利用白化苗创制水稻不育系的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711499302.8 (22)申请日 2017.12.30 (71)申请人 青岛袁策生物科技有限公司 地址 266000 山东省青岛市李沧区金水路 171号16号楼 (72)发明人 刘佳音张国栋吴洁芳万吉丽 徐春莹米铁柱 (74)专利代理机构 北京华仁联合知识产权代理 有限公司 11588 代理人 李冰 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 15/89(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018。

2、.01) (54)发明名称 利用白化苗创制水稻不育系的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用白化苗创制水稻不 育系的方法， 包括以下步骤： 选择含有纯合白化 苗突变体的粳稻品种武运粳7号， 利用基因枪转 化技术和农杆菌转化技术来创制水稻细胞质不 育系。 A.白化苗突变体水稻愈伤的诱导； B.突变 体水稻愈伤的基因枪转化； C.突变体水稻愈伤的 农杆菌转化； D.抗性植株的获得。 本发明方法解 决了水稻三系杂交中不育系较少， 对水稻种质资 源利用率较低的缺点， 为水稻三系杂交培育出更 多更优良的品种提供了可能。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 108220330 A 2018.06。

3、.29 CN 108220330 A 1.一种利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于： 选择含有纯合白化苗突变体 的粳稻品种武运粳7号为受体材料创制不育系。 2.根据权利要求1所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 选择含有纯合白化苗突变体的粳稻品种武运粳7号， 利用基因枪转化技术和农杆菌转化 技术来创制水稻细胞质不育系。 3.根据权利要求1所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： A.白化苗突变体水稻愈伤的诱导； B.突变体水稻愈伤的基因枪转化； C.突变体水稻愈伤的农杆菌转化； D.抗性植株的获得。 4.根据权利要求3所述利用。

4、白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 所述A进一步 包括： (1)以所述武运粳7号突变体成熟种子去壳并烘干处理； (2)配置脱分化培养基， 并将上述(1)中的种子在超净工作台中消毒灭菌处理后接入脱 分化培养基内； (3)上述(2)中种子消毒灭菌处理， 备用； (4)愈伤组织诱导培养； (5)将材料在上述(3)的条件下培养14d后取出， 选取大小均一， 质地紧密的愈伤即为水 稻转化所需愈伤。 5.根据权利要求4所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 所述步骤(3) 上述(2)中种子消毒灭菌处理的具体流程： 先用95乙醇进行浸泡处理， 将酒精倒出后清洗 完成后再用40次氯酸钠震荡。

5、浸泡30分钟， 浸泡结束后倒掉次氯酸钠溶液并用灭菌锅的蒸 馏水清洗数次， 备用。 6.根据权利要求4所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 所述步骤(4) 愈伤组织诱导培养： 将上述(2)中的培养基密封， 放入28恒温暗培养箱和光照培养箱中进 行愈伤组织诱导培养。 7.根据权利要求3所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 所述B进一步 包括： (1)将上述步骤A中的愈伤材料在高渗培养基中预培养； (2)DNA微弹制备； (3)将上述(2)中制备好的DNA微弹轰击(1)中愈伤组织； (4)将上述(3)中的愈伤组织转接到含有相应抗生素的诱导培养基培养， 筛选抗性愈 伤。 8。

6、.根据权利要求3所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 所述C进一步 包括： (1)上述(2)中基因枪转化筛选的到的抗性愈伤再次进行农杆菌转化； (2)农杆菌侵染后将其转移到铺有无菌滤纸的共培养基上培养。 9.根据权利要求3所述利用白化苗创制水稻不育系的方法， 其特征在于， 所述D进一步 权利要求书 1/2 页 2 CN 108220330 A 2 包括： (1)将上述(3)中共培养结束后的愈伤组织转移至抗生素培养基上进行抗性筛选； (2)经过上述(1)筛选后分化培养， 培养后分化出幼苗； (3)将上述(2)中的分化苗转入生根培养基上进行生根培养； (4)上述(3)中的分化苗生长到。

