粒子可发出明亮的红光。
实施例8：以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Eu(fod)3dpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照实施例1中的方法，用[Eu(fod)3dpbt]替代[Eu(tta)3dpbt]配制溶液A8，该溶 液中各溶质浓度为：OTS，5.0×10-5mol/L；PMMA，2.0×10-4mol/L；[Eu(fod)3dpbt]， 1.0×10-4mol/L；以水溶性高分子PVP替代CTAB配制溶液B8，PVP的浓度为1× 10-4mol/L。按照实施例1中的制备方法与条件，制备得到以PMMA、有机硅氧烷和 有机硅聚合物(OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质材料的，基于 [Eu(fod)3dpbt]的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C8。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶C8中荧光纳米粒子的尺寸分布为50～120 nm，平均粒径为80nm。
将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的 OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中OTS与Eu的摩尔比为0.5，纳米 粒子中疏水高分子PMMA与Eu离子的摩尔比为2，有机硅聚合物的质量百分含量 为4％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶E7中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于402nm，尾部延展到450nm。
实施例9：以聚丙烯酸乙酯、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Eu(fod)3dmpbt]的荧光纳米粒子的制备
按照公开号为CN101066975A的专利的实施例7的方法制备得到结构式如式V 所示的配合物，将其命名为[Eu(fod)3dmpbt]。
(式V)
以四氢呋喃为溶剂配制溶液A9，使溶液A9中各溶质浓度为：3-(甲基丙烯酰基) 丙基三甲氧基硅烷，1.0×10-5mol/L；聚丙烯酸乙酯，1.0×10-5mol/L；[Eu(fod)3dmpbt]， 1.0×10-6mol/L。以水溶性高分子PVA替代CTAB，按照实施例1中的方法配制溶 液B1。在室温和搅拌的条件下，将溶液A9加入溶液B1中，使溶液A9与溶液B 1 的体积比为1∶5，制备得到以聚丙烯酸乙酯、有机硅氧烷和有机硅聚合物(3-(甲基丙 烯酰基)丙基三甲氧基硅烷水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基于 [Eu(fod)3dmpbt]的荧光纳米粒子溶胶，记为溶胶C9。
将0.1mL浓度为2.5×10-4mol/L的3-(2-氨乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷的甲醇 溶液D9加入10mL溶胶C9中，于40℃反应2小时，离心分离，将所得沉淀重新分 散于纯水中，制得表面接有可供接枝反应的氨基基团的荧光纳米粒子的溶胶(记为 溶胶E9)。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶E7中荧光纳米粒子的尺寸分布为20～50 nm，平均粒径为35nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以 丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷 3-(甲基丙烯酰基)丙基三甲氧基硅烷与Eu的摩尔比为0.05，纳米粒子中疏水高分子 P(St-co-MMA)与Eu离子的摩尔比为0.1，有机硅聚合物(3-(甲基丙烯酰基)丙基三甲 氧基硅烷水解并通过硅羟基缩合形成的网状聚合物)的质量百分含量为3％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶E9中荧光纳米粒子具有优异的可见光 激发发光性能，其在可见区的激发峰位于409nm，尾部延展到460nm。以DCM的丙 醇溶液为参考物(Φ＝0.57)，在波长为410nm的激发光照射下，测得上述制备的溶胶 E6中荧光纳米粒子的稀土离子荧光量子产率约为0.45。在波长为800纳米的近红外 激光激发下，上述制备的溶胶E9中荧光纳米粒子可发出明亮的红光，以Rhodamine B为参考物测得其双光子激发作用截面约为50GM(1GM＝10-50cm4 s photo-1molecule-1)。
实施例10：以聚苯乙烯、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于结 构如式III铕配合物的荧光纳米粒子的制备
按照公开号为CN101066975A的专利的实施例6的方法合成得到结构式如式VI 所示的配合物。
以丙酮为溶剂，配制溶液A10，使溶液A10中各溶质浓度为：十二烷基三甲氧 基硅烷(DTS)，5.0×10-4mol/L；聚苯乙烯，5.0×10-4mol/L；结构如式VI铕配合物， 1.0×10-3mol/L；配制浓度为1.0×10-3mol/L的两性离子型表面活性剂十八烷基三甲基 甜菜碱的水溶液B10。在室温及搅拌条件下，将溶液A10加入溶液B10中，使溶液 A10与溶液B10的体积比为1∶5，制备得到以聚苯乙烯、有机硅氧烷和有机硅聚合物 (DTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基于配合物VI的荧光纳 米粒子溶胶，记为溶胶C10。
(式VI)
