用于抑制肿瘤进展的组合物和方法.pdf

本发明提供了用于以丧失REST功能、β2表达、和/或刻缺蛋白活化为特征的肿瘤的分类、诊断、治疗、和预防的组合物和方法。本发明还提供了用于调控细胞过程诸如EMT、细胞迁移、和凋亡的其它组合物和方法。

1.一种单克隆抗体，其结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白，其中所述单克隆抗体：(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的；或(b)是(a)的抗体的人源化形式。 2.β2的拮抗剂在制备用于抑制表达β2的肿瘤进展的药物中的用途，其中所述抑制包括使肿瘤暴露于β2的拮抗剂，其中所述β2拮抗剂是权利要求1的抗体。 3.权利要求2的用途，其中所述肿瘤是转移性的。 4.权利要求2的用途，其中所述肿瘤对化疗有抗性。 5.权利要求2的用途，其中所述肿瘤是结肠肿瘤。 6.权利要求2的用途，其中所述肿瘤具有降低的REST活性或升高的β2活性。 7.β2的拮抗剂在制备用于抑制表达β2的细胞中的EMT的药物中的用途，其中所述抑制包括使细胞暴露于β2的拮抗剂，其中所述β2拮抗剂是权利要求1的抗体。 8.权利要求7的用途，其中所述细胞是肿瘤细胞。 9.权利要求8的用途，其中所述肿瘤细胞是自转移性肿瘤衍生的。 10.权利要求8的用途，其中所述肿瘤细胞是自对化疗有抗性的肿瘤衍生的。 11.权利要求8的用途，其中所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞。 12.权利要求7的用途，其中所述细胞在体外。 13.权利要求7的用途，其中所述细胞在体内。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2007年11月19日提交的美国临时申请No.60/988,874的权益， 通过述及将其公开内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及牵涉肿瘤进展和其它细胞过程的基因和多肽。

发明背景

EMT

在肿瘤发生期间，癌细胞经由称作“上皮-间充质转换”或EMT的过程 丧失许多它们的正常上皮特征并获得间充质特性。EMT与促进局部侵入和转 移至远程部位的细胞粘着和运动中的变化有关。已经记载了一些能够在模型 系统中诱导EMT的基因，诸如MMP11和TGFB1。综述参见例如Huber et al.， Curr.Opin.Cell Biol.17：548-558，2005；Lee et al.，J.Cell Biol.172：973-981， 2006；Theiry et al.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7：131-142，2006。然而，本领域需 要鉴定更多牵涉在肿瘤细胞中诱导EMT的基因。此类基因及其编码的蛋白质 是有用的靶物，例如在癌症的治疗中。本文所述发明满足这种需要并提供其 它好处。

β2

由SCN2B基因编码的β2是单次跨膜蛋白质，其胞外结构域含有与那些在 细胞粘着蛋白质中所找到的相似的免疫球蛋白折叠(Eubanks et al.， Neuroreport 8：2775-2779，1997；Isom et al.，Cell 83：433-442，1995)。最初表征 为钠通道特性和膜表面积的调控物(Eubanks et al.，见上文)，β2与β1亚基一起 还能够独立于钠通道而作为细胞粘着分子起作用。在果蝇S2细胞中，β1和β2 亚基能以反式-嗜同性方式经它们的EGF重复基序与基质蛋白质生腱蛋白C 和生腱蛋白R结合，导致对细胞骨架的改变，以及细胞粘着和聚集特性的变 化(Malhotra et al.，J.Biol.Chem.275：11383-11388，2000；Xiao et al.，J.Biol. Chem.274：26511-26517，1999)。另外，β2已经被表征为在中国仓鼠卵巢细胞 中诱导迁移的γ-分泌酶靶物(Kim et al.，J.Biol.Chem.280：23251-23261， 2005)。这些结果提示β2经历由α-分泌酶样蛋白酶介导的胞外域脱落(Kim et al.，见上文)。

刻缺蛋白

刻缺蛋白(Notch)受体家族是一类进化上保守的跨膜受体，它们在多种生 物体中(像海胆和人类)传送影响发育的信号。刻缺蛋白受体及其配体家族 德耳塔(Delta)和锯齿蛋白(Serrate)(后者在哺乳动物中也称作Jagged)都是具 有大胞外结构域(其含有表皮生长因子(EGF)样重复)的跨膜蛋白质。各物 种间刻缺蛋白旁系同源物的数目有所不同。例如，哺乳动物中有四种刻缺蛋 白受体(刻缺蛋白1-刻缺蛋白4)，秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中有两 种(LIN-12和GLP-1)，而黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中有一种(刻缺 蛋白)。刻缺蛋白受体在转运至细胞表面期间被弗林蛋白酶样蛋白酶在跨膜 结构域以外的位点S1处蛋白水解加工，产生胞外刻缺蛋白(ECN)亚基和刻缺 蛋白跨膜亚基(NTM)。这两个亚基仍然非共价结合并构成成熟异二聚体细胞 表面受体。刻缺蛋白1ECN亚基含有36个N端EGF样重复，接着是三个串联 重复的Lin 12/刻缺蛋白重复(LNR)模块，之后是S1位点。每个LNR模块含有 三个二硫键和一组保守的酸性和极性残基，预测这些残基与钙离子配位。在 EGF重复区内有供活化性配体结合的位点。包含刻缺蛋白受体的一个独特结 构域的LNR模块参与配体诱导的活化之前处于静息构象的刻缺蛋白的维持。 刻缺蛋白1NTM包含胞外区(其包含S2切割位点)、跨膜区段(其包含S3切 割位点)、和大的胞内部分(其包含RAM域、锚蛋白重复、反式激活域和羧 基末端PEST序列)。ECN与NTM亚基的稳定结合依赖于包含ECN的羧基末端 (称作HD-C)和NTM的胞外氨基末端(称作HD-N)的异二聚化结构域(HD)。 刻缺蛋白配体对ECN亚基的结合启动经由受调节的膜内蛋白水解发生的两 步连续蛋白水解切割。金属蛋白酶在位点S2处的第一步切割使得刻缺蛋白跨 膜亚基对接近质膜内小叶的位点S3处的第二步切割易感。由含有早老蛋白和 呆蛋白的多蛋白质复合物催化的位点S3切割释放刻缺蛋白跨膜亚基的胞内 部分，容许它易位至细胞核并激活靶基因的转录。

已经在人类中鉴定出锯齿蛋白类和德耳塔样类的五种刻缺蛋白配体，即 锯齿蛋白1(Jagged1或Serrate1)、锯齿蛋白2(Jagged2或Serrate2)、德耳塔样1 (Delta-like1或DLL1)、德耳塔样3(Delta-like3或DLL3)、和德耳塔样4 (Delta-like4或DLL4)。每种配体是单次跨膜蛋白质，具有对结合刻缺蛋白而 言至关重要的保守的N端德耳塔、锯齿蛋白、LAG-2(DSL)基序。位于DSL 基序C端的一系列EGF样模块位于跨膜区段之前。与刻缺蛋白受体不同，这 些配体在C端具有70-215个氨基酸的短的胞质尾。另外，已经报告了其它类 型的配体(例如DNER、NB3、和F3/接触蛋白)。

刻缺蛋白途径在多种发育和生理过程期间发挥功能，包括那些在蝇和脊 椎动物中影响神经发生的发育和生理过程。一般而言，刻缺蛋白信号传导涉 及各群细胞间的侧抑制、谱系决定和、边界确立(参见例如Bray，Molecular Cell Biology 7：678-679，2006)。多种人类疾病(包括癌症和神经变性性病症)已 经显示出源自编码刻缺蛋白受体或其配体的基因中的突变(参见例如Nam et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.6：501-509，2002)。当在一个人类急性成淋巴细胞 性白血病(T-ALL)子集中鉴定到创建人刻缺蛋白1的一种截短的、组成性有活 性的变体的频发(recurrent)t(7；9)(q34；q34.3)染色体易位时候，首次认识到不 受限制的刻缺蛋白信号传导与恶性肿瘤之间的联系。在小鼠模型中，刻缺蛋 白1信号传导已经显示出对于T细胞发育而言是至关重要的，而且刻缺蛋白1 介导的信号以B细胞发育为代价而促进T细胞发育。而且，在小鼠模型中，发 育期间过量的刻缺蛋白信号传导导致T细胞瘤形成。

此外，刻缺蛋白受体在极其多种人类癌症和肿瘤衍生细胞系中表达，而 且在人胚胎干细胞中促进神经命运。例如，刻缺蛋白在人宫颈癌细胞和人肾 细胞癌细胞中的新生物病变处高度表达。鉴于刻缺蛋白信号传导涉及极其多 种人类疾病，清楚的是仍然需要能调节刻缺蛋白信号传导、具有最适于开发 成治疗剂的临床属性的药剂。本文所述发明满足这种需求并提供其它好处。

REST

REST(也称作NRSF)是非神经元组织中神经元基因表达的转录阻抑物 (Westbrook et al.，Cell：121：837-848，2005)。REST已经被表征为肿瘤阻抑物。 REST基因被鉴定为结肠直肠癌中频繁的删除靶物。另外，已经鉴定出能够 转化上皮细胞的一种显性阴性形式的REST。本领域需要鉴定牵涉REST肿瘤 阻抑的基因。此类基因及其编码的蛋白质是有用的靶物，例如在癌症的治疗 中。本文所述发明满足这种需要并提供其它好处。

发明概述

本发明部分基于如下的发现，在肿瘤中，丧失转录阻抑物REST导致β2 表达，其继而活化刻缺蛋白信号传导。本发明进一步部分基于β2作为刻缺蛋 白的新配体的鉴定，由此β2通过结合刻缺蛋白和活化刻缺蛋白信号传导而诱 导EMT。这些发现指示REST/β2/刻缺蛋白途径促进肿瘤进展和/或转移。

一方面，提供了用于以丧失REST功能、β2表达、和/或刻缺蛋白活化为 特征的肿瘤的分类、诊断、治疗、和预防的组合物和方法。

另一方面，提供了一种单克隆抗体，其结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白。 在一个实施方案中，所述单克隆抗体：(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、 PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的；(b)是(a)的抗体的人源化形式；(c)与 (a)的抗体结合相同表位；或(d)与(a)的抗体竞争对β2的结合。

另一方面，提供了一种分离的可溶性多肽，其包含特异性结合β2的刻缺 蛋白片段。

另一方面，提供了一种抑制肿瘤进展的方法，该方法包括使肿瘤暴露于 β2的拮抗剂。在一个实施方案中，其中所述β2拮抗剂是对SCN2B特异性的反 义核酸。在一个此类实施方案中，所述反义核酸是能够RNAi的调节性RNA。 在另一个实施方案中，所述β2拮抗剂是结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白的抗 体。在一个此类实施方案中，所述抗体：(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、 PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的；(b)是(a)的抗体的人源化形式；(c)与 (a)的抗体结合相同表位；或(d)与(a)的抗体竞争对β2的结合。在另一个实施 方案中，所述β2拮抗剂是结合刻缺蛋白并阻断刻缺蛋白结合β2的抗体。在一 个此类实施方案中，所述抗体在刻缺蛋白1中包含EGF重复10-21的区域内结 合。在另一个实施方案中，所述β2拮抗剂包括包含特异性结合β2的刻缺蛋白 片段的可溶性多肽。在另一个实施方案中，所述肿瘤是转移性的。在另一个 实施方案中，所述肿瘤是对化疗有抗性的肿瘤。在另一个实施方案中，所述 肿瘤是结肠肿瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤具有降低的REST活性或 升高的β2活性。