7、两叶一心时进行检测， 筛选出阳性植株。 10.一种如权利要求19中任一项所述利用白化苗创制水稻不育系的方法制备的水稻 不育系。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108220330 A 3 利用白化苗创制水稻不育系的方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学植物品系培育技术领域， 特别涉及一种利用水稻白化苗突 变体创制不育系的方法。 背景技术 0002 杂交水稻品种主要分为三系杂交稻和两系杂交稻。 所谓三系法中的三系是指核质 互作雄性不育系、 保持系和恢复系。 1970年， 在袁隆平先生的指导下， 李必湖先生在海南三 亚南红农场的水沟边发现了1株花粉败育的野生稻(简称野败， 核质互作不育)。

8、， 为雄性不育 系的选育打开了突破口， 也为我国 “三系法” 杂交水稻研究和应用奠定了基础。 0003 随后通过全国育种家们的团结合作， 成功实现了三系配套， 率先在世界上实现大 面积利用自花授粉植物的杂种优势。 尤其是杂交稻 “汕优63” 的育成， 使我国杂交水稻种植 面积迅速扩大， 至1984年， 全国杂交水稻种植面积已达到1.33亿亩。 随着更多优良组合的出 现， 至1991年杂交水稻种植面积已达到2.64亿亩， 占水稻总种植面积的55。 0004 然而， 随着研究和应用的不断深入， 三系杂交育种的技术缺陷也逐渐突显出来， 主 要表现在以下几个方面： 0005 (1)对种质资源利用的范围。

9、窄， 虽然已经发现一些不育系， 但相较庞大的水稻种质 资源谱来说， 不育系还是非常少； 我国水稻种资源中可转成不育系或保持系的只有不到 1， 而可用作恢复系的只有5左右， 这就导致不育系和恢复系遗传多态性不高， 不易开展 聚合育种， 杂交组合同质化程度过高； 0006 (2)受恢保关系的制约， 培育优质、 高产、 多抗的杂交组合周期长、 难度大、 很难将 新的突变体转入亲本品系。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题在于， 利用白化苗创制新的细胞质不育系， 为水稻三 系育种提供更多的种质资源。 0008 为解决上述技术问题， 本发明提供了一种利用白化苗创制水稻不育系的方法， 选 择含有。

10、纯合白化苗突变体的粳稻品种武运粳7号为受体材料创制不育系。 0009 选择含有纯合白化苗突变体的粳稻品种武运粳7号， 利用基因枪转化技术和农杆 菌转化技术来创制水稻细胞质不育系。 0010 包括以下步骤： 0011 A.白化苗突变体水稻愈伤的诱导； 0012 B.突变体水稻愈伤的基因枪转化； 0013 C.突变体水稻愈伤的农杆菌转化； 0014 D.抗性植株的获得。 0015 所述A进一步包括： 0016 (1)以所述武运粳7号突变体成熟种子去壳并烘干处理； 说明书 1/8 页 4 CN 108220330 A 4 0017 (2)配置脱分化培养基， 并将上述(1)中的种子在超净工作台中消毒灭。

11、菌处理后接 入脱分化培养基内； 0018 (3)上述(2)中种子消毒灭菌处理， 备用； 0019 (4)愈伤组织诱导培养； 0020 (5)将材料在上述(3)的条件下培养14d后取出， 选取大小均一， 质地紧密的愈伤即 为水稻转化所需愈伤。 0021 所述步骤(3)上述(2)中种子消毒灭菌处理的具体流程： 先用95乙醇进行浸泡处 理， 将酒精倒出后清洗完成后再用40次氯酸钠震荡浸泡30分钟， 浸泡结束后倒掉次氯酸 钠溶液并用灭菌锅的蒸馏水清洗数次， 备用。 0022 所述步骤(4)愈伤组织诱导培养： 将上述(2)中的培养基密封， 放入28恒温暗培 养箱和光照培养箱中进行愈伤组织诱导培养。 00。

12、23 所述B进一步包括： 0024 (1)将上述步骤A中的愈伤材料在高渗培养基中预培养； 0025 (2)DNA微弹制备； 0026 (3)将上述(2)中制备好的DNA微弹轰击(1)中愈伤组织； 0027 (4)将上述(3)中的愈伤组织转接到含有相应抗生素的诱导培养基培养， 筛选抗性 愈伤。 0028 所述C进一步包括： 0029 (1)上述(2)中基因枪转化筛选的到的抗性愈伤再次进行农杆菌转化； 0030 (2)农杆菌侵染后将其转移到铺有无菌滤纸的共培养基上培养。 0031 所述D进一步包括： 0032 (1)将上述(3)中共培养结束后的愈伤组织转移至抗生素培养基上进行抗性筛选； 0033 。