将0.1mL浓度为1.0×10-4mol/L的APS甲醇溶液D10加入10mL溶胶C10中， 于60℃反应1小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得表面接有可供 接枝反应的氨基基团的荧光纳米粒子的溶胶(记为溶胶E10)。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶E8中的荧光纳米粒子的尺寸分布为60～ 100nm，平均粒径为85nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥， 以丙酮萃取其介质中的DTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧 烷DTS与Eu离子的摩尔比为0.005，纳米粒子中PST与Eu的摩尔比为0.5。有机 硅聚合物(DTS水解并通过硅羟基缩合形成的网状聚合物)的质量百分含量为0.5％。
上述制备的溶胶E8中的纳米粒子在可见光及近红外激光激发下可发出明亮的 红光。
实施例11：以聚马来酸二丁基酯、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质 的基于[Eu(fod)3bpt]的荧光纳米粒子的制备
按照公开号为CN101066975A的专利的实施例7的方法制备得到结构式如式VII 所示的配合物，将其命名为[Eu(fod)3bpt]。
以甲醇为溶剂配制溶液A11，使溶液A11中各溶质浓度为：1H，1H，2H，2H-氟代 辛基三甲氧基硅烷，1.0×10-2mol/L；聚马来酸二丁基酯，1.0×10-2mol/L； [Eu(fod)3bpt]，1.0×10-3mol/L；配制浓度为1.0×10-3mol/L的阴离子表面活性剂十二 烷基苯磺酸钠的水溶液B11。在0℃及搅拌条件下，将A11溶液加入B11溶液中， 使两者体积比为1∶9，制备得到以聚马来酸二丁基酯、有机硅氧烷和有机硅聚合物 (1H，1H，2H，2H-氟代辛基三甲氧基硅烷水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为 基质的，基于[Eu(fod)3bpt]的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C11。
将0.1mL浓度为1.0×10-6mol/L的巯丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液D11加入10 mL溶胶C11中，于20℃反应12小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中， 制得表面接有可供接枝反应的巯基基团的荧光纳米粒子的溶胶(记为溶胶E11)。
TEM结果表明，上述制备的溶胶C11中的荧光纳米粒子的平均粒径为180nm。 上述制备的溶胶E11中的荧光纳米粒子的尺寸分布为130～200nm，平均粒径为180 nm。由于APS的加入量远小溶胶C11中荧光纳米粒子的总质量，因此电镜表征实验 测得的C11溶胶和E11溶胶中纳米粒子的尺寸非常接近。将所制备的荧光纳米粒子 离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的1H，1H，2H，2H-氟代辛基三甲氧 基硅烷，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷1H，1H，2H，2H-氟代 辛基三甲氧基硅烷与Eu离子的摩尔比为2，纳米粒子中聚马来酸二丁基酯与Eu的 摩尔比为0.1。有机硅聚合物(1H，1H，2H，2H-氟代辛基三甲氧基硅烷水解并通过硅羟 基缩合形成的网状聚合物)的质量百分含量为40％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C11和E11中的荧光纳米粒子均具有 良好的可见光激发发光性能，其在可见区的激发峰位于410nm，尾部延展到460nm。 在波长为800nm的近红外激光激发下，上述荧光纳米粒子可发出明亮的红光。
(式VII)
实施例12：以甲基内烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复 合物为基质的基于[Eu(tta)3bpt]的荧光纳米粒子的制备
取N，N-二乙基对溴苯胺(4mmol)，溶解在干燥过的四氢呋喃中，通氩气除氧， 置于-78℃的干冰丙酮浴中，在氩气保护下，加入4mL n-BuLi(1.6M)，缓慢升 温至室温后，继续搅拌30min，将其加入冷冻于-78℃下的三聚氯嗪(5.4mmol)中， 缓慢升温至室温后，继续搅拌60min。除去溶剂后，产物用硅胶柱色谱分离，洗脱 剂为二氯甲烷。将所得粗产品在石油醚中重结晶，得到2-(N，N-二乙基苯胺-4-基)-4，6- 二氯-1，3，5-三嗪黄色针状晶体0.60g。在氩气保护下，将新切的金属钾(1.25mmol) 加入无水四氢呋喃中；加入吡唑(1.75mmol)，加热回流3h生成吡唑负离子；将 反应混合物置于冰浴中，向其中加入2-（N，N-二乙基苯胺-4-基)-4，6-二氯-1，3，5-三嗪 (0.5mmol)，室温搅拌1h，然后在80-85℃的油浴中回流反应8-9h。冷却、浓缩， 用二氯甲烷和乙酸乙酯的的混合液(二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为3∶1)作洗脱 剂，通过硅胶柱色谱分离。所得粗产物用石油醚和二氯甲烷的混合液(石油醚与二 氯甲烷的体积比为1∶1)重结晶，得式XIV所示化合物的黄色针状晶体81mg。
质谱(EI MS)表征测得上述黄色针状晶体产物分子离子峰M/Z＝360；元素分析 值(质量百分含量)：C，63.23％(63.32％)；H，5.58％(5.59％)；N，31.04％ (31.09％)，括号中为理论值。X-射线分析及核磁共振谱，证明上述黄色针状晶体 产物结构如式XIV所示。(式XIV)
在氩气保护下，将10mL Eu(tta)3·3H2O(24.9×10-3mmol)的四氢呋喃溶液滴加到 10mL所制备的式XIV所示的化合物(24.9×10-3mmol)的四氢呋喃溶液中，常温下搅 拌30min。除去溶剂，用少量乙醚溶解、过滤，用正己烷作沉淀剂析出固体并洗涤、 干燥，得到式VIII所示配合物的黄色粉末31mg。
(式VIII)