另一方面，提供了一种抑制细胞中的EMT的方法，该方法包括使细胞暴 露于β2的拮抗剂。在一个实施方案中，所述β2拮抗剂是对SCN2B特异性的反 义核酸。在一个此类实施方案中，所述反义核酸是能够RNAi的调节性RNA。 在另一个实施方案中，所述β2拮抗剂是结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白的抗 体。在一个此类实施方案中，所述抗体：(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、 PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的；(b)是(a)的抗体的人源化形式；(c)与 (a)的抗体结合相同表位；或(d)与(a)的抗体竞争对β2的结合。在另一个实施 方案中，所述β2拮抗剂是结合刻缺蛋白并阻断刻缺蛋白结合β2的抗体。在一 个此类实施方案中，所述抗体在刻缺蛋白1中包含EGF重复10-21的区域内结 合。在另一个实施方案中，所述β2拮抗剂包括包含特异性结合β2的刻缺蛋白 片段的可溶性多肽。在另一个实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在另一个 实施方案中，所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中，所述肿 瘤细胞是自对化疗有抗性的肿瘤衍生的。在另一个实施方案中，所述肿瘤细 胞是结肠肿瘤细胞。在另一个实施方案中，所述细胞在体外。在另一个实施 方案中，所述细胞在体内。

另一方面，提供了一种确定肿瘤是否会响应β2的拮抗剂或刻缺蛋白的拮 抗剂的方法，该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性，其 中肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤会响应β2的拮抗剂或 刻缺蛋白的拮抗剂。在一个实施方案中，所述方法包括检测降低的REST活 性。在另一个实施方案中，所述方法包括检测升高的β2活性。在另一个实施 方案中，所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中，所述肿瘤对化疗有抗 性。在另一个实施方案中，所述肿瘤是结肠肿瘤。

下文描述中提供了上述实施方案和其它实施方案。

附图简述

图1A

正常结肠上皮(第1-5道)和结肠肿瘤上皮(第6-13道)中的SCN2B表达。 在激光捕捉显微解剖后分离RNA，并通过微阵列分析来测量SCN2B表达。数 值代表相对表达水平，即SCN2B转录物对通用参照RNA(自肿瘤细胞系集合 衍生)的比。第7道中样品的数值33被截断，以条标示。

图1B

结肠肿瘤和正常结肠中β2蛋白质表达的例子，使用抗β2单克隆抗体 (3D1)。

图2A

用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理 或用全长β2转染(FL:β2)的细胞系(名称在左边)的肌动蛋白细胞骨架的 显现。使用相同设置收集实验组的图像。用鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架染 色，而用DAPI对细胞核染色。左下角显示了15μm比例尺。

图2B

用针对豚草(RW，左部小图)或β2(右部小图)的抗体处理的、用β2 转染的CHO(上部2幅小图)或用β2转染的SW620(下部2幅小图)细胞中由 β2诱导的表型变化的抗体阻断。用鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架染色，而用 DAPI对细胞核染色。使用相同设置收集实验组的所有图像。比例尺：15μm。

图2C

β2ECD消减测定法：用对照(C-CM)或经受过模拟β2消减或部分或完 全β2消减的β2条件培养基(β2-CM)处理NCI-H226细胞。通过抗β2免疫印迹 上的道来显示相应的蛋白质回收。第1道含有自条件培养基分离的β2，作为 阳性对照。用鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架染色，而用DAPI对细胞核染色。 使用相同设置收集所有图像。比例尺：15μm。

图3A

用载体转染的SW620对照细胞(Vec)或用β2转染的SW620(FL:β2)细 胞、或用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处 理的SW620细胞在0.1％胎牛血清(FBS)中的迁移。在血清缺失(0％FBS)的情 况中没有观察到迁移。荧光强度是使用YO-PRO-1染色的迁移细胞的荧光强 度。误差条代表均值的平均偏差，来源于一式三份的实验。对用β2转染的或 用β2-ECD处理的SW620细胞都观察到统计学显着升高的迁移(p分别为0.03 和0.0009)。

图3B

用抗豚草抗体(RW)或2种不同抗β2抗体(3D1或12A9)处理的SW480 细胞的迁移。荧光强度是用YO-PRO-1染色的迁移细胞的。误差条代表均值 的平均偏差，自一式三份推导。在存在两种抗β2抗体的情况中都观察到迁移 的统计学显著降低(每一个的p为0.001)。

图3C

饥饿测定法：用载体转染的SW620对照细胞(Vec)或用β2转染的SW620 细胞(FL:β2)的细胞死亡，作为饥饿后相对于细胞总数的百分比。实验是 一式三份实施的，误差条代表均值的平均偏差。对用β2转染的SW620细胞观 察到细胞死亡的统计学显著降低(p为0.002)。

图3D

SW620细胞中的多柔比星抗性：在存在多柔比星(μg/ml，X轴)的情况 中用仅仅是载体(Vec)或全长β2(FL:β2)转染的细胞的细胞存活力(Y轴)。 实验点是一式三份实施的，误差条代表均值的平均偏差。

图3E

CHO细胞中的甲氨喋呤抗性：用对照条件培养基(C-CM)或条件培养 基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的细胞死亡，作为相对于总数的百分比。 实验是一式三份实施的，误差条代表均值的平均偏差。对用β2ECD处理的 CHO细胞观察到细胞死亡的统计学显著降低(p为0.01)。

图4A

SW620用对照处理的细胞(C-CM)或用β2蛋白质转染(FL:β2)或用条 件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的E-钙粘着蛋白染色。用DAPI 对细胞核染色。使用相同设置收集所有图像。比例尺：15μm。

图4B

SW620(i)用载体(Vec)或全长β2(FL:β2)转染的细胞或(ii)用对照条 件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的E-钙 粘着蛋白染色的FACS分析。将中值比值绘图。误差条代表一式两份的标准 偏差。

图4C

SW620用对照处理的细胞(C-CM)或用β2蛋白质转染(FL:β2)或用条 件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的波形蛋白(vimentin)染色。用 DAPI对细胞核染色。使用相同设置收集所有图像。比例尺：15μm。

图4D

Twist1消减：使用非靶向对照序列(siNT)或靶向Twist1的siRNA (siTwist1)进行siRNA敲低后用条件培养基中的β2ECD处理的SW620细胞 (β2-CM)的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽，上部小图)和E-钙粘着蛋白(下 部小图)染色。在用对照条件培养基(C-CM)处理的siNT或siTwist1细胞中 没有观察到表型或E-钙粘着蛋白染色的变化。使用相同设置收集实验组的图 像。用DAPI对细胞核染色。比例尺：15μm。

图4E

E-钙粘着蛋白水平：用对照条件培养基(C-CM)或β2条件培养基 (β2-CM)处理的SW620细胞的Twist1消减实验中E-钙粘着蛋白染色的定量 分析。统计分析指示用β2-ECD处理的、消减了Twist1的细胞(siTwist1和 siTwist1(3))的E-钙粘着蛋白水平与用β2-ECD处理的、用非靶向对照转染的 细胞(siNT)相比有显著不同(p为0.001和0.009)。最后一组柱(siTwist1(3)) 代表靶向Twist1的3种别的独立siRNA序列的数据的组合分析。使用细胞的至 少5个独立视野来进行定量分析，其如所描述的那样使用Metamorph。误差条 代表标准误差。

图5A

SW620和SW480细胞(顶部2幅小图)和结肠肿瘤和正常结肠(底部2幅 小图)中的β2(左栏)和REST(右栏)染色。使用相同设置收集实验组的 所有图像。比例尺：15μm。

图5B

与非靶向对照(siNT)相比，siRNA敲低REST(siREST)后SW620中 的REST(上部小图)和β2(下部小图)的免疫印迹分析。分子量(KDa)标示 着左边。对印迹探查β-微管蛋白(中部小图)，作为加载对照。

图5C

使用siRNA敲低REST后REST蛋白质(REST)的相对降低和β2(β2)的 相对升高，相对于非靶向siRNA对照(siNT，设成100％)标准化。自5B中免 疫印迹的Licor强度读出测定数值，减去背景，并相对于β-微管蛋白标准化。

图5D

REST消减：使用siRNA(siREST)或非靶向对照(siNT)敲低REST后 和在存在抗豚草(siREST，α-RW)或抗β2(siREST，α-β2)抗体的情况SW620 细胞的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽，上部小图)、E-钙粘着蛋白(中部小 图)和波形蛋白(下部小图)染色。使用相同设置收集所有实验组的图像。 用DAPI对细胞核染色。比例尺：15μm。

图5E

E-钙粘着蛋白水平：图5D中SW620细胞实验分组的siREST消减中的E- 钙粘着蛋白染色定量分析。用对REST特异性siRNA(siREST)转染的细胞 的E-钙粘着蛋白水平与在用非靶向对照(siNT)转染对细胞中检测到的水平 相比有显著降低(p为0.001)。在存在抗β2抗体3D1(siREST:3D1)和2E3 (siREST:2E3)的情况中消减REST导致野生型水平的E-钙粘着蛋白染色， 其与消减了REST的细胞(siREST)或用抗豚草抗体处理、消减了REST的细 胞(siREST:α-RW)相比有显著升高(p为0.02和0.01)。使用细胞的至少5个 独立视野进行定量分析，其如所描述的那样使用Metamorph。误差条代表标 准误差。

图6A

刻缺蛋白1消减：使用非靶向对照序列(siNT)或靶向刻缺蛋白1的siRNA (siNotch1)进行siRNA敲低后用条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的 SW620细胞的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽，上部小图)和E-钙粘着蛋白(下 部小图)染色。在用对照条件培养基(C-CM)处理的siNT或siNotch1细胞中 没有检测到表型或E-钙粘着蛋白染色变化。使用相同设置收集实验组的图 像。用DAPI对细胞核染色。比例尺：15μm。

图6B

对刻缺蛋白信号传导的化学抑制：添加DMSO或DMSO中的DAPT (DAPT)后用条件培养基中(β2-CM)的β2ECD处理的SW620的E-钙粘着 蛋白染色。在用DMSO中的对照条件培养基(C-CM)处理的细胞中没有检 测到E-钙粘着蛋白染色变化。使用相同设置收集实验组的图像。用DAPI对细 胞核染色。比例尺：15μm。

图6C

E-钙粘着蛋白水平：用对照条件培养基(C-CM)或β2条件培养基 (β2-CM)处理的、用siNotch1消减和用DAPT处理的SW620细胞中的E-钙粘 着蛋白染色的定量分析。统计分析指示用β2-ECD处理的、消减了刻缺蛋白1 (siNotch1和siNotch1(3))的细胞的E-钙粘着蛋白水平与用β2-ECD处理的、 用非靶向对照(siNT)转染的细胞相比有显著不同(p为0.03和0.03)。标示 siNotch1(3)的柱代表靶向刻缺蛋白1的3种别的独立siRNA序列的数据的组合 分析。用β2-ECD处理的(β2-CM)、用DAPT处理的(DAPT)细胞的E-钙粘 着蛋白水平与DMSO(DMSO)中用β2-ECD处理的细胞相比也有显著不同(p 为0.00001)。使用细胞的至少5个独立视野来进行定量分析，其如所描述的那 样使用Metamorph。误差条代表标准误差。