13、(2)经过上述(1)筛选后分化培养， 培养后分化出幼苗； 0034 (3)将上述(2)中的分化苗转入生根培养基上进行生根培养； 0035 (4)上述(3)中的分化苗生长到两叶一心时进行检测， 筛选出阳性植株。 0036 一种如前述任一项所述利用白化苗创制水稻不育系的方法制备的水稻不育系。 0037 本发明有益效果包括： 提供了利用水稻白化苗创制水稻细胞质不育系的新方法， 解决了水稻三系杂交中不育系较少， 对水稻种质资源利用率较低的缺点， 为水稻三系杂交 培育出更多更优良的品种提供了可能。 附图说明 0038 图1为本发明实施例所述基因枪转化后培养4weeks后的愈伤图； 0039 图2为本发明。

14、实施例所述农杆菌转化后分花前的愈伤组织图； 0040 图3为本发明实施例所述农杆菌转化后的再生植株图； 其中， 左边为分化芽， 右边 为转入生根培养基生根后的植株； 0041 图4为本发明实施例所述部分植株的PCR鉴定图； 其中： M： DNA分子量标准； -： 负/阴 性对照； +： 正/阳性对照； H2O为水对照上图为检测基因枪转化元件的PCR鉴定， 下图为农杆 菌转化元件的PCR鉴定。 说明书 2/8 页 5 CN 108220330 A 5 具体实施方式 0042 下面结合实施例详述本发明。 为使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚、 明 确， 以下参照附图并举实施例对本发明进一步详。

15、细说明， 但本发明并不局限于这些实施例。 0043 本发明提供了一种利用水稻白化苗突变体培育不育系的方法， 选择含有纯合白化 苗突变体的粳稻品种武运粳7号为受体材料， 通过基因工程的手段创制出新的水稻不育系 材料。 本发明提供的利用水稻白化苗培育细胞质不育系的方法， 为培育新型的水稻细胞质 不育系提供了方向， 也为三系杂交培育新的水稻品种提供更多的种质资源。 0044 针对上述技术问题， 本发明目的是提供一种利用水稻白化苗突变体创制水稻细胞 质不育系的方法。 遗传学原理表明， 白化苗突变体是一对隐性单基因控制， 在四叶期前呈现 白化， 以后逐渐转绿。 由于携带白化苗突变体的武运粳7号为白化基因。

16、的突变体， 在四叶期 后也不会转绿， 又因白化苗的前质体中基因的拷贝数较低， 因此较适合用于叶绿体转化。 在 利用其创制新型水稻细胞质不育系时， 首先用基因枪法转化白化苗愈伤， 加大筛选压， 以期 得到同质化的转化苗； 然后， 在进行完基因枪转化后， 愈伤培养恢复正常状态后再进行农杆 菌转化， 转入白化基因的显性基因， 筛选得到可使白化苗恢复正常绿色状态。 转化结束后， 选择合适浓度的筛选压对转化后的愈伤进行筛选， 最终得到新型水稻细胞质不育系。 0045 为解决上述技术问题， 本发明提供了一种利用白化苗创制水稻不育系的方法， 选 择含有纯合白化苗突变体的粳稻品种武运粳7号为受体材料创制不育系。

17、。 0046 选择含有纯合白化苗突变体的粳稻品种武运粳7号， 利用基因枪转化技术和农杆 菌转化技术来创制水稻细胞质不育系。 0047 包括以下步骤： 0048 A.白化苗突变体水稻愈伤的诱导； 0049 B.突变体水稻愈伤的基因枪转化； 0050 C.突变体水稻愈伤的农杆菌转化； 0051 D.抗性植株的获得。 0052 所述A进一步包括： 0053 (1)以所述武运粳7号突变体成熟种子去壳并烘干处理； 0054 (2)配置脱分化培养基， 并将上述(1)中的种子在超净工作台中消毒灭菌处理后接 入脱分化培养基内； 0055 (3)上述(2)中种子消毒灭菌处理， 备用； 0056 (4)愈伤组织诱。