质谱(MALDI-TOF MS)表征测得上述黄色粉末产物分子离子峰M/Z＝1176；元素 分析(质量百分含量)：C，43.80％(43.92％)；H，2.56％(2.74％)；N，9.41％ (9.53％)，括号中为理论值；证明上述黄色粉末产物结构如式VIII所示。将式VIII 所示配合物命名为[Eu(tta)3bpt]。
以丙酮为溶剂配制溶液A12，使溶液A12中各溶质浓度为：苯基三甲氧基硅烷 (PTS)，5.0×10-6mol/L；甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物，1.0×10-6mol/L；[Eu(tta)3bpt]， 1.0×10-6mol/L；配制浓度为1.0×10-4mol/L的Tween 20水溶液B12。在室温及搅拌 条件下，将溶液A12加入溶液B12中，使两者体积比为1∶4，制得以甲基丙烯酸甲 酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物(PTS水解并通过硅羟基缩合形成的) 的复合物为基质的，基于[Eu(tta)3bpt]的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C12。
将0.1mL浓度为1.0×10-6mol/L的巯丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液D12加入10 mL溶胶C12中，于25℃反应12小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中， 制得表面接有可供接枝反应的巯基基团的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶E12。
TEM结果表明，上述制备的溶胶C12中的荧光纳米粒子的平均粒径为10nm。 上述制备的溶胶E12中的荧光纳米粒子的尺寸分布为8～25nm，平均粒径为10nm。 由于APS的加入量远小溶胶C12中荧光纳米粒子的总质量，因此电镜表征实验测得 的C10溶胶和E10溶胶中纳米粒子的尺寸非常接近。将所制备的荧光纳米粒子离心 分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的PTS，气相色谱及ICP分析结果表 明，纳米粒子中有机硅氧烷PTS与Eu的摩尔比为1.0，纳米粒子中疏水高分子甲基 丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物与Eu离子的摩尔比为1.0，有机硅聚合物的质量百分数含 量为20％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶C12和E12中的荧光纳米粒子具有良 好的可见光激发发光性能，其在可见区的激发峰位于422nm，尾部延展到475nm。
实施例13：以PS、PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Tb(dppc)3]的荧光纳米粒子的制备
按文献(H.et al.，Anal.Chem.，2005，77，2643)介绍方法合成得到 [Tb(dppc)3](dppc＝4-(2，4，6，-三癸氧基苯基)吡啶-2，6-二羧酸)。
以四氢呋喃为溶剂配制溶液A13，使溶液A13中各溶质浓度为：1H，1H，2H，2H- 氟代十二烷基三乙氧基硅，1.0×10-4mol/L；PS，2.0×10-5mol/L；PMMA，2.0×10-5mol/L；[Tb(dppc)3]，5.0×10-5mol/L。用溶液A13替代实施例1的溶液A1，其他条 件同实施例1，制得以PS、PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物(1H，1H，2H，2H-氟 代十二烷基三乙氧基硅烷水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基于 [Tb(dppc)3]的荧光纳米粒子的溶胶C13。
将0.1mL浓度为1.0×10-6mol/L的羧乙基硅三醇纳(carboxyethylsilanetriol sodium)的甲醇溶液D13加入10mL溶胶C13中，于0℃反应24小时，离心分离， 将所得沉淀重新分散于纯水中，制得表面接有可供接枝反应的羧基基团的荧光纳米 粒子的溶胶，记为溶胶E13。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶E13中荧光纳米粒子的尺寸分布为60～120 nm，平均粒径为90nm。荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶E13中荧光纳米 粒子具有良好的紫外光激发发光性能，其激发峰位于320nm，发射主峰位于544nm。 将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的 1H，1H，2H，2H-氟代十二烷基三乙氧基硅，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子 中有机硅氧烷与Eu的摩尔比为0.2，纳米粒子中疏水高分子PS、PMMA与Eu离子 的摩尔比均为1.0，有机硅聚合物的质量百分数含量为10％。
实施例14：以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Er(tta)3terpy]的荧光纳米粒子的制备
按文献(Y.H.Kim，et al.，J.Luminescence 2007，127，707)介绍方法合成得到 [Er(tta)3terpy](terpy＝三联吡啶)。
以丙酮为溶剂配制溶液A14，溶液A14中各溶质浓度为：OTS，1.0×10-2mol/L； PMMA，1.0×10-2mol/L；[Er(tta)3terpy]，1.0×10-3mol/L；配制浓度为1.0×10-4mol/L 的非离子表面活性剂Triton X-100的水溶液B14。在10℃及搅拌条件下，将溶液A14 加入溶液B14中，使两者体积比1∶1，制得以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物 (OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基于[Er(tta)3terpy]的荧光 纳米粒子的溶胶，记为溶胶C14。