图7A

用仅仅是载体(Vec：第1-3道)或用β2(FL:β2：第4-6道)转染的SW620 细胞中使用抗β2抗体(β2：第2、3、5、6道)或抗豚草抗体(RW：第1、4 道)对SW620细胞中内源刻缺蛋白1的免疫共沉淀。用刻缺蛋白1多克隆抗体 (G20)探查免疫印迹，并在该抗体的预期大小(约120kDa，标示在左边) 处检测到条带。内源刻缺蛋白1的水平和双重带样式显示于第7道，其含有 SW620细胞溶胞物(25μg总蛋白质)。

图7B

刻缺蛋白1和β2ECD的结合。第1和3道含有来自CHO细胞的β2条件培养 基(含有带His(8)标签的β2ECD)，而第2和4道含有来自CHO细胞的对照条 件培养基(含有无关的带His(8)标签的蛋白质(Gli-1))。如所描述的那样将带 Flag标签的刻缺蛋白1ECD蛋白质添加至第1-4道。第5道含有100ng纯化的刻 缺蛋白1ECD，第6道含有50ng(自大肠杆菌表达和纯化的)β2ECD。使用 抗Flag抗体对印迹探查刻缺蛋白1(经标记的刻缺蛋白1，免疫印迹的上部切 片)，然后剥下，并使用抗β2单克隆抗体(3D1)再探查β2(经标记的β2，免 疫印迹的下部切片)。分子量(KDa)标示在左边。

图7C

含有EGF重复区10-21的刻缺蛋白1ECD片段和β2ECD的结合。第1和3 道含有来自CHO细胞的β2条件培养基(含有带His(8)标签的β2ECD)，而第2 和4道含有来自CHO细胞的对照条件培养基(含有无关的带His(8)标签的蛋白 质)。将带Flag标签的刻缺蛋白1ECD EGF重复区添加至第1和2道(EGF 10-21)及第3和4道(EGF 22-33)。第5和6道含有75ng纯化的刻缺蛋白1ECD， 分别为EGF10-21或EGF22-33。使用抗Flag抗体对印迹探查刻缺蛋白ECD。分 子量(KDa)标示在左边。

图7D

刻缺蛋白1NICD响应β2而易位至细胞核。用仅仅是载体(Vec)或全长β2 蛋白质(FL:β2)转染的SW620细胞中的刻缺蛋白1NICD染色显示在左部2 幅小图，而用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM) 处理的SW620细胞的NICD染色显示在右部2幅小图。用DAPI对细胞核染色。 比例尺：15μm。下部一系列小图含有自上部小图影像放大的区域。

图8

源自REST丧失、β2表达、和刻缺蛋白途径信号传导激活的EMT诱导的 建议途径的概览。CDH1＝E-钙粘着蛋白。

图9

肿瘤细胞系中REST和β2的反相关：肿瘤细胞系关于REST和β2表达的免 疫荧光分析的汇总。染色的半定量评估标示为+。

图10A

来自新鲜的、冷冻的结肠肿瘤切片的LCM策略，例子有分化良好的原发 性结肠肿瘤(HF3766，上部小图)和分化不良的侵入性原发性结肠肿瘤 (HF3546，下部小图)。在左部小图中描画捕捉到的细胞。

图10B

来自用于LCM和微阵列分析的样品的切片中的β2转录物表达的RT-PCR 分析，相对于β-肌动蛋白表达标准化。

图10C

与用于LCM的切片(新鲜的、冷冻的切片)匹配的结肠肿瘤切片上β2 转录物的非同位素原位杂交(ISH)。在匹配的切片上运行有义对照，并在下部 小图中显示每一幅图像的有义对照。

图10D

在用仅仅是载体(VEC：第2道)或用全长β2(β2：第3道)转染的SW620 中使用抗β2单克隆抗体(3D1)检测免疫印迹上的β2蛋白质。在第2和3道中 加载25μg总细胞蛋白质。在第1道中加载4ng纯化的β2ECD(经标记的ECD)。 分子量(KDa)标示在右边。

图10E

使用抗β2单克隆抗体(3D1)通过免疫印迹分析检测人肿瘤的β2(上部 小图)。所有样品都是肿瘤样品，而且组织起源列于上方。还对印迹探查β- 微管蛋白，作为加载对照(下部小图)。分子量(KDa)标示在左边。

图11A

用条件培养基中的β2ECD(β2-CM，右部小图)或用对照条件培养基 (C-CM，左部小图)处理的多种细胞系的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽) 染色。细胞系(名称列于左边)：SW480，PC3，HUVEC，MDCK，HEK293。 用DAPI对细胞核染色。

图11B

β2响应性肿瘤细胞系SW620、SW480、NCI-H226、PC-3、和内皮细胞 系HUVEC中的刻缺蛋白1转录物表达。根据Affymetrix微阵列数据将MAS5 强度值绘制在Y轴上。

图11C

β2响应性肿瘤细胞系SW620、SW480、NCI-H226、PC-3、和内皮细胞 系HUVEC中的刻缺蛋白2转录物表达。根据Affymetrix微阵列数据将MAS5 强度值绘制在Y轴上。

图11D

SW620中的其它刻缺蛋白配体和受体的表达：锯齿蛋白1，锯齿蛋白2， 刻缺蛋白3，刻缺蛋白4。根据Affymetrix微阵列数据将MAS5强度值绘制在Y 轴上。

图12A

用条件培养基中的β2ECD处理的SW620细胞中0-72小时的HES1和 Twist1转录物表达。于0、6、18、24、48、和72小时时间点自细胞提取RNA， 并在Agilent完整人类基因组微阵列上与通用参照RNA相比实施微阵列分析。 将对数比(log ratio)(Y轴)对时间(以小时计)(X轴)绘图。显示了2种独 立HES1寡核苷酸探针序列和Twist1的转录物数据。

图12B

用β2ECD处理的SW620细胞中0、6、和18小时时间点时Twist1转录物表 达的RT-PCR分析。将Twist1表达相对于持家基因RPL19标准化。

图13A

REST消减：用对REST特异性的siRNA(siREST)或非靶向对照(siNT) 转染的SW620细胞中的REST(i)和β2(ii)转录物表达的RT-PCR分析。将转录 物水平相对于持家基因RPL19标准化。

图13B

REST消减：用对REST特异性的siRNA(siREST：右部小图)或非靶向 对照(siNT：左部小图)转染的SW620细胞中的REST(上部小图)和β2(下 部小图)的免疫荧光分析。用DAPI对细胞核染色。使用相同设置对所有实 验组成像。比例尺：15μm

图13C

刻缺蛋白1消减：用对刻缺蛋白1特异性的siRNA(siNotch1)或非靶向 对照(siNT)转染的SW620细胞中的刻缺蛋白1转录物表达的RT-PCR分析。 将转录物水平相对于持家基因RPL19标准化。

图14

抗体阻断实验。用5种不同抗β2抗体进行竞争性结合测定法。

发明详述

本发明部分基于β2作为刻缺蛋白的新配体的鉴定，其联系REST丧失与 刻缺蛋白信号传导活化，由此限定β2、REST和刻缺蛋白在肿瘤进展和转移 中的作用。

I.定义

术语“β2”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例 如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然钠通道β2亚基，除非另有 说明。该术语涵盖“全长”、未加工的β2以及源自细胞中的加工的任何形式 的β2。该术语还涵盖β2的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。

如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白”或“刻缺蛋白受体”指任何属于 单次异二聚体跨膜受体之刻缺蛋白家族的蛋白质。该术语涵盖来自任何脊椎 动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)) 的天然刻缺蛋白，除非另有说明。该术语涵盖哺乳动物刻缺蛋白受体(刻缺 蛋白1、刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、和刻缺蛋白4)。该术语涵盖“全长”、未加 工的刻缺蛋白以及源自细胞中的加工的任何形式的刻缺蛋白。该术语还涵盖 刻缺蛋白的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。

如本文中所使用的，术语“锯齿蛋白”(Jagged)指任何属于刻缺蛋白配 体之锯齿蛋白(Jagged或Serrate)家族的蛋白质。该术语涵盖来自任何脊椎动物 来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)) 的天然锯齿蛋白，除非另有说明。该术语涵盖称作锯齿蛋白1(Jagged1或 Serrate1)和锯齿蛋白2(Jagged2或Serrate2)的哺乳动物锯齿蛋白家族成员。该 术语涵盖“全长”、未加工的锯齿蛋白以及源自细胞中的加工的任何形式的 锯齿蛋白。该术语还涵盖锯齿蛋白的天然存在变体，例如剪接变体或等位变 体。

如本文中所使用的，术语“DLL”指任何属于刻缺蛋白配体之德耳塔样 家族(Delta-like family)的蛋白质。该术语涵盖来自任何脊椎动物来源(包括 哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的天然DLL， 除非另有说明。该术语涵盖称作德耳塔样1(DLL1)、德耳塔样3(DLL3)、和 德耳塔样4(DLL4)的哺乳动物DLL家族成员。该术语涵盖“全长”、未加工 的DLL以及源自细胞中的加工的任何形式的DLL。该术语还涵盖DLL的天然 存在变体，例如剪接变体或等位变体。

如本文中所使用的，术语“REST”指来自任何脊椎动物来源(包括哺 乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然 阻抑物元件1沉默转录(repressor element silencing transcription，REST)因子， 除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工的REST以及源自细胞中的加工 的任何形式的REST。该术语还涵盖REST的天然存在变体，例如剪接变体或 等位变体。

术语“PRO”一般指本文中所描述的任何蛋白质，包括但不限于β2、刻 缺蛋白、锯齿蛋白、DLL、和REST中任一项。

“β2的拮抗剂”指抑制β2或编码β2的核酸(例如SCN2B核酸)生成；抑 制β2加工(例如自β2释放ECD)；或直接与β2或与刻缺蛋白相互作用以抑制β2 结合刻缺蛋白的药剂。

“病症”指将会从使用本发明的组合物或方法进行的处理(治疗)中获 益的任何疾患或疾病。这包括慢性和急性病症，包括那些使哺乳动物趋向于 所讨论病症的病理状况。本文中待治疗病症的非限制性例子包括诸如癌症 (例如结肠癌)(包括顽固性或转移性癌症)等疾患。

在用于本文时，“治疗”(及变化形式，诸如“处理”或“处置”)指试 图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床 病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症 状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速 率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明 的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展，或用于减缓疾病或病症的进展。

“个体”、“受试者”、或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊 椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动 物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方 案中，哺乳动物指人。

术语“药物配制剂”指其形式容许活性成分的生物学活性是有效的，且 不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。 此类配制剂可以是无菌的。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的 量。