18、导培养； 0057 (5)将材料在上述(3)的条件下培养14d后取出， 选取大小均一， 质地紧密的愈伤即 为水稻转化所需愈伤。 0058 所述步骤(3)上述(2)中种子消毒灭菌处理的具体流程： 先用95乙醇进行浸泡处 理， 将酒精倒出后清洗完成后再用40次氯酸钠震荡浸泡30分钟， 浸泡结束后倒掉次氯酸 钠溶液并用灭菌锅的蒸馏水清洗数次， 备用。 0059 所述步骤(4)愈伤组织诱导培养： 将上述(2)中的培养基密封， 放入28恒温暗培 养箱和光照培养箱中进行愈伤组织诱导培养。 0060 所述B进一步包括： 说明书 3/8 页 6 CN 108220330 A 6 0061 (1)将上述步骤A中。

19、的愈伤材料在高渗培养基中预培养； 0062 (2)DNA微弹制备； 0063 (3)将上述(2)中制备好的DNA微弹轰击(1)中愈伤组织； 0064 (4)将上述(3)中的愈伤组织转接到含有相应抗生素的诱导培养基培养， 筛选抗性 愈伤。 0065 所述C进一步包括： 0066 (1)上述(2)中基因枪转化筛选的到的抗性愈伤再次进行农杆菌转化； 0067 (2)农杆菌侵染后将其转移到铺有无菌滤纸的共培养基上培养。 0068 所述D进一步包括： 0069 (1)将上述(3)中共培养结束后的愈伤组织转移至抗生素培养基上进行抗性筛选； 0070 (2)经过上述(1)筛选后分化培养， 培养后分化出幼苗；。

20、 0071 (3)将上述(2)中的分化苗转入生根培养基上进行生根培养； 0072 (4)上述(3)中的分化苗生长到两叶一心时进行检测， 筛选出阳性植株。 0073 一种如前述任一项所述利用白化苗创制水稻不育系的方法制备的水稻不育系。 0074 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下： 0075 一种利用水稻白化苗突变体创制水稻不育系的方法， 选择含有纯合白化苗突变体 的粳稻品种武运粳7号， 利用基因枪转化技术和农杆菌转化技术来创制水稻细胞质不育系。 0076 本发明所述的一种利用水稻白化苗突变体创制不育系的方法， 其中， 包括以下步 骤： 0077 白化苗突变体水稻愈伤的诱导 0078 以。

21、所述武运粳7号突变体成熟种子去壳并烘干处理； 0079 配置脱分化培养基， 并将上述中的种子在超净工作台中消毒灭菌处理后接入脱 分化培养基内； 0080 上述中种子消毒灭菌处理的具体流程： 先用95乙醇进行浸泡处理， 将酒精倒 出后清洗完成后再用40次氯酸钠震荡浸泡30分钟， 浸泡结束后倒掉次氯酸钠溶液并用灭 菌锅的蒸馏水清洗数次， 备用； 0081 将上述中的培养基密封， 放入28恒温暗培养箱和光照培养箱(L/N16h/8h) 中进行愈伤组织诱导培养； 0082 将材料在上述的条件下培养14d后取出， 选取大小均一， 质地紧密的愈伤即为水 稻转化所需愈伤。 0083 突变体水稻愈伤的基因枪转。

22、化 0084 将上述(1)中的愈伤材料在高渗培养基中预培养3h， 用于调节愈伤组织的渗透压； 0085 DNA微弹制备： 取适量金粉悬浮液于离心管中， 加入质粒； 在旋涡震荡状态下依次 缓慢加入亚精胺溶液和CaC12溶液， 充分震荡后静置； 离心后， 弃上清液， 加入无水乙醇， 充 分悬浮； 重复一次； 最后加入无水乙醇重悬； 0086 将上述中制备好的DNA微弹轰击中愈伤组织； 0087 将上述中的愈伤组织转接到含有相应抗生素的诱导培养基上27暗培养， 筛选 抗性愈伤。 0088 突变体水稻愈伤的农杆菌转化 说明书 4/8 页 7 CN 108220330 A 7 0089 上述(2)中基因。

23、枪转化筛选的到的抗性愈伤再次进行农杆菌转化； 0090 农杆菌侵染后将其转移到铺有无菌滤纸的共培养基上， 26暗培养2d 0091 抗性植株的获得 0092 将上述(3)中共培养结束后的愈伤组织转移至合适浓度的抗生素培养基上进行抗 性筛选； 0093 经过上述筛选后， 挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转入含有最合适浓度的抗生 素的分化培养基上， 培养后分化出幼苗； 0094 将上述中的分化苗转入生根培养基上进行生根培养； 0095 上述中的分化苗生长到两叶一心时进行检测， 筛选出阳性植株。 0096 本发明实施例中具体涉及三个基因， 分别是HYG、 NPTII和EAT1。 HYG用作抗性筛选 基因。