按照实施例1的方法，以溶胶C14替代实施例1所述的溶胶C1，制得表面具有 可供接枝反应的氨基活性基团的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶E14。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶E14中荧光纳米粒子的尺寸分布为50～100 nm，平均粒径为70nm。荧光光谱测试结果表明，在波长为355nm的光激发下，上 述制备的荧光纳米粒子具有良好近红外发光性能，其近红外发射主峰位于1530nm。
实施例15：以甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复 合物为基质的基于[Yb(hfac)3PBA]的荧光纳米粒子的制备
按文献(J.A.Weinstein，et al.，Dalton Trans.，2007，1484-1491；Y.Hasegawa，J. Phys.Chem.1996，100，10201)介绍方法合成得到[Yb(hfac)3PBA](hfac＝1，1，1，5，5，5-六 氟-戊烷-2，4-二酮负离子，PBA＝1-(9-亚甲基-蒽)-2-(2-吡啶)苯并咪唑)。
以丙酮为溶剂配制溶液A15，溶液A15中各溶质浓度为：OTS，1.0×10-3mol/L； 甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物，5.0×10-4mol/L；[Yb(hfac)3PBA]，2.0×10-4mol/L。以 溶液A15替代实施例1的溶液A1，其他条件同实施例1，制得以甲基丙烯酸甲酯苯 乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物(OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的 复合物为基质的，基于[Yb(hfac)3PBA]的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶C15。
按照实施例1的方法，以溶胶C15替代实施例1所述的溶胶C1，制得表面表面 具有可供接枝反应的氨基活性基团的所述荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶E15。
TEM结果表明，上述制备的溶胶E15中的荧光纳米粒子的尺寸分布为60～120 nm，平均粒径为80nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙 酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷OTS 与Yb的摩尔比为0.5，纳米粒子中疏水高分子甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物与Yb 离子的摩尔比为0.1，有机硅聚合物的质量百分数含量为40％。该荧光光谱测试结果 表明，在波长为380nm的光激发下，上述制备的溶胶E15中的荧光纳米粒子具有良 好的近红外光发光性质，其近红外发射主峰位于980nm。
实施例16：以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基质的基于 [Nd(tta)3BPTZ]的荧光纳米粒子的制备
按文献(M.Ward，et al.，Dalton Trans.，2003，808-814)介绍方法合成得到 [Nd(tta)3BPTZ](BPTZ＝3，6-双(2-吡啶基)四嗪)。
以丙酮为溶剂配制溶液A16，溶液A16中各溶质浓度为：OTS，1.0×10-2mol/L； PMMA，1.0×10-2mol/L；[Nd(tta)3BPTZ]，1.0×10-3mol/L；配制浓度为1.0×10-4mol/L 的水溶性高分子PVA水溶液B16。在20℃及搅拌条件下，将溶液A16加入溶液B16 中，使两者体积比为1∶50；制得以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物(OTS水解 并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基于[Nd(tta)3BPTZ]的荧光纳米粒子 的溶胶，记为溶胶C16。
按照实施例1的方法，以溶胶C16替代实施例1所述的溶胶C1，制得表面可供 接枝反应的活性基团为氨基的所述荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶E16。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶E16中的荧光纳米粒子的尺寸分布为40～ 80nm，平均粒径为65nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥， 以丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧 烷OTS与Nd的摩尔比为0.3，纳米粒子中疏水高分子PMMA与Nd离子的摩尔比 为0.1，有机硅聚合物的质量百分数含量为28％。荧光光谱测试结果表明，在波长为 337nm的光激发下，上述制备的溶胶中的荧光纳米粒子在1060nm附近具有良好近 红外发光性能。
实施例17：以甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复 合物为基质的基于[Eu(tta)3dpbt]荧光纳米粒子的制备