本发明物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、 性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗 有效量还涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。 “预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通 常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者 的，因此预防有效量将低于治疗有效量。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞 死亡或破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、 Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；化疗剂， 例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、 多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸 氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸 如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物 起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌 药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂 类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide) 磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英 丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐 替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派 (uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包 括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布 拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌 (lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan) CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰 喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)； callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和 比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸 (podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是 隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物， KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin； 海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫 司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮 芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲 磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸 如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、 洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素 类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是 加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.，Angew.Chem Intl. Ed.Engl.，33：183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽 环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及 新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿 克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、 偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、 carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素 (chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比 星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括 吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比 星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99 PEG化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、表 柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素 (marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉 素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素 (quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星 (streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨 (gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨 (capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶 酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、 三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌 呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类 似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如 卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸 如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶 酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷 (aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶 (eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙 (edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌 (diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格 鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明 (lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和 安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)； 莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨 氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼 (ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰 (sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚 胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其 是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素 (anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)()；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘 露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)； gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇 (taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的纳米颗粒剂 型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)苯 丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)； 甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin) (例如)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白 聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine) 长春地辛(vindesine)和长春瑞 滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺 (ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤 (novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟 甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝 沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯 膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate) NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增 殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras 和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫 苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑 异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)； BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(sunitinib，Pfizer)；哌立 福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔 (etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomibCCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodiumpixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨 酸激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素 (rapamycin)(sirolimus，)；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib (SCH 6636，SARASARTM)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物； 以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长 春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM) 联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

如本文中所定义的，化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生 长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是 激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他 莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) 艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬 (raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择 性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌 激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可阻 断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平)； 芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依 西美坦(exemestane)和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿 那曲唑(anastrozole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米 特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole) 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)法倔唑 (fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林 (leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林 (buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类 (progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林 (premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有 反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)； 抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特 (flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质 的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物 或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。 生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂， 诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas) (长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异 构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素 (daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的 药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼 尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。 更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《The Molecular Basis of Cancer》，第1 章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini 等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类(帕利他 塞(paclitaxel)和多西他塞(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲 紫杉的多西他塞Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他塞促进由微管蛋白二 聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑 制。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/ 增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰 金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此 类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺 癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、 卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、 结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、 甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增生性病症、及各种 类型的头和颈癌。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增 殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“抑制细胞生长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低了至少10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％，而且包 括诱导细胞死亡。

“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论 是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌 症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到 时并不互相排斥。

术语“结肠直肠肿瘤”或“结肠直肠癌”指大肠(包括结肠(自盲肠至 直肠的大肠)和直肠)的任何肿瘤或癌症。

“结肠直肠癌细胞”指结肠癌细胞或直肠癌细胞，或是在体内或是在体 外，而且涵盖自结肠直肠癌细胞衍生的细胞系。

术语“结肠肿瘤”或“结肠癌”指结肠的任何肿瘤或癌症。

“结肠癌细胞”指结肠癌细胞，或是在体内或是在体外，而且涵盖自结 肠癌细胞衍生的细胞系。

术语“新生物(neoplasm)”或“新生物细胞”指比相应的正常组织或细 胞增殖更快且在启动生长的刺激消除后继续生长的异常组织或细胞。

术语“上皮-间充质转换(epithelial-mesenchymal transition)”或“EMT” 指细胞丧失上皮特征并获得间充质特性的过程，包括但不限于在肿瘤细胞的 情况中促进局部侵入和/或转移的细胞粘着丧失和迁移增强。

术语“肿瘤进展”指肿瘤的所有阶段，包括肿瘤发生、肿瘤生长和增殖、 侵入、和转移。

术语“抑制肿瘤进展”意味着抑制肿瘤的发生、生长、增殖、或扩散， 包括但不限于下列效果：(1)肿瘤生长受到一定程度的抑制，包括减缓或完全 的生长阻滞；(2)肿瘤细胞数目减少；(3)肿瘤尺寸缩小；(4)肿瘤细胞进入附 近外周器官和/或组织的浸润受到抑制(即降低、减缓或完全终止)；(5)转移 受到抑制(即降低、减缓或完全终止)；(6)肿瘤治疗后患者或患者群的存活 时间长度延长；和/或(7)肿瘤治疗后给定时间点时患者或患者群的死亡率降 低。

若肿瘤进展受到抑制，如上文所定义的，则肿瘤“响应”特定药剂。

术语“反义核酸”指降低与其部分或完全互补的靶多核苷酸表达的核酸。 若反义核酸(a)选择性结合靶多核苷酸或其编码的mRNA并(b)将靶多核苷酸 的表达降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，则它对靶多核 苷酸是“特异性”的。

术语“RNAi”或RNA干扰”指通过由RNA介导的机制，例如通过由双 链RNA介导的机制来部分或完全抑制基因表达。术语“敲低”指此类对基因 表达的部分或完全抑制。

术语“调节性RNA”或“调节性RNA分子”指能够调节基因表达的RNA， 例如通过调节相应mRNA的表达。此类调节性RNA包括但不限于能够进行 RNAi的RNA。若在表达靶多核苷酸的细胞中表达调节性RNA时，调节性 RNA(a)选择性结合靶多核苷酸或其编码的mRNA并(b)将靶多核苷酸的表达 降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，则它对靶多核苷酸是 “特异性”的。

术语“siRNA”或“短干扰RNA”指当在与靶多核苷酸相同的细胞中表 达siRNA时，有能力降低靶多核苷酸表达的双链RNA。形成双链RNA的siRNA 的互补链通常具有实质性的或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA指 如下的双链RNA，其中一条链(也称作“反义”链)与靶mRNA的至少一部 分具有实质性的或完全的同一性。在某些实施方案中，siRNA的长度为约 15-50个核苷酸、长度为约20-30个核苷酸、长度为约20-25个核苷酸、或长度 为24-29个核苷酸，包括上述范围内的整数的任何长度。还可参见 PCT/US03/07237，公布号WO03076592，通过述及完整收入本文。若在表达 所述靶多核苷酸的细胞中表达所述siRNA时，siRNA分子(a)选择性结合靶多 核苷酸或其编码的mRNA并(b)将靶多核苷酸的表达降低至少约10％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、或99％，则它对靶多核苷酸是“特异性”的。

术语“siRNA”涵盖能够形成发夹结构的RNA，例如微小RNA前体 (pre-miRNA)和短发夹RNA(shRNA)。参见例如Brummelkamp et al.(2002) Science 550-553。pre-miRNA或shRNA是自我互补的RNA分子，其具有有义 区、反义区、和环区，且能够形成发夹结构。在某些实施方案中，有义和反 义区各自的长度是约15-50个核苷酸、长度是约20-30个核苷酸、长度是约 20-25个核苷酸、或长度是约24-29个核苷酸，包括上述范围内的整数的任何 长度；而且环部分的长度是约2-15个核苷酸或长度是约6-9个核苷酸，包括上 述范围内的整数的任何长度。

术语“胞外结构域”或“ECD”指跨膜蛋白质中本质上排除所有跨膜和 胞质结构域外的区域。

术语“可溶性多肽”指非膜结合的多肽。

“顽固性/不应性”(refractory)肿瘤指相关领域熟练临床医师会推断对治 疗性处理有显著抗性和/或是(或预期是)显著不响应的肿瘤(例如肿瘤体积、 癌性细胞数目、和/或癌症扩散有增加，即使给予治疗性处理)。在此语境中， 此类治疗性处理包括但不限于化疗、放射、干细胞移植、和手术处理，排除 用REST的激动剂、β2的拮抗剂、或刻缺蛋白的拮抗剂进行的处理。短语“对 化疗有抗性”指相关领域熟练临床医师会推断对化疗有显著抗性和/或是(或 预期是)显著不响应的肿瘤，排除用REST的激动剂、β2的拮抗剂、或刻缺 蛋白的拮抗剂进行的化疗。

“复发性”指在治疗性处理后患者的病在消退后基本上回到其从前的患 病状态，尤其是在响应治疗性处理而发生的表观恢复(apparent recovery)或部 分恢复(partial recovery)(例如消退)后症状(例如癌细胞)的回复。在此语 境中，此类治疗性处理包括但不限于化疗、放射、干细胞移植、和手术处理， 排除用REST的激动剂、β2的拮抗剂、或刻缺蛋白的拮抗剂进行的处理。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗 体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗 体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的 抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途 的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有 些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过 95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使用例如转杯式测 序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性 或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。 既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞 内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的 约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连 接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和 轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)， 接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个 恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与 重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间 形成界面。

术语“抗PRO抗体”或“结合PRO的抗体”指能够以足够亲和力结合PRO 使得该抗体作为靶向PRO中的诊断剂和/或治疗剂有用的抗体。优选的是，抗 PRO抗体结合无关、非PRO蛋白质的程度低于该抗体对PRO的结合的约10％， 如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合PRO 的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解 离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗PRO抗体结合在来自不同物种的PRO间 保守的PRO表位。

抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。 重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域 一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每 种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分 布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的 三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链 的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连 接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的 HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体 的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能， 诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性中抗体的参与。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋 白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达 (λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。 免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为 亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类 的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫 球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.， Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是 抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分 子的一部分。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整 形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗 体。

“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射 性标记物的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片 段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单 链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片 段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了 它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结 合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中， 双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚 体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通 过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体” 结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在 VH-VL二聚体表面上限定了抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结 合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR 的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第 一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基 末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH 是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2 抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成 的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些 结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进 一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的 综述参见例如Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》， 第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315 页。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条 多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使 用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域 与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是 二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体 (tetrabody)也记载于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗 体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例 如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同的抗体的混 合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物 的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选 择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多 克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。 应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲 和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体 内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗 体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同 抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗 原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们 通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解 释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆 抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein， Nature，256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)， Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling et al.，于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(参见例如美国专利 No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352：624-628 (1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol. 338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)； Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J. Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫 球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体 的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)； Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126； 5,633,425；和5,661,016；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)； Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813 (1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93 (1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部 分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同 或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗 体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的 生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体 的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫 球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白 (受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物 种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的 免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替 换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进 行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包 含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变 环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白 序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常 是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.，Nature 321：522-525 (1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct. Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy， Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及 美国专利No.6,982,321和7,087,409。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和 /或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种 定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已 知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol. Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。还可用于制备 人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol. 147(1)：86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel，Curr.Opin. Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人 抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠 (xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于 XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 103：3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列 上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR： 三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中， H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精 密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13：37-45(2000)； Johnson and Wu于：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺 乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature 363：446-448(1993)；Sheriffet al.Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。

“框架”或“FR”残基指可变域中除HVR残基外的那些残基。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改 变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的 抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的 对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些规程来生 成。例如，Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL 结构域改组进行的亲和力成熟。例如，以下文献记载了HVR和/或框架残基 的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)； Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004 (1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol. Biol.226：889-896(1992)。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制其所结合的抗原的生物学活性 的抗体。阻断性抗体或拮抗性抗体可实质或完全抑制抗原的生物学活性。

“激动性抗体”在用于本文时指部分或完全模拟目的多肽的至少一项功 能性活性的抗体。

“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增 殖的抗体。例如，抗体可以在体外和/或在体内阻止或降低癌细胞增殖。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序 列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子 包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下 调；和B细胞活化。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然 序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG 重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的 区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如 在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工 程。相应的，完整抗体组合物可包括消除了所有K447残基的抗体群、没有消 除K447残基的抗体群、或者混合了有和没有K447残基的抗体的抗体群。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应 器功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面 受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结 合域(例如抗体可变域)联合，而且可使用多种测定法来评估，例如本文定 义中所公开的。

“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基 酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)、天 然序列人IgG2Fc区、天然序列人IgG3Fc区、及天然序列人IgG4Fc区，及其 天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰，优选一处或多处氨基酸替 代而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天 然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列 Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至 约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽 的Fc区拥有至少约80％的同源性，最优选至少约90％的同源性，更优选至少 约95％的同源性。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中， FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)， 包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和 可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受 体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体 FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑 制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序 (ITIM)(参见例如，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述 参见例如Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med. 126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会 鉴定的。