24、， 来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)， 编码的蛋白可抗潮霉素， 用于转 基因愈伤组织和植株的筛选， 其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2； NPTII用作抗性筛选基因， 来源于大肠杆菌(Escherichia coli)， 编码的蛋白可抗卡 那霉素， 用于转基因愈伤组织和植株的筛选， 其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4； EAT1为水稻内源基因， 其蛋白参与水稻绒毡层细胞发育的调控， 其突 变体绒毡层细胞死亡延迟， 花药干瘪、 花粉粒败育， 不能形成正常的花粉粒。 其核苷酸。

25、序列 及氨基酸序列分别见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6 0097 实施例1： 水稻愈伤的基因枪转化 0098 经过以下步骤： 0099 种子消毒 0100 去掉外皮的水稻种子在95的乙醇里面浸泡2-3分钟； 0101 在40的次氯酸钠溶液中震荡漂洗15分钟， 更换一次漂洗液继续震荡漂洗15分 钟； 0102 用无菌蒸馏水漂洗种子4遍。 0103 愈伤诱导 0104 在28光照培养箱诱导愈伤组织14天。 0105 基因枪转化 0106 转化前将愈伤组织在高渗培养基中预培养3h， 以调节愈伤组织的渗透压； 0107 金粉悬浮液的制备： 称取60mg金粉于1.5mL EP管中， 加入。

26、1mL无水乙醇， 10000rpm/ min震荡1-2min， 弃去上清液； 重复上述步骤一次； 将金粉悬浮于1mL无菌ddH2O中， -20保 存； 0108 DNA微弹制备： 吸取100 l金粉悬浮液于1.5mL EP管中， 加入质粒(1 g/ L)5 L； 0109 在旋涡震荡状态下依次缓慢加入0.1mol/L亚精胺溶液40 L和2.5mol/LCaC12溶液 100 L， 充分震荡3min后静置2min； 10000rpm/min离心1min， 弃去上清液， 加入250 l无水乙 醇， 充分悬浮， 重复一次； 最后加入120 L无水乙醇重悬； 0110 微弹轰击： 先将基因枪整个装置及。

27、相关耗材用酒精进行消毒； 装好可裂膜、 铜网及 飞行膜， 放入待轰击的样品， 调整轰击距离； 打开进气阀， 调姐压力， 打开真空泵， 抽真空至 25-28inchHg， 用制备好的微弹轰击水稻愈伤组织， 轰击完成后， 解除负压， 取出样品， 用封 口膜封严培养皿， 进行后续培养。 说明书 5/8 页 8 CN 108220330 A 8 0111 将上述4中的愈伤组织转接到含有相应抗生素的诱导培养基上27暗培养， 筛选 抗性愈伤。 0112 实施例2 基因枪转化后愈伤组织的农杆菌转化 0113 农杆菌转化 0114 挑取单菌落， 接种至25mL新鲜制备的农杆菌培养基(添加抗生素)， 28250。

28、- 300rpm摇培过夜， 扩培农杆菌至0.3OD5501.0； 0115 将菌液以6000g离心5分钟(4)， 轻柔重悬农杆菌至OD5500.1(添加100 M AS， AS溶于DMSO的母液浓度为100mmol/L)； 0116 侵染预培养的愈伤5-10分钟， 每隔一定时间轻柔地翻转或摇动培养瓶； 0117 去除农杆菌菌液， 在滤纸上阴干愈伤组织； 0118 将愈伤组织放置在铺有滤纸的共培养基平板上， 每皿放置量以愈伤之间有缝隙为 准； 0119 于21-25培养箱黑暗培养72h； 0120 常规方法漂洗愈伤组织后， 阴干并转移至筛选培养基， 于28黑暗培养。 0121 实施例3 抗性植株。