将OTS、APS、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物以及[Eu(tta)3dpbt]溶解于丙酮中， 配制成OTS浓度为2.3×10-3mol/L，APS浓度为4.6×10-5mol/L，甲基丙烯酸甲酯苯 乙烯共聚物浓度为2.9×10-6mol/L，[Eu(tta)3dpbt]浓度为2.3×10-4mol/L的丙酮溶液， 记为溶液F17。在室温及搅拌条件下，将1.5mL溶液F17注射加入7.5mL的浓度为 1.0×10-3mol/L的非离子表面活性剂Triton X-100(记为溶液B17)中(溶液F17与 溶液B17体积比为1∶5)，搅拌0.5hr，将反应得到的溶胶过Sephadex G-25色谱柱 除去丙酮与多余的表面活性剂(以水为洗脱液)，最终得到分散在水中的稳定溶胶， 即制得表面具有可供接枝反应的氨基活性基团的，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物、 有机硅氧烷和有机硅聚合物(OTS与APS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物 为基质的，基于[Eu(tta)3dpbt]的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶G17。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶G17中荧光纳米粒子的尺寸分布为10～ 50nm，平均粒径为27nm(图1中a所示)。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、 以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳 米粒子中有机硅氧烷OTS与Eu的摩尔比为0.6，纳米粒子中疏水高分子甲基丙烯酸 甲酯苯乙烯共聚物与Eu离子的摩尔比为0.01，有机硅聚合物的质量百分数含量为 25％。荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶G17中的荧光纳米粒子具有优良的 可见光激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到470nm。
实施例18：以丙烯酸酯-苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为 基质的基于[Eu(tta)3dmpbt]荧光纳米粒子的制备
按照公开号为CN101070318A的专利的实施例1和实施例2的方法制备得到式 IX所示的化合物[Eu(tta)3dmpbt]。
以丙酮为溶剂配制溶液F18，溶液F18中各溶质浓度为：DTS，1.0×10-6mol/L； APS浓度为4.6×10-5mol/L；丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，1.0×10-6mol/L； [Eu(tta)3dmpbt]，1.0×10-6mol/L；配制浓度为1.0×10-3mol/L的Tween 20水溶液B18。 将溶液F18加入B18中，使两者体积比为1∶3；在0℃及搅拌条件下反应24hr，制 得表面具有可供接枝反应的氨基活性基团的，以丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅 氧烷和有机硅聚合物(OTS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基 于[Eu(tta)3dmpbt]的荧光纳米粒子溶胶G18。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶G18中的荧光纳米粒子尺寸分布为20～ 50nm，平均粒径为31nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥， 以丙酮萃取其介质中的DTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧 烷DTS与Eu的摩尔比为0.5，纳米粒子中疏水高分子丙烯酸酯-苯乙烯共聚物与Eu 离子的摩尔比为1，有机硅聚合物的质量百分数含量为40％。荧光光谱测试结果表 明，上述制备的溶胶G18中的荧光纳米粒子具有良好的可见光激发发光性能，其在可 见区的激发峰位于409nm，尾部延展到458nm。
(式IX)
实施例19：以马来酸二丁基酯-苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复 合物为基质的基于结构如式IV配合物的荧光纳米粒子的制备
按照公开号为CN101066975A的专利的实施例10的方法制备得到结构式如式 X所示的配合物。
以四氢呋喃为溶剂配制F19，溶液F19中各溶质浓度为：PTS，1.0×10-3mol/L； APS，1.0×10-4mol/L；马来酸二丁基酯-苯乙烯共聚物，1.0×10-4mol/L；结构如式X 的铕配合物，2.0×10-4mol/L；配制浓度为1.0×10-3mol/L的Tween 40水溶液B19。 将溶液F19加入B19中，使两者体积比为1∶50；在80℃及搅拌条件下反应0.5hr， 制得表面可供接枝反应的活性基团为氨基的，马来酸二丁基酯-苯乙烯共聚物、有机 硅氧烷和有机硅聚合物(PTS与APS水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基 质的，基于结构如式IV的配合物的荧光纳米粒子溶胶，记为溶胶G19。
TEM结果表明，上述制备的溶胶G19中的荧光纳米粒子的尺寸分布为60～110 nm，平均粒径为85nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以 丙酮萃取其介质中的PTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷 PTS与Eu的摩尔比为0.2，纳米粒子中疏水高分子马来酸二丁基酯-苯乙烯共聚物与 Eu离子的摩尔比为0.5，有机硅聚合物的质量百分数含量为15％。上述制备的溶胶 G19中的纳米粒子在可见光及近红外激光激发下可发出红光。
(式X)
实施例20：以PMMA、有机硅氧烷、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物为基 质的基于[Eu(fod)3dpbt]配合物荧光纳米粒子的制备