术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG 转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol. 24：249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已 知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的 (参见例如Ghetie and Ward.，Immunol.Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie et al.，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.，J.Biol.Chem. 279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。

可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期， 例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变 异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提 高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.，J.Biol.Chem. 9(2)：6591-6604(2001)。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在 某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导 ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细 胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来 源分离，例如血液。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细 胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc 受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗 原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主 要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。 Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造 血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC 测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056 (Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。 或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸 如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经 典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起 始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法， 例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载 的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q 结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO 1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU 编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改 造编码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含 具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体 的混合物。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶 体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用 于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1 相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常 数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所 描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和 力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量 结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了用 于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定 法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法 (RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度 的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来 测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen，et al.，J Mol Biol 293： 865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml 捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被多孔板(Thermo Scientific) 过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。 在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的 目的Fab混合(例如与Presta et al.，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF 抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更 长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板 以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％Tween-20TM的 PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM， Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。 选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。

依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用 BIACORETM-2000或BIACORETM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃ 使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供 应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5， BIACORE，Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然 后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗 原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以 约25μl/分钟的流速注入在含0.05％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST) 中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔 (Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)通过同时拟 合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd) 以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如 果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合 速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光 光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列 SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在 存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab 形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的 升高或降低。

依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate) 或“kon”也可如上所述使用或系统 (BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)来测定。

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例 如，一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似 程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物 学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显 著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50％， 小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。

短语“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个与某分子有 关而另一个与参照/比较分子有关)之间足够高的差异程度，以致本领域技术 人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值 之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个 数值之间的差异例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％， 和/或大于约50％。

“纯化的”意味着分子以至少95％(以重量计)、或至少98％(以包含它 的样品的重量计)的浓度存在于样品中。

“分离的”核酸分子指与例如该核酸分子的天然来源中通常与之关联的 至少一种其它核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子进一步包括包含在 通常表达该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染色体外 形式存在的或在染色体上的定位不同于它其天然染色体定位。

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分 子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA。 另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA 区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制 (例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例 如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组 中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连 接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达 载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说 明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚 合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过 修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或 者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷 酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以 在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核 苷酸可以在合成后包含修饰，诸如偶联至标记物。其它类型的修饰包括例如

“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如 例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯 (phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例 如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例 如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、 氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基 异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。 另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷 酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸 的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或 者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准 保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似 物形式，包括例如2′-氧-甲基-、2′-氧-烯丙基-、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖 类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、 呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。 可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但 不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、 CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代 或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、 环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前 述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是 合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多 核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷 酸。

II.本发明的实施方案

在各种实施方案中，提供了用于以丧失REST功能、β2表达、和/或刻缺 蛋白活化为特征的肿瘤的分类、诊断、治疗、和预防的组合物和方法。在其 它实施方案中，提供了用于调控细胞过程诸如EMT、细胞迁移、和凋亡的组 合物和方法。本发明的这些和其它实施方案基于如下的发现，即在肿瘤中转 录阻抑物REST的丧失导致β2表达，其继而结合并活化刻缺蛋白信号传导。

A.组合物

提供了用于肿瘤(包括顽固性肿瘤)的治疗或预防的组合物。此类组合 物可单独地或是组合地包含REST激动剂、β2拮抗剂、和刻缺蛋白拮抗剂。

一方面，β2拮抗剂是结合β2的阻断性抗体。在一个实施方案中，这样的 抗体阻断(或是部分地或是完全地)β2结合刻缺蛋白。在一个实施方案中， 阻断性抗体结合β2的ECD。本文中描述了某些结合β2的抗体，而且命名为 3D1.4.1(“3D1”)、12A9.22.1(“12A9”)、2E3.1.1(“2E3”)、12E3、或3G5。 本文中还提供了与3D1、12A9、2E3、12E3、或3G5中任一项结合相同表位 的抗体，以及与3D1、12A9、2E3、12E3、或3G5中任一项竞争对β2的结合 的抗体。在一个实施方案中，阻断性抗体选自3D1、12A9、2E3、或3G5。在 一个实施方案中，阻断性抗体与3D1、12A9、2E3、或3G5结合相同表位。在 一个实施方案中，阻断性抗体与3D1、12A9、2E3、或3G5中任一项竞争对β2 的结合。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是单克隆抗体。在某些实施方 案中，抗体是抗体片段，例如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段，或 单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如US Pat.No.6,248,516B1)。 在某些实施方案中，抗体是双特异性抗体(参见例如WO94/04690和Suresh et al.(1986)Methods in Enzymology 121：210)。在某些实施方案中，抗体是嵌合 抗体、人源化抗体、或人抗体。例如，本文中提供了3D1、12A9、2E3、12E3、 或3G5中任一项的人源化形式。

另一方面，β2拮抗剂是降低SCN2B表达的核酸。在一个实施方案中，所 述核酸是对SCN2B特异性的反义核酸。在一个此类实施方案中，所述核酸是 调节性RNA。在一个此类实施方案中，所述核酸通过RNAi降低SCN2B表达。 在一个此类实施方案中，所述核酸是siRNA。本领域中知道某些SCN2B特异 性siRNA。例如，某些SCN2B特异性shRNA是商品化的(例如Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)。本领域中可找到某些其它β2拮抗剂。例如，TAPI-1(α-分泌酶 的一种小分子抑制剂)可用于抑制自β2脱落胞外域(参见Kim et al.，J.Biol. Chem.280：23251-23261，2005)。

另一方面，β2拮抗剂是分离的多肽，优选可溶性多肽，其包含结合β2的 刻缺蛋白片段。结合β2的刻缺蛋白片段预期会与内源刻缺蛋白竞争对β2的结 合。在某些实施方案中，这样的片段基本上不能够实现刻缺蛋白信号传导。 在一个实施方案中，多肽包括包含EGF重复10-21或14-21的哺乳动物刻缺蛋 白1片段，或刻缺蛋白家族成员(例如刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、或刻缺蛋白4) 的功能等同片段。这样的功能等同片段可以例行确认，例如通过比对刻缺蛋 白1的氨基酸序列与第二刻缺蛋白家族成员的多肽序列以鉴定后者中的相应 片段，对如此鉴定出的片段测试β2结合。人刻缺蛋白的氨基酸序列显示于 SEQ ID NO：1。EGF重复10-21大致位于SEQ ID NO：1中的下列位置：

 EGF重复   氨基酸  10   372-410  11   412-450  12   452-488  13   490-526  14   528-564  15   566-601  16   603-639  17   641-676  18   678-714  19   716-751  20   753-789  21   791-827

在另一个实施方案中，分离的多肽包含特异性结合β2的刻缺蛋白片段， 其中“特异性结合”在此语境中意味着该片段基本上不结合任何其它刻缺蛋 白配体。在另一个实施方案中，分离的多肽包含结合β2但不结合锯齿蛋白和 /或DLL的刻缺蛋白片段。在另一个实施方案中，分离的多肽包含结合β2且长 度小于或等于500、450、400、350、300、250、200、150、或100个氨基酸 的刻缺蛋白片段。

另一方面，β2拮抗剂是与刻缺蛋白中结合β2的区域结合的抗体。在一个 实施方案中，所述区域是哺乳动物刻缺蛋白1中包含EGF重复10-21或14-21 的区域，或刻缺蛋白家族成员(例如刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、或刻缺蛋白4) 的功能等同区域。这样的功能等同区域可以例行确认，例如通过比对刻缺蛋 白1的多肽序列与第二刻缺蛋白家族成员的多肽序列以鉴定后者中的响应区 域，并任选对如此鉴定出的区域测试β2结合。在某些实施方案中，与刻缺蛋 白中结合β2的区域结合的抗体特异性阻断β2结合刻缺蛋白，其中“特异性阻 断”在此语境中意味着该抗体不阻断任何其它刻缺蛋白配体结合刻缺蛋白。 在某些实施方案中，与刻缺蛋白中结合β2的区域结合的抗体不结合锯齿蛋白 和/或DLL。

另一方面，组合物包含REST激动剂。在一个实施方案中，REST激动剂 是REST，包括全长REST的片段或变体，其保留REST的生物学活性(例如 肿瘤阻抑物活性)。在另一个实施方案中，REST激动剂是编码上述任一项的 核酸。

另一方面，组合物包含刻缺蛋白拮抗剂。刻缺蛋白活性可以通过各种选 择性办法(例如反义、单克隆抗体、和RNAi)和非选择性办法(例如可溶 性形式的刻缺蛋白或刻缺蛋白诱饵(decoy)、γ-分泌酶抑制剂、胞内MAML1 诱饵、和Ras信号传导抑制剂)来拮抗，而且本领域知道多种刻缺蛋白拮抗 剂。例如，已知多种γ-分泌酶抑制剂抑制刻缺蛋白信号传导活性。参见 Zayzafoon et al.，J.Biol.Chem.279：3662-3670，2004(记载肽模拟物L-685,458 的刻缺蛋白抑制效果)；及Curry et al.，Oncogene 24：6333-6344，2005(记载γ- 分泌酶的肽模拟物抑制剂(LY-411,575)和三肽醛抑制剂的刻缺蛋白抑制效 果)。当前正在临床试验中测试MK-0752(γ-分泌酶的小分子抑制剂和刻缺蛋 白信号传导活性的抑制剂)。参见J.Clin.Oncol.，2006ASCO Annual Meeting Proceedings Part I.Vol 24，No.18S(June 20 Supplement)，2006：6585。

本文中还提供了用于促进EMT、细胞迁移、和/或对凋亡的抗性的组合 物。此类组合物在治疗性背景中会是有用的，例如其中提高细胞存活力和/ 或细胞迁移(例如在伤口愈合中)是所希望的。此类组合物在研究背景中也 会是有用的。此类组合物可单独地或是组合地包含β2激动剂、REST拮抗剂、 或刻缺蛋白激动剂。

一方面，例示性的β2激动剂包含β2，包括全长β2的片段或变体，其保留 β2的生物学活性(例如结合刻缺蛋白和/或活化刻缺蛋白信号传导的能力)。β2 激动剂可包含例如β2的ECD或其片段或变体，其保留结合刻缺蛋白和/或活化 刻缺蛋白信号传导的能力。在另一个实施方案中，β2激动剂是编码上述任一 项的核酸。人β2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。提供了下列特征的大致 位置：信号肽为氨基酸1-29；ECD为氨基酸30-159；跨膜结构域为氨基酸 160-180；胞质结构域为氨基酸181-215；而Ig样结构域为氨基酸32-154。

另一方面，例示性的刻缺蛋白激动剂包含刻缺蛋白，包括全长刻缺蛋白 的片段或变体，其保留刻缺蛋白的生物学活性(例如激活靶基因表达的能 力)。例如，缺少胞外亚基的刻缺蛋白受体是组成性活化的，而且在体外和 在动物模型中具有转化活性。参见Nickoloff et al.，Oncogene 22：6598-6608。 在另一个实施方案中，刻缺蛋白激动剂是结合刻缺蛋白的激动性抗体。

另一方面，例示性的REST拮抗剂包括REST的删除突变体和其它突变体 形式，其具有降低的REST活性(例如降低的肿瘤阻抑物活性)。参见例如 Westbrook et al.，Cell 121：837-848，2005。