29、的获得 0122 经以下步骤： 0123 抗性筛选 0124 挑取共培养2d的愈伤组织于培养皿中， 若愈伤组织表面有菌体存在可用无菌水冲 洗3-5次， 最后一次用含有500mg/LCef无菌水静置1h； 0125 静置后置于无菌滤纸上干燥30分钟， 直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在； 0126 处理完成后将愈伤组织转移至卡那霉素浓度200mg/L和400mg/L Timentin的筛选 培养基进行筛选抗性愈伤； 0127 28暗培养， 15d筛选一次， 共筛选两次。 0128 分化 0129 将筛选两次的愈伤在筛选培养基上长至0.2mm时， 转移至预分化培养基， 黑暗条 件下28培养7-10天。

30、； 0130 将愈伤组织转移到分化培养基， 2-3周后可见幼芽； 0131 待小苗生长至7-8cm时， 转移到生根培养基， 7天后炼苗、 移栽。 0132 转基因植株的PCR检测 0133 取本实施例中转基因水稻植株叶片， 抽取总DNA。 以HYG-EAT1跨区域设计引物， 对 T0代转基因水稻基因组DNA进行PCR扩增， 以确定基因枪转化使目的基因整合到叶绿体基因 组中， 扩增片段为762bp。 扩增程序为： 9410min； 941min， 601min， 721min； 35循环； 7210min。 正向引物序列为： 5 -ACTCTATCAGAGCTTGGTTG-3 ； 反向引物序列为。

31、： 5 - ACATCAACCCACTCCCACTGT-3 。 以NPTII基因序列为模板设计引物， 对T0代转基因水稻基因组 DNA进行PCR扩增， 以确定农杆菌转化使目的基因整合到核基因组中， 扩增片段为651bp。 扩 增程序为： 9410min； 941min， 621min， 7230s； 35循环； 7210min。 正向引物序列为： 5 -atggggattgaacaagatgga-3 ； 反向引物序列为： 5 -tggcgaacagttcggctggc-3 0134 以上所述， 仅是本发明的几个实施例， 并非对本发明做任何形式的限制， 虽然本发 明以较佳实施例揭示如上， 然而并。

32、非用以限制本发明， 任何熟悉本专业的技术人员， 在不脱 说明书 6/8 页 9 CN 108220330 A 9 离本发明技术方案的范围内， 利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等 效实施案例， 均属于本发明技术方案保护范围内。 0135 SEQ ID NO.1 0136 atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgat gcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaata 。

33、gctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtg cttgacattggggagtttagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacct gcctgaaaccgaactgcccgctgttctacaaccggtcgcggaggctatggatgcgatcgctgcggccgatcttagcc agacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttca。

34、tatgcgcgatt gctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatga gctgatgctttgggccgagga 0137 ctgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacag cggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtgg ttggcttgtatggagcagcagacgcgc。

35、tacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccacgactccgggc gtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgc agggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggcc gtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaagaa atag 0138 SEQ I。

36、D NO.2 0139 MKKPELTATSVEKFLIEKFDSVSDLMQLSEGEESRAFSFDVGGRGYVLRVNSCADGFYKDRYVYRHFAS AALPIPEVLDIGEFSESLTYCISRRAQGVTLQDLPETELPAVLQPVAEAMDAIAAADLSQTSGFGPFGPQGIGQYTT WRDFICAIADPHVYHWQTVMDDTVSASVAQALDELMLWAEDCPEVRHLVHADFGSNNVLTDNGRITAVIDWSEAMFG DSQYEVANIFFWRPWLACMEQQTRYFERRHPELAGSPRLRAYMLRIGLDQLYQSLVDGNFDD。

37、AAWAQGRCDAIVRSG AGTVGRTQIARRSAAVWTDG 0140 CVEVLADSGNRRPSTRPRAKK 0141 SEQ ID NO.3 0142 atggggattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggc acaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaaga ccgacctgtccggtgccctgaatgaactccaggacgaggcagcgcggctatcgtggct。

38、ggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatct cctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatc cggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtc gatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccg。

39、aactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcc cgacggcgaggatctcgtcgtgacacatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctg gattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaa gagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcctt 说明书 7/8 页 10 CN 108220330 A 10 cta。

40、tcgccttcttgacgagttcttctga 0143 SEQ ID NO.4 0144 MGIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNE 0145 LQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADA 0146 MRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMP 0147 DGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELG。