以丙酮为溶剂配制溶液F20，溶液F20中各溶质浓度为：异丁基三甲氧基硅烷， 1.0×10-5mol/L；3-(2-氨乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1.0×10-6mol/L；PMMA，1.0×10-5mol/L；[Eu(fod)3dpbt]，2.0×10-4mol/L；配制浓度为1.0×10-3mol/L的两性离子型表 面活性剂十二烷基氨基丙酸钠水溶液B20。将溶液F20加入B20中，使两者体积比 为1∶1；在40℃及搅拌条件下反应6hr，制得得表面可供接枝反应的活性基团为氨基 的，PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物(异丁基三甲氧基硅烷和3-(2-氨乙基氨基) 丙基三甲氧基硅烷水解并通过硅羟基缩合形成的)的复合物为基质的，基于 [Eu(fod)3dpbt]的荧光纳米粒子溶胶，记为溶胶G20。
TEM结果表明，上述制备的溶胶G20中荧光纳米粒子的尺寸分布为40～90nm， 平均粒径为65nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃 取其介质中的异丁基三甲氧基硅烷，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有 机硅氧烷异丁基三甲氧基硅烷与Eu的摩尔比为0.1，纳米粒子中疏水高分子PMMA 与Eu离子的摩尔比为0.05，有机硅聚合物的质量百分数含量为8％。荧光光谱测试 结果表明，上述制备的溶胶G20中的荧光纳米粒子具有良好的可见光激发发光性能， 其在可见区的激发峰位于402nm，尾部延展到450nm。
实施例21：以二氧化硅为壳层，以包有[Eu(tta)3dpbt]的PMMA-有机硅聚合物复 合物的粒子为内核的壳-核结构纳米粒子的制备
按照实施例1的方法制备PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物为基质的，基于 [Eu(tta)3dpbt]的纳米粒子的溶胶C1。
将0.2mL浓度为0.5mol/L的四甲氧基硅烷(TMOS)甲醇溶液H14加入10mL上 述溶胶C1中，60℃反应2小时，离心分离，将所得沉淀分散于10mL水中，制得外 壳为二氧化硅层，内核为包有配合物[Eu(tta)3dpbt]的PMMA、有机硅氧烷和有机硅 聚合物的复合物的粒子的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶J21。
将0.1mL浓度为3.7×10-5mol/L的APS甲醇溶液D21加入到10mL上述制备的 溶胶J21中，于60℃反应1小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于水中，制得表 面具有氨基基团的，PMMA及有机硅聚合物为内核基质的，基于[Eu(tta)3dpbt]的核 -壳结构荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶K21。
TEM测试结果表明，上述制备溶胶J21中壳-核结构荧光纳米粒子的平均粒径 为84nm。上述制备的溶胶K21中壳-核结构荧光纳米粒子的尺寸分布为50～100 nm，平均粒径为85nm。电镜和EDX分析表明，所制备纳米粒子具有厚度为5纳米 的氧化硅壳层。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取 其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷OTS与 Eu摩尔比为0.4，荧光纳米粒子中疏水高分子PMMA与Eu离子的摩尔比为0.1，有 机硅聚合物的质量百分含量为40％。
荧光光谱测试结果表明，上述制备的溶胶J21和K21中荧光纳米粒子具有良好 的可见光激发发光性能，其在可见区的激发峰位于412nm，尾部延展到480nm。在波 长为832纳米的近红外激光激发下，此荧光纳米粒子可发出明亮的红光。
实施例22：以二氧化硅为壳层，以包有[Eu(tta)3dpbt]的PMMA-有机硅聚合物 复合物的粒子为内核的壳-核结构纳米粒子的制备
按照实施例8的方法制备以PMMA、有机硅氧烷和有机硅聚合物为基质的，基 于[Eu(fod)3dpbt]的纳米粒子的溶胶C8。
将1.0mL浓度为5.0×10-1mol/L的四乙氧基硅烷(TEOS)乙醇溶液H20加入10mL 上述溶胶C8中，80℃反应1小时，离心分离，将沉淀重新分散于10mL水中，制得 外壳为二氧化硅层，内核为包有配合物[Eu(fod)3dpbt]的PMMA、有机硅氧烷和有机 硅聚合物的复合物的粒子的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶J22。
将0.1mL浓度为1.0×10-5mol/L的巯基丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液(记为溶液 D22)加入10mL上述制备的溶胶J22中，20℃反应24小时，离心分离，将沉淀分 散于水中，制得表面具有巯基基团的，以二氧化硅为壳层，PMMA及有机硅聚合物 为内核基质的，基于[Eu(fod)3dpbt]的核-壳结构荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶 K22。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶K22中的壳-核结构荧光纳米粒子的尺寸 分布为50～90nm，平均粒径为60nm。电镜和EDX分析表明，上述制备的溶胶K22 中的纳米粒子具有平均厚度约为20纳米的氧化硅壳层。荧光光谱测试结果表明，上 述制备的溶胶K22中的荧光纳米粒子具有良好的可见光激发发光性能，其在可见区 的激发峰位于402nm，尾部延展到450nm。
实施例23：以二氧化硅为壳层，以包有[Eu(fod)3dmpbt]的丙烯酸酯苯乙烯共聚物 -有机硅聚合物复合物的粒子为内核的壳-核结构纳米粒子的制备
按照实施例9的方法制备以聚丙烯酸乙酯、有机硅氧烷和有机硅聚合物为基质 的，基于[Eu(fod)3dmpbt]的纳米粒子的溶胶C9。