B.方法

一方面，本文中提供了用于肿瘤进展(包括顽固性肿瘤)的治疗或预防 的方法。在某些实施方案中，提供了用于抑制肿瘤进展的方法，该方法包括 使肿瘤暴露于一种或多种选自β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂 的药剂。上文中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂， 而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的拮抗 剂。

在另一个实施方案中，所述肿瘤具有降低的REST活性。“降低的REST 活性”指由于例如REST基因中的突变，包括但不限于REST基因整个或部分 的删除、或导致REST生物学活性(例如转录阻抑物活性和/或肿瘤阻抑物活 性)降低的任何其它事件，REST水平有显著降低或REST功能有显著丧失 (REST功能的完全或部分丧失)。肿瘤中降低的REST活性可以通过例如比 较肿瘤中的REST水平或活性与同肿瘤相同组织类型的正常组织中的REST 水平或活性来检测。

在另一个实施方案中，所述肿瘤具有升高的β2活性。“升高的β2活性” 指β2水平或活性(例如结合刻缺蛋白的能力；诱导EMT的能力；诱导细胞迁 移的能力；或阻断凋亡的能力)有显著升高。升高的β2活性可以通过例如比 较肿瘤中的β2水平或活性与同肿瘤相同组织类型的正常组织中的β2水平或 活性来检测。

在另一个实施方案中，所述肿瘤具有升高的刻缺蛋白活性。“升高的刻 缺蛋白活性”指刻缺蛋白水平或活性(例如提高一种或多种靶基因(例如HES 家族基因、细胞周期调节基因(例如p21cip1/waf1、细胞周期蛋白D1)、NF-κB 家族基因、或PPAR家族基因)表达的能力)有显著升高。升高的刻缺蛋白 活性可以通过例如比较肿瘤中的刻缺蛋白水平或活性与同肿瘤相同组织类 型的正常组织中的刻缺蛋白水平或活性来检测。

在另一个实施方案中，所述肿瘤是顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中， 所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中，所述肿瘤是转移性的。在另 一个实施方案中，所述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。 在另一个实施方案中，所述肿瘤在复发性患者中发生。

另一方面，提供了抑制细胞中的EMT的方法，该方法包括使细胞暴露于 一种或多种选自β2拮抗剂、REST激动剂、和刻缺蛋白拮抗剂的药剂。上文 中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂，而且可以在本 文所述方法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的拮抗剂。在另一个 实施方案中，所述细胞具有降低的REST活性，如上文所定义的。在另一个 实施方案中，所述细胞具有升高的β2活性，如上文所定义的。在另一个实施 方案中，所述细胞具有升高的刻缺蛋白活性，如上文所定义的。在另一个实 施方案中，所述细胞在体外。在另一个实施方案中，所述细胞在体内。在另 一个实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在一个此类实施方案中，所述肿瘤 细胞来自顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中，所述肿瘤对化疗有抗性。在 另一个实施方案中，所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中， 所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞或选自图10E的肿瘤细胞类型。在另一个实施 方案中，所述肿瘤细胞来自复发性患者。

另一方面，提供了抑制细胞迁移的方法，该方法包括使细胞暴露于一种 或多种选自β2拮抗剂、REST激动剂、和刻缺蛋白拮抗剂的药剂。上文中讨 论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂，而且可以在本文所 述方法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的拮抗剂。在另一个实施 方案中，所述细胞具有降低的REST活性，如上文所定义的。在另一个实施 方案中，所述细胞具有升高的β2活性，如上文所定义的。在另一个实施方案 中，所述细胞具有升高的刻缺蛋白活性，如上文所定义的。在另一个实施方 案中，所述细胞在体外。在另一个实施方案中，所述细胞在体内。在另一个 实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在一个此类实施方案中，所述肿瘤细胞 来自顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中，所述肿瘤对化疗有抗性。在另一 个实施方案中，所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中，所述 肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞或选自图10E的肿瘤细胞类型。在另一个实施方案 中，所述肿瘤细胞来自复发性患者。

另一方面，提供了促进细胞中的凋亡的方法，该方法包括使细胞暴露于 一种或多种选自β2拮抗剂、REST激动剂、和刻缺蛋白拮抗剂的药剂。上文 中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂，而且可以在本 文所述方法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的拮抗剂。在另一个 实施方案中，所述细胞具有降低的REST活性，如上文所定义的。在另一个 实施方案中，所述细胞具有升高的β2活性，如上文所定义的。在另一个实施 方案中，所述细胞具有升高的刻缺蛋白活性，如上文所定义的。在另一个实 施方案中，所述细胞在体外。在另一个实施方案中，所述细胞在体内。在另 一个实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在一个此类实施方案中，所述肿瘤 细胞来自顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中，所述肿瘤对化疗有抗性。在 另一个实施方案中，所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中， 所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞或选自图10E的肿瘤细胞类型。在另一个实施 方案中，所述肿瘤细胞来自复发性患者。

另一方面，提供了促进细胞中的EMT的方法，该方法包括使细胞暴露于 一种或多种选自β2激动剂、REST拮抗剂、和刻缺蛋白激动剂的药剂。上文 中讨论了某些β2激动剂、刻缺蛋白激动剂、和REST拮抗剂，而且可以在本 文所述方法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的激动剂。在另一个 实施方案中，所述细胞在体外。在另一个实施方案中，所述细胞在体内。

另一方面，提供了促进细胞迁移的方法，该方法包括使细胞暴露于一种 或多种选自β2激动剂、REST拮抗剂、和刻缺蛋白激动剂的药剂。上文中讨 论了某些β2激动剂、刻缺蛋白激动剂、和REST拮抗剂，而且可以在本文所 述方法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的激动剂。在另一个实施 方案中，所述细胞在体外。在另一个实施方案中，所述细胞在体内。

另一方面，提供了阻断凋亡的方法，该方法包括使细胞暴露于一种或多 种选自β2激动剂、REST拮抗剂、和刻缺蛋白激动剂的药剂。上文中讨论了 某些β2激动剂、刻缺蛋白激动剂、和REST拮抗剂，而且可以在本文所述方 法中使用。在一个实施方案中，所述药剂是β2的激动剂。在另一个实施方案 中，所述细胞在体外。在另一个实施方案中，所述细胞在体内。

另一方面，提供了确定肿瘤是否会响应β2拮抗剂或刻缺蛋白拮抗剂的方 法，该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性，其中所述肿 瘤中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤会响应β2拮抗剂或刻缺蛋 白拮抗剂。在一个实施方案中，所述方法包括检测肿瘤中降低的REST活性。 在一个此类实施方案中，所述方法包括检测REST基因中导致REST活性降低 的突变。在一个此类实施方案中，所述方法包括检测REST基因中的删除。 在另一个实施方案中，所述方法包括检测肿瘤中升高的β2活性。在一个此类 实施方案中，所述方法包括检测升高的SCN2B mRNA水平。在另一个此类实 施方案中，所述方法包括检测升高的β2蛋白质水平。在一个此类实施方案中， 所述方法包括检测胞外环境中升高的β2ECD水平。在另一个实施方案中，所 述肿瘤是顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中，所述肿瘤对化疗有抗性。在 另一个实施方案中，所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中，所述肿瘤 是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。在另一个实施方案中，所述 肿瘤来自复发性患者。

另一方面，提供了评估肿瘤预后的方法，该方法包括检测肿瘤中降低的 REST活性或升高的β2活性，其中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿 瘤具有不良预后。“不良预后”意味着有实质性的可能性(＞50％机会)，肿 瘤是或会是顽固性和/或转移性的。在一个实施方案中，所述方法包括检测肿 瘤中降低的REST活性。在一个此类实施方案中，所述方法包括检测REST基 因中导致REST活性降低的突变。在一个此类实施方案中，所述方法包括检 测REST基因中的删除。在另一个实施方案中，所述方法包括检测肿瘤中升 高的β2活性。在一个此类实施方案中，所述方法包括检测升高的SCNB2 mRNA水平。在另一个此类实施方案中，所述方法包括检测升高的β2蛋白质 水平。在一个此类实施方案中，所述方法包括检测胞外环境中升高的β2ECD 水平。在另一个实施方案中，所述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类 型的肿瘤。

另一方面，提供了将肿瘤分类为其中刻缺蛋白信号传导被激活的肿瘤的 方法，该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性，其中降低 的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤是其中刻缺蛋白信号传导被激活的 肿瘤。在一个实施方案中，所述方法包括检测肿瘤中降低的REST活性。在 一个此类实施方案中，所述方法包括检测REST基因中导致REST活性降低的 突变。在一个此类实施方案中，所述方法包括检测REST基因中的删除。在 另一个实施方案中，所述方法包括检测肿瘤中升高的β2活性。在一个此类实 施方案中，所述方法包括检测升高的SCNB2mRNA水平。在另一个此类实施 方案中，所述方法包括检测升高的β2蛋白质水平。在一个此类实施方案中， 所述方法包括检测胞外环境中升高的β2ECD水平。在另一个实施方案中，所 述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。在另一个实施方案中， 所述肿瘤是顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中，所述肿瘤对化疗有抗性。 在另一个实施方案中，所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中，所述肿 瘤来自复发性患者。

C.药物配制剂和施用

包含药剂(例如上文II.A部分中所提供的抗体、蛋白质或核酸)的药物 配制剂可以依照暴露于普遍知道的方法来制备。通过将具有期望纯度的药剂 与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合来制备此类配制剂，以水溶液 或冻干或其它干燥剂型的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采 用的剂量和浓度对接受者一般是低毒性的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、 柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防 腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯 铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙 酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于 约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性 聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘 露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山 梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非 离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于 体内施用的药物配制剂一般是无菌的。这可容易地通过经无菌滤膜过滤来实 现。

药剂还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例 如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状 药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶 囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有活性药剂的固 体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微 胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯 酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L- 谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚 物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可 注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇 酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时 间较短。当胶囊化药剂在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮 湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和(对于抗体而言)免疫原性可 能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机 制是经由硫-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、 自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合 物来实现稳定。

另一方面，提供了为治疗或预防而施用药剂(例如上文II.A部分中所提 供的抗体、蛋白质或核酸)的方法。在某些实施方案中，所述药剂与至少一 种别的治疗剂和/或佐剂组合施用。在某些实施方案中，别的治疗剂是细胞毒 剂、化疗剂、或生长抑制剂。在一个此类实施方案中，化疗剂是结肠癌治疗 中所使用的药剂或药剂组合。此类药剂包括但不限于单独的或与亚叶酸 (leucovorin)或左旋咪唑(levamisole)组合的氟尿嘧啶(5FU)；edrocolomab；伊 立替康(irinotecan)；奥沙利铂(oxaliplatin)；雷替曲塞(raltitrexed)；和氟嘧啶 (fluoropyrimidines)。

上文所述此类联合疗法涵盖联合施药(其中相同或分开配制剂中包含两 种或更多种治疗剂)和分开施药，在后一种情况中，本发明药剂的施用可发 生在别的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、和/或之后。所述药剂也可以 与放射疗法联合使用。

可通过任何合适手段来施用本发明的药剂(和任何别的治疗剂或佐剂)， 包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及损伤内(如果希望局部治疗 的话)施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施 用。另外，可通过脉冲输注来施用药剂，特别是剂量衰减的药剂。可通过任 何合适路径服药，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施 药是短期的还是长期的。