41、GEWADR 0148 FLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF 0149 SEQ ID NO.5 0150 ATGATTGTTGGGGCTGGTTACTTTGAGGATTCCCACGATCAAAGTCTCATGGCAGGATCTTTGATCCAT GACTCAAATCAAGCTCCTGCAAGCAGTGAAAACACAAGCATTGATTTGCAGAAATTCAAAGTGCACCCGTACTCAAC AGAAGCTCTCTCGAATACGGCCAATCTAGCTGAAGCTGCAAGAGCAATTAACCACCTTCAACATCAACTAGAAATTG ATTTGGAGCAAGAG。

42、GTTCCCCCAGTAGAAACTGCAAACTGGGATCCAGCTATCTGCACTATACCAGATCATATCATC AACCATCAGTTTAGCGAAGATCCACAAAACATATTGGTGGAGCAACAGATCCAGCAGTATGATTCTGCACTTTATCC AAATGGTGTTTACACACCTGCACCAGATCTCCTTAATCTTATGCAGTGCACAATGGCTCCAGCATTCCCGGCAACGA CATCCGTATTCGGTGACACAACACTGAATGGTACTAACTATTTGGATCTTAACGGTGAACTTACAGGAGTAGCAGCG GT。

43、TCCAGACAGTGGGAGTGGGTTGATGTTTGCTAGTGATTCAGCTCTCCAGTTAGGGTACCATGGTACTCAATCTCA TCTAATAAAGGATATCTGCCACTCGTTGCCCCAAAATTATGGGCTGTTTCCCAGTGAGGACGAACGAGATGTGATTA TTGGTGTTGGAAGTGGAGATCTTTTTCAGGAGATAGATGACAGGCAGTTTGATAGTGTACTTGAATGCAGGAGAGGG AAGGGTGAGTTCGGAAAGGGCAAGGGAAAAGCTAATTTTGCAACTGAGAGAGAGAGGCGGGAGCAGCT。

44、AAATGTGAA GTTCAGGACCCTAAGAATGCTCTTCCCAAATCCTACCAAGAATGACAGGGCCTCAATAGTAGGTGATGCCATTGAGT ATATAGATGAGCTCAATCGAACAGTGAAGGAGCTGAAGATCCTGGTGGAACAGAAGAGGCATGGAAATAACAGGAGA AAGGTGTTAAAGTTGGATCAAGAGGCAGCCGCTGATGGCGAGAGCTCATCGATGAGGCCAGTGAGGGATGATCAAGA CAATCAGCTCCATGGAGCCATAAGGAGCTCATGGGTTCAGAGGAGGTCAAAGGAAT。

45、GCCACGTTGATGTCCGCATAC TGGACGATGAAGTAAACATCAAGCTCACTGAAAAGAAGAAGGCCAACTCTCTGCTTCATGCAGCAAAGGTTCTAGAT GAGTTCCAGCTCGAGCTTATCCATGTAGTGGGTGGGATTATAGGTGATCACCATATATTCATGTTCAACACTAAGGT ATCAGAAGGTTCGGCGGTTTATGCATGTGCAGTGGCAAAGAAGCTCCTTCAAGCAGTGGACGTGCAACACCAGGCCC TCGACATATTCAACTAA 0151 SEQ ID NO.6 0152 MIVG。

46、AGYFEDSHDQSLMAGSLIHDSNQAPASSENTSIDLQKFKVHPYSTEALSNTANLAEAARAINHLQ HQLEIDLEQEVPPVETANWDPAICTIPDHIINHQFSEDPQNILVEQQIQQYDSALYPNGVYTPAPDLLNLMQCTMAP AFPATTSVFGDTTLNGTNYLDLNGELTGVAAVPDSGSGLMEASDSALQLGYHGTQSHLIKDICHSLPQNYGLFPSED ERDVIIGVGSGDLFQEIDDRQFDSVLECRRGKGEFGKGKGKANFATERERREQLNVKFRTLRMLFPNPTKNDRASIV GDAIEYIDELNRTVKELKILVEQKRHGNNRRKVLKLDOEAAADGESSSMRPVRDDQDNQLHGAIRSSWVQRRSKECH VDVRILDDEVNIKLTEKKKANSLLHAAKVLDEFQLELIHVVGGIIGDHHIFMFNTKVSEGSAVYACAVAKKLLQAVD VQHQALDIFN 说明书 8/8 页 11 CN 108220330 A 11 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 12 CN 108220330 A 12 图4 说明书附图 2/2 页 13 CN 108220330 A 13 。