将1.0mL浓度为5.0×10-1mol/L的TEOS乙醇溶液H20加入上述10mL溶胶 C9中，40℃反应6小时，离心分离，将所得沉淀分散于10mL水中，制得外壳为二 氧化硅层，内核为包有配合物[Eu(fod)3dpbt]的聚丙烯酸乙酯、有机硅氧烷和有机硅 聚合物的复合物的粒子的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶J23。
将0.1mL浓度为1.0×10-4mol/L的3-(2-氨乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液 D23加入10mL溶胶J23中，40℃反应6小时，离心分离，将所得沉淀分散于水中， 制得表面具有氨基基团的，以二氧化硅为壳层，聚丙烯酸乙酯-有机硅聚合物复合物 为内核基质的，基于[Eu(fod)3dpbt]的核-壳结构荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶 K23。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶K23中的壳-核结构荧光纳米粒子的尺寸 分布为35～65nm，平均粒径为50nm。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗 涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的OTS，气相色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子 中OTS与Eu的摩尔比为0.3，纳米粒子中疏水高分子PMMA与Eu离子的摩尔比为 2，有机硅聚合物的质量百分含量为10％。电镜和EDX分析表明，上述制备的溶胶 K21中的纳米粒子具有平均厚度约为7纳米的氧化硅壳层。荧光光谱测试结果表明， 上述制备的溶胶K23中的荧光纳米粒子具有良好的可见光激发发光性能，其在可见 区的激发峰位于409nm，尾部延展到460nm。
实施例24：以二氧化硅为壳层，以包有[Eu(tta)3bpt]的甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共 聚物-有机硅聚合物复合物的粒子为内核的壳-核结构纳米粒子的制备
按照实施例12的方法制备甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、有机硅氧烷和有机硅 聚合物的复合物为基质的，基于[Eu(tta)3bpt]的荧光纳米粒子的溶胶C12。
将0.1mL浓度为5.0×10-2mol/L的TMOS乙醇溶液H24加入10mL上述溶胶 C12中，0℃下反应24小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于10mL纯水中，制 得外壳为二氧化硅层，内核为包有配合物[Eu(tta)3bpt]的甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚 物、有机硅氧烷和有机硅聚合物的复合物的粒子的荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶 J24。
将0.1mL浓度为1.0×10-4mol/L的羧乙基硅三醇纳的水溶液D24加入10mL溶 胶J24中，0℃反应24小时，离心分离，将所得沉淀分散于水中，制得表面具有羧 基基团的，以二氧化硅为壳层，甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物-有机硅聚合物为内 核基质的，基于[Eu(tta)3bpt]的核-壳结构荧光纳米粒子的溶胶记为溶胶K24。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶J24中荧光纳米粒子平均粒径为12nm。 上述制备的溶胶K24中荧光纳米粒子尺寸分布为10～27nm，平均粒径为12nm。由 于羧乙基硅三醇纳的加入量远小溶胶J24中荧光纳米粒子的总质量，因此电镜表征 实验测得的J24溶胶和K24溶胶中纳米粒子的尺寸非常接近。电镜和EDS分析表明， 上述制备的溶胶K24中的纳米粒子具有平均厚度约为1纳米的氧化硅壳层。将所制 备的荧光纳米粒子离心分离、以水洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的PTS，气相 色谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷PTS与Eu的摩尔比为0.5，纳米 粒子中疏水高分子甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物与Eu离子的摩尔比为1.0，有机硅 聚合物的质量百分数含量为25％。
荧光光谱测试表明，上述制备的溶胶J24和K24中的荧光纳米粒子具有优异的 可见光激发发光性能，其在可见区的激发峰位于422nm，尾部延展到475nm。
实施例25：以二氧化硅为壳层，以包有[Eu(fod)3bpt]的聚马来酸二丁基酯-有机 硅聚合物复合物的粒子为内核的壳-核结构纳米粒子的制备
按照实施例11的方法制备以聚马来酸二丁基酯、有机硅氧烷和有机硅聚合物的 复合物为基质的，基于[Eu(fod)3bpt]的荧光纳米粒子溶胶C11。
将1.0mL浓度为5.0×10-1mol/L的TMOS乙醇溶液H25加入10mL上述溶胶 C11中，80℃反应1小时，离心分离，将所得沉淀重新分散于10mL纯水中，制得 表面具有羟基基团的，以二氧化硅为壳层，聚马来酸二丁基酯-有机硅聚合物为内 核基质的，基于[Eu(fod)3bpt]的核-壳结构荧光纳米粒子的溶胶，记为溶胶J25。
TEM测试结果表明，上述制备的溶胶J25中荧光纳米粒子尺寸分布为150～220 nm，平均粒径为200nm。电镜和EDX分析表明，上述制备的溶胶J25中的纳米粒子 具有平均厚度约为10纳米的氧化硅壳层。将所制备的荧光纳米粒子离心分离、以水 洗涤、干燥，以丙酮萃取其介质中的1H，1H，2H，2H-氟代辛基三甲氧基硅烷，气相色 谱及ICP分析结果表明，纳米粒子中有机硅氧烷1H，1H，2H，2H-氟代辛基三甲氧基硅 烷与Eu离子的摩尔比为1，纳米粒子中聚马来酸二丁基酯与Eu的摩尔比为0.1。有 机硅聚合物(1H，1H，2H，2H-氟代辛基三甲氧基硅烷水解并通过硅羟基缩合形成的网 状聚合物)的质量百分含量为40％。荧光测试表明，上述制备的溶胶J25中的荧光 纳米粒子具有优良的可见光激发发光性能，在可见光激发下可发出明亮的红光。