例如，可以使用基因疗法来将本文所述任何核酸投递至体内细胞。依照 一个实施方案，使用靶向剂将含有核酸的媒介引导至期望组织。

当前一般有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入哺乳动物的 细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要核酸和(如 果可行的化)所编码的多肽的部位将核酸直接注射入哺乳动物。对于回体治 疗，取出哺乳动物的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细 胞或是直接施用于哺乳动物，或是例如装入多孔膜内并植入哺乳动物(参见 例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。

有多种技术可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移 入体外培养细胞还是体内转移入感兴趣宿主的细胞而有所变化。适于在体外 将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、转 导、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。转导牵涉复制缺陷型重 组病毒(包括但不限于逆转录病毒)颗粒与细胞受体的结合，接着颗粒所包 含的核酸导入细胞。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

常用的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒载体(诸如腺病毒、慢病 毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒(AAV))和基于脂质的系统(可用于脂质 介导的核酸转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol；参见例如 Tonkinson et al.，Cancer Investigation，14(1)：54-65(1996))进行的转染。此类 载体用于合成可用作投递药剂(诸如本发明的拮抗剂和核酸分子)的媒介的 病毒。基因疗法中最常用的载体是病毒，例如腺病毒、AAV、慢病毒或逆转 录病毒。在一个实施方案中，病毒载体(诸如逆转录病毒载体)包含至少一 种转录启动子/增强子或基因座限定元件(locus-defining element)、或通过其它 手段(诸如可变剪接、核RNA输出、或信使的翻译后修饰)控制基因表达的 其它元件。另外，病毒载体(诸如逆转录病毒载体)可包含与感兴趣核酸可 操作连接且充当翻译起始序列的核酸分子。此类载体构建物还可包含包装信 号、长末端重复(LTR)或其部分、及适于所用病毒的正链和负链引物结合位 点(如果病毒载体中原先没有这些的话)。另外，此类载体构建物可包含信 号序列，供所编码多肽自它所在宿主细胞分泌。任选的是，载体构建物还可 包含指导多腺苷酸化的信号，以及一种或多种限制性位点和翻译终止序列。 举例而言，载体通常会包含5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二条DNA 链合成的起点、和3′LTR或其部分。可使用的其它载体有非病毒的，诸如阳 离子脂质、聚赖氨酸和树状聚体。

在有些情况中，将用于投递核酸或其它分子的媒介与使媒介靶向特定细 胞群的靶向剂结合。希望与靶向靶细胞的药剂一起提供核酸源。在一个实施 方案中，所述靶向剂是对靶细胞上细胞表面膜蛋白特异的抗体、靶细胞上受 体的配体等。在采用脂质体的情况中，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合 的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入。受体介导的胞吞技术记载于例如Wu et al.，J.Biol.Chem.，262：4429-4432(1987)；及Wagner et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，87：3410-3414(1990)。

关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al.， Science，256：808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。 合适的基因疗法和制备逆转录病毒颗粒和结构蛋白的方法可参见例如美国 专利No.5,681,746。

本发明的抗体会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用。 在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患 者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日 程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前 用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有 效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型、和上文讨 论的其它因素。这些一般是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是本 文所述剂量的大约1-99％，或者凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何 路径。

对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适宜剂量(在单独地或与一种或 多种其它别的治疗剂组合地使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类 型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗 法、患者的临床病史和对抗体的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次 性或通过一系列治疗将抗体施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用 于患者的初始候选剂量可以约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗 体，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因 素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或 更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体 的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。如此，可对患者施用约 0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。 这些剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20 剂，或例如约6剂抗体)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂 较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂 量，后续每周一剂约2mg/kg抗体的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是 有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。

实施例

A.材料和方法

1.肿瘤组织中β2的检测

在载玻片上将新鲜的、冷冻的结肠肿瘤组织切片成5-10mm。使用 Arcturus PixCell系统实施LCM。使用15或30mm激光像素大小，自H&E染色 的切片解剖肿瘤细胞或正常上皮；每份样品收集等量的100-3000个细胞。分 离RNA，生成探针，并在cDNA微阵列上杂交。使用来自Biocare Medical (Concord，CA)的MACH 3家兔探针HRP聚合物试剂盒或MACH 3小鼠探针 HRP聚合物试剂盒遵循制造商的指导实施免疫组织化学(IHC)。抗REST多克 隆抗体(Upstate，Lake Placid，NY)或抗β2单克隆抗体(3D1，Genentech，Inc.)与 人结肠腺癌(III级)和结肠转移癌组织阵列(Cybrdi，Gaithersburg，MD)一起使 用。

2.SCN2B(β2)质粒构建和转染

SCN2B.ECD.HIS构建物：将编码C端带多组氨酸标签(HIS8)的SCN2B ECD的核酸克隆入pSVI7载体(DHFR)中并使用Fugene 6(Roche Diagnostics， Indianapolis，IN)转染入DP12 CHO细胞中。在含有200nM甲氨蝶呤的培养基 中选择克隆。使用Ni-NTA珠(Qiagen，Valencia，CA)自经转染DP12细胞培养液 纯化β2蛋白质，用于表型研究、单克隆抗体生成、和刻缺蛋白1结合研究。 SCN2B.FL.GFP：将全长SCN2B构建物克隆入pSVIPD.IRES.GFP载体(嘌呤 霉素抗性标记)中并转染入CHO或SW620细胞中，用于抗体筛选和表型测定。

3.细胞培养

在补充有10％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的RPMI1640或 F12∶DMEM50∶50培养基中维持人肿瘤细胞系。在补充有10％FBS、GHT、L- 谷氨酰胺和青霉素-链霉素的F12∶DMEM50∶50培养基维持CHO细胞。在补充 有EGM-2(Cambrex，Valkersville，MD)的EBM-2培养基中维持HUVEC细胞。

4.免疫印迹分析

在溶解缓冲液(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCL，8M尿素和0.05％ tween-20，pH 8.0)中以超声处理来裂解细胞，并将溶胞物(通常是25μg总蛋 白质)加载到4-12％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上。将蛋白质转移到PVDF 膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)或Nictrocellulose膜(Invitrogen)上。将免疫印迹在 含2％BSA，5％奶粉的PBS中于4℃封闭过夜。使用下列抗体：小鼠抗β2单克 隆或家兔抗β2多克隆(Genentech，Inc.)、抗REST多克隆抗体(Upstate，Lake Placid，NY)、抗刻缺蛋白1(G20)多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、抗FLAG抗体(Sigma)。使用偶联有IRDye680的山羊抗小鼠IgG或 偶联有IRDye680的驴抗家兔IgG(Roekland Inc.，Gilbertsville，PA)来实施二次 检测。通过用Odyssey红外线成像系统(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)扫描 印迹来检测和分析免疫反应性条带。或者，使用ECL抗小鼠IgG HRP (Amersham)来实施二次检测，并使用Chemiglow West(Alpha Innotech)来检 测。

5.β2抗体的生成

用Ribi佐剂(Ribi Immunochem Research，Inc.，Hamilton，MO)中来自CHO 细胞的重组带多组氨酸标签(HIS8)的人β2ECD(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)超免疫五只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories，Hollister， CA)。使用与先前所述(Kohler和Milstein，Nature 256：495-497，1975；Hongo et al.，Hybridoma 14：253-260，1995)类似的改良方案将来自这些小鼠(都展现出 高抗β2抗体滴度(根据直接ELISA)和对CHO细胞上表达的β2的特异性结合 (根据FACS))的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；ATCC，Rockville， MD)融合。10-12天后，收获上清液，并通过直接ELISA和FACS来筛选抗体 生成。扩展并培养在第二轮亚克隆后显示最高免疫结合的克隆。使用与先前 所述(Hongo et al.，见上文)类似的改良方案通过亲和层析(Pharmacia快速蛋 白质液体层析[FPLC]；Pharmacia，Uppsala，Sweden)纯化自每种杂交瘤谱系 收获的上清液。然后将纯化的抗体制备物无菌过滤(0.2μm孔径；Nalgene， Rochester NY)并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中保存于4℃。

6.免疫荧光

波形蛋白和肌动蛋白细胞骨架(罗丹明-鬼笔环肽)：将细胞在4％低聚甲 醛中于室温固定20分钟，并用0.05％皂苷于室温透化5分钟。对于β2、REST、 经切割的刻缺蛋白1NICD和E-钙粘着蛋白染色：将细胞在甲醇中于4℃固定2 分钟。一抗温育于室温进行1小时(用于波形蛋白染色)或15分钟(用于罗 丹明-鬼笔环肽染色)或于37℃进行1小时(用于β2、REST、经切割的刻缺蛋 白1NICD和E-钙粘着蛋白染色)。二抗温育于室温进行30分钟。所使用的抗 体如下：抗锚蛋白单克隆抗体(Chemincon International，Temecula，CA)；抗波 形蛋白单克隆抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)；罗丹明-鬼笔环肽 (Molecular Probes，Eugene，OR)，抗REST多克隆抗体(Upstate，Lake Placid， NY)，抗E-钙粘着蛋白单克隆抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，抗刻缺蛋白1 (Val1744肽，检测完整的和经切割的刻缺蛋白1NICD)(Cell Signaling， Danvers，MA)或抗β2单克隆抗体(Genentech，Inc.)。二抗如下：偶联有Cy3的 家兔抗小鼠IgG或偶联有Cy3的驴抗家兔IgG(Jackson Lab，Bar Harbor， Maine)。用Vectashield封固介质及DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)(Vector Lab， Burlingame，CA)封固载玻片。在配备有照相机的显微镜上使用60X放大倍数 获取图像。使用Adobe Photoshop软件生成图像覆盖。为了完整的或经切割的 刻缺蛋白1NICD染色，在二抗温育后，将载玻片与Hoechst 44257一起于室温 温育20分钟以对细胞核染色，并用Prolong Gold抗褪色试剂(Invitrogen， Carlsbad，CA)封固。使用LSM510激光扫描共焦显微镜(Carl Zeiss Micro Imaging，Inc.，Thornwood，NY)获取图像。使用Chameleon激光(Coherent，Santa Clara，CA)的二光子激发来进行DAPI显现，其具有完全打开的针孔。使用 HeNe(543nm)激光来进行荧光激发，针孔设置成一个Airy单位。保存TIFF 格式的图像并在Photoshop中装配。

7.β2和β2-ECD诱导表型测定法

培养表达β2ECD的CHO细胞至80％汇合，并收集和离心培养基以除去任 何细胞碎片。使用此条件培养基来处理细胞系，供所描述的分析用。使用自 经载体转染的CHO细胞收集的培养基作为对照。为了鬼笔环肽、波形蛋白和 E-钙粘着蛋白染色，将用条件培养基处理的细胞用抗体染色48或72小时。

8.抗体阻断测定法

将经SCN2B和载体转染的CHO细胞和SW620细胞以25％汇合接种到1孔 腔式玻璃载玻片(Nalge Nunc International，Rochester，New York)上。将抗β2单 克隆抗体以100ng/ml添加至细胞培养液。72小时后，将细胞用罗丹明鬼笔环 肽染色。