实施例26：纳米荧光生物探针(荧光纳米粒子标记山羊抗人IgG)的合成及其 效果验证
以实施例1所制备的荧光纳米粒子为标记粒子标记山羊抗人IgG。具体方法如下 所述：
将0.1mL质量百分浓度为1％的戊二醛水溶液加入2mL实施例1制备的荧光纳 米粒子溶胶E1中，室温搅拌1hr，离心分离，将沉淀用Tris缓冲溶液(pH＝7.5，50mM) 洗涤两次后分散于2mL的Tris缓冲溶液中，制得经戊二醛活化的荧光纳米粒子的溶 胶。向此溶胶中加入20μL浓度为70～80μg/mL的由FITC标记的山羊抗人IgG(记 为IgG-FITC，室温反应2hr，再加入2mg牛血清蛋白(BSA)并继续反应2h，然 后加入1mg NaBH4反应1hr。将得到的反应液离心分离，沉淀用Tris缓冲溶液洗涤 2次后分散于含有牛血清蛋白(质量百分含量为0.1％)和NaN3(质量百分含量为0.01 ％)的Tris缓冲溶液中，即得到纳米荧光生物探针(荧光纳米粒子标记山羊抗人IgG) 胶体。
荧光光谱测试结果表明，接于纳米粒子表面的IgG-FITC中的FITC的荧光可被 检测到，其激发谱(λem＝530nm)和发射谱(λex＝470nm)如图4所示。该实验结果 表明山羊抗人IgG已被共价键合于所述的荧光纳米粒子表面，构成了荧光免疫分析 纳米探针。纳米探针中FITC与[Eu(tta)3dpbt]的激发谱与发射谱如图4所示，Eu离子 荧光发射峰尖锐且具有很大的斯托克斯位移，而FITC荧光发射峰很宽且激发谱与发 射谱重叠较大，Eu离子荧光峰高约为FITC荧光峰高的80倍，说明在发光性能上， 本发明的荧光纳米粒子探针远优于传统有机染料探针。图4中，左图为荧光纳米粒 子与经有机荧光染料FITC标记的山羊抗人IgG结合后获得的纳米粒子探针中 [Eu(tta)3dpbt]的激发谱(图中A)(λem＝614nm)与发射谱(图中B)(λex＝412nm)；右图 为FITC的激发谱(图中A)(λem＝530nm)与发射谱(图中B)(λex＝470nm)。
实施例27：纳米荧光生物探针(荧光纳米粒子标记山羊抗人IgG)的合成
以实施例2所制备的荧光纳米粒子为标记物标记山羊抗人IgG。具体方法如下所 述：
将实施例2制备的荧光纳米粒子溶胶C1中在40,000g下离心，所得沉淀重 新分散于水中。此过程重复两次以除去过量的表面活性剂CTAB；将荧光纳米颗粒 沉淀分散于8mL的Tris-HCl缓冲溶液中(pH＝7.8，10mmol L-1)，然后与0.1mL 浓度为10mg/mL的山羊抗人IgG溶液混合，并于25℃恒温摇动2小时，使得 山羊抗人IgG吸附于荧光纳米粒子表面形成山羊抗人IgG与荧光纳米粒子的复合 物(记为抗IgG◎LNP)。离心分离，沉淀用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两次，将所 得到的抗IgG◎LNP分散于8mL Tris-HCl缓冲溶液中待用。该生物探针的胶体 溶液在420nm的光激发下可发出Eu离子的特征辐射，最强发射波长为614nm。
实施例28：荧光纳米粒子标记山羊抗人IgG的用于人IgG的免疫检测的效果验 证
将玻璃片放入浓硫酸中浸泡1天，去离子水冲洗后放入饱和氢氧化钠水溶液中浸 泡1天，再次用去离子水冲洗干净，依次放入丙酮和乙醇中超声处理15min，用乙 醇冲洗后氮气吹干，获得清洁的玻璃基片。将此清洁基片放入浓度为10mmol/L的 APS甲醇溶液中浸泡12h，取出后用乙醇冲洗、氮气吹干，得到表面氨基硅烷化的基 片。将此表面氨基硅烷化的基片放入质量百分浓度为5％的戊二醛水溶液中，室温反 应12h，取出后用PBST缓冲溶液(50mM，pH＝7.4，tween 200.05％)反复冲洗，用去 离子水冲洗干净，氮气吹干，制得表面醛基化的基片。将含有1.0mg/mL人IgG的 PBS缓冲溶液(50mM，pH＝7.4)点样在上述制备的表面醛基化的基片上，放入湿盒 中37℃孵育2h。然后，用PBS缓冲溶液(50mM，pH＝7.4)冲洗该基片三次后，再 将其放入含质量百分浓度为1％的BSA的PBS缓冲溶液(50mM，pH＝7.4)中，于 37℃孵育2h。用PBS缓冲溶液(50mM，pH＝7.4)冲洗基片三次后，将其放入实施 例26所制备的荧光免疫分析纳米探针的胶体溶液中，于37℃孵育1h。将纳米探针 识别后的样品取出后用Tris-Tween20缓冲溶液(含质量百分含量为0.05％的 Tween20，pH为7.5，50mM的Tris溶液)冲洗三次，用去离子水反复冲洗，氮气 吹干。
将上述反应后的基片在荧光显微镜下观察，结果表明，在波长为406nm的光激 发下，可以看到经人IgG点样后的位置上发出的明亮的红光，表明所合成的荧光免 疫分析纳米探针对人IgG有很好的特异性识别功能。
实施例29：采用抗IgGLNP作为荧光探针，以固相夹层荧光免疫分析法检测人 IgG。
将山羊抗人IgG分散于pH＝9.16的碳酸盐缓冲溶液中，使其浓度为20μg mL-1。 将此山羊抗人IgG溶液加入酶标板中，每孔加入量为100μL。让此酶标板在4℃保 温过夜。倒出山羊抗人IgG溶液后，用Tris-HCl-Tween缓冲溶液(pH＝7.8，10mmol L-1，含0.5％Tween-20)清洗酶标板3次。之后，将BSA(1.0％)的Tris-HCl-Tween 缓冲溶液加入上述酶标板孔中，每孔加入量为150μL，将此酶标板放在恒温混匀仪 中于25℃保温1.5h。倒出BSA溶液，用Tris-HCl-Tween缓冲溶液清洗酶标板3次， 在不同的孔中分别加入浓度为0.1ng/mL至10μg/mL的人IgG溶液，并于37℃温育 1.5h.。倒出人IgG溶液，用Tris-HCl-Tween缓冲溶液清洗酶标板3次。加入例27 制备的荧光探针抗IgGLNP，并于37℃温育1.5h。最后将过量的荧光探针溶液倒 出，并用Tris-HCl-Tween缓冲溶液清洗酶标板3次。
以波长为415nm的光为激发光，采用多功能酶标仪测量酶标板各孔的荧光强度， 结果表明，当人IgG浓度在5ng/mL～5μg/mL范围内时，所测得荧光强度随人IgG 浓度线性增加(图5)。此荧光免疫荧光分析的检测限为15ng/mL。