9.β2消减测定法

使用Seize Primary免疫沉淀试剂盒(Pierce，Rockford，IL)遵循制造商的指 令制备偶联有抗β2单克隆抗体的凝胶。将自DP12/SCN2B.ECD.HIS细胞收集 的细胞培养液与偶联有抗β2单克隆抗体的凝胶一起温育2小时以除去β2。将 流出液添加至细胞，供表型分析用。使用相同的规程用偶联有PBS的凝胶进 行模拟β2消减。还使用Ni-NTA珠(Qiagen)来消减β2。

10.迁移测定法

使用8mm孔径的HTS FluoroBlock多孔插入系统(BD Biosciences，Bedford， MA)实施迁移测定法。将105个细胞/孔接种到上部孔中，并将FBS添加至底 部孔。18小时后，将迁移至穿孔膜另一侧的细胞在10um YO-PRO-1碘化物 (Invitrogen，Eugene，OR)中染色，并使用荧光读板仪Spectra Max GeminiEM (Molecular Devices，Sunnyvale，CA)定量。

11.细胞死亡和药物抗性

对饥饿的抗性：将SW620细胞在完全培养基中以25％汇合接种到6孔板 中过夜。次日上午用缺少FBS的培养基更换此培养基。为了测定，将细胞用 胰蛋白酶脱离，清洗，并在0.4％台盼蓝(Invitrogen，Carlsbad，CA)中染色。使 用血球计对总细胞和死亡细胞计数。一式三份实施测定。多柔比星抗性：在 具有盐酸多柔比星(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)连续稀释度的96孔透明底 黑色板(Corning Inc.，Corning，NY)中接种2x104个SW620细胞并温育5天。使用 Cell Titer Glo发光细胞存活力试剂盒(Promega，Madison，WI)来测量细胞存活 力。使用Envision 2103多标记阅读仪(PerkinElmer，Finland)对荧光定量。甲氨 蝶呤抗性：在具有条件培养基中的β2ECD或对照条件培养基(二者含有 200nm甲氨蝶呤(Genentech Inc.))的6孔板中接种5x105个CHO细胞。使细胞 脱离板并用台盼蓝0.4％(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色，如所描述的。

12.siRNA敲低

使用60nm siRNA及DharmaFECT 2作为转染子实施SW620细胞中REST、 Twist1或刻缺蛋白1的siRNA敲低。使用一种非靶向siRNA序列(Dharmacon， Lafayette，CO)作为阴性对照。siREST转染后4天实施免疫荧光染色和RT-PCR 分析。对于Twist1和刻缺蛋白1敲低，转染后24-48小时用条件培养基中的β2 ECD处理细胞，接着在又温育24-48小时后进行免疫荧光染色或RT-PCR分析。 对于siREST实验，转染后12小时添加抗β2抗体。由Dharmacon(Lafayette，CO) 设计和合成siRNA双链体。主要靶序列如下：

siREST：5’-CAACGAAUCUACCCAUAUUUU-3’(SEQ ID NO：3)。

siTwist1：5’-GCGACGAGCUGGACUCCAAUU-3’(SEQ ID NO：4)。

siNotch1：5’-GCGACAAGGUGUUGACGUUUU-3’(SEQ ID NO：5)。

别的siRNA序列：

siTWIST1：5’-CUGCAGACGCAGCGGGUCAUU-3’(SEQ ID NO：6)，

          5’-GGAGUCCGCAGUCUUACGAUU-3’(SEQ ID NO：7)，

          5’-GAGCAAGAUUCAGACCCUCUU-3’(SEQ ID NO：8)；

SiNotch1：5’-GAUGCGAGAUCGACGUCAAUU-3’(SEQ ID NO：9)，

          5’-GAACGGGGCUAACAAAGAUUU-3’(SEQ ID NO：10)，

          5’-GCAAGGACCACUUCAGCGAUU-3’(SEQ ID NO：11)。

13.用于E-钙粘着蛋白强度计算的图像加工

在Photoshop CS2(9.0.2版，Adobe；San Jose，CA)中将图像自Photoshop格 式转换成Tif。在Metamorph(7.0r4版，Molecular Devices；Sunnyvale，CA)中打 开图像，并进行自动化分析例行程序。简言之，为每组图像应用一阈值(最 大像素值的大约10-15％)以除去背景。使用标准消蚀功能来进一步降低背景 和平滑剩余区域的边缘。将每个区域的面积和强度测量直接输出至Excel (Microsoft，Redmond，WA)。一个图像小子集具有高出背景但低于阈值的特殊 染色。对此子集，手工创建感兴趣区域以获得面积和强度测量。典型的是， 为每次分析分析和组合5个独立区域。

14.统计分析

一式三份(或更多)地实施分析，并在Microsoft Excel中使用Student氏T 检验(方差相等，单尾分布)来分析。

15.结合测定法

免疫沉淀：使用5mm EDTA自培养板除去细胞，并在含有0.5％NP-40、 无EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)和1mm PMSF的 TBS中裂解。将溶胞物与预饱和的蛋白G-琼脂糖(Roche Diagnostics， Indianapolis，IN)一起于4℃温育1.5小时，接着与抗β2单克隆抗体一起于4℃ 温育2小时。然后将此溶胞物和抗体混合物与预先饱和的蛋白G-琼脂糖一起 于4℃温育过夜。收集琼脂糖并在Tris-甘氨酸凝胶加载缓冲液(Invitrogen， Carlsbad，CA)中洗脱蛋白质，供免疫印迹分析用。直接结合：如上所述收集 条件培养基，与15ml中带FLAG标签的刻缺蛋白1ECD：6-36(5μg)一起在摇动 中于室温温育2小时。添加50μl Ni-NTA琼脂糖珠浆(Qiagen)，并在摇动中于 室温温育2小时。通过离心来收集Ni-NTA珠，并用PBS清洗3次。或者，用 Ni-NTA珠处理条件培养基以富集β2，并将所得浆与1ml PBS中的刻缺蛋白1 ECD：6-36(5μg)一起温育，清洗，如所描述的。将样品洗脱入2X加载缓冲液 中。

16.微阵列分析

通过使用机械点样仪(Norgren Systems，Mountain View，California)将自 cDNA克隆(Invitrogen，Carlsbad，California和Genentech，Inc.)衍生的PCR产物 印到经3-氨丙基三乙氧基硅烷(Aldrich，Milwaukee WI)和1，4-亚苯基二异硫氰 酸盐(Aldrich，Milwaukee，WI)包被的玻璃载玻片上，生成代表9031种基因的 微阵列。通过CsCl分步梯度(Kingston RE，于Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1(Ausubel FM，et al.编)4.2.5-4.2.6(John Wiley和Sons，Inc.，USA， 1998))实现了自LCM材料分离RNA。如下，通过保守扩增和后续标记，生成 供阵列分析用的探针：使用单轮改良体外转录方案(MEGASCript T7，Ambion， Austin，Texas)扩增自总RNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)的寡dT引发生成的双 链DNA。使用所得cRNA作为模板来生成有义DNA探针，其中使用随机引物 (9聚物，0.15mg/ml)、Alexa 488dUTP或Alexa 546dUTP(分别为40μM和 6μM，Molecular Probes，Eugene，Oregon)并使用自MMLV衍生的逆转录酶 (Invitrogen，Carlsbad，CA)。自来自通用参照RNA(Strategene，La Jolla，CA)的 0.1μg总RNA生成用于反映一般上皮细胞表达的参照探针。在50％甲酰胺/ 5X SSC中于37℃将探针杂交至阵列过夜，并在次日在2X SSC，0.2％SDS中接 着在0.2X SSC，0.2％SDS中清洗。使用配备有Xenon光源和适于每一种染料 的光学过滤器的基于CCD-照相机的成像系统(Norgren Systems，Mountain View，California)收集阵列图像。收集完整动力学范围图像(Autograb， Genentech Inc)并使用在Matlab(the Math Works，Natick，Massachusetts)平台上 构建的自动化网格和数据提取软件(gImage，Genentech，Inc.)提取强度和比 率。

17.微阵列数据分析

通过将对数比率(log ratio)对N强度绘图和通过拟合每个强度水平处的正 态分布，将比值为每次实验内不同强度值处的实验散布标准化。为每次实验 中的每种转录物推导零均值附近的标准偏差(Z值)的度量，而且在数据挖 掘(data mining)中使用此数值。具体而言，对于每个微阵列，我们通过计算Z 值来标准化数据，Z值是自测试与参照数据的比率的对数对测试与参照数据 的最小值的对数的散点图获得的。通过将LOESS算法应用于散点图，作为强 度的函数，我们评估比率的中值。我们如下评估标准误差，即将LOESS应用 于绝对残差(absolute residual)的平方根，将结果平方以获得绝对中位差 (median absolute deviation，MAD)，并进行乘法修正以自MAD转换成标准误 差。为每项比率确定Z得分，即将其距中值LOESS曲线的垂直距离除以该强 度处的标准误差。使用Rosetta Resolver中的统计检验(Student氏T检验，方 差相等，双尾分布)鉴定在肿瘤与正常上皮之间差异表达的基因。

B.结果

1.β2在肿瘤中表达

经由对激光捕捉显微解剖材料的微阵列表达序型分析，这种技术已证明 能自复杂组织和疾病状态诸如肿瘤分离离散细胞群，容许鉴定先前没有与这 些细胞联系起来的基因表达(Buckanovich et al.，Cancer Biol.Ther.5：635-642， 2006；Espina et al.，Methods Mol.Biol.319：213-229，2006)，我们发现了结肠肿 瘤细胞中的β2表达。

对新鲜的、冷冻的结肠肿瘤切片实施了激光捕捉显微解剖(LCM)和转录 物序型分析。样品收集偏向于肿瘤-基质边界附近的肿瘤细胞。使用LCM还 分离了五组正常结肠上皮。在比较样品群的Student氏T检验中，与正常上皮 相比，β2转录物被鉴定为在肿瘤上皮中过表达(p值＝0.0014，图1A；图10A)。 使用对自邻近肿瘤切片子集分离的RNA的RT-PCR确认了β2转录物的检测 (图10B)。作为另一项确认，对一些邻近肿瘤切片实施了非同位素原位杂交 (图10C)，确认了肿瘤细胞表达。

通过使用抗β2单克隆抗体进行的免疫组织化学和组织微阵列对结肠肿 瘤中β2表达的更广泛分析，揭示了来自41名患者中22名(54％)的III级原发 性肿瘤和转移性肿瘤(通常是淋巴结)的肿瘤细胞中和62份正常结肠样品中 5份(8％)中的表达。肿瘤染色是异质的，而且常常本质上是点状的，显示 了肿瘤上皮间强度和分布的变化(图1B)。虽然LCM分析偏向于肿瘤-基质 边界，但是这不排除别处的表达，而且在肿瘤边缘以及不是明显被基质束缚 的肿瘤上皮其它区域检测到β2。在5份β2阳性正常结肠中观察到的染色是弱 至中等的，而且仅存在于周围细胞中，上皮隐窝细胞中没有。总之，这些数 据指示β2转录物和蛋白质二者在超过50％的结肠肿瘤中表达，与正常结肠上 皮中非常有限的表达形成对比。对自肿瘤组织分离的蛋白质的免疫印迹分析 指示β2在其它肿瘤类型中也表达(图10E)。

2.β2诱导细胞形态转化

EMT是一种转分化过程，其中上皮细胞获得更加运动性、侵入性细胞的 许多属性，包括更加纺锤状、成纤维细胞形态的形成。β2全长蛋白质的表达 或用含有仅仅β2胞外结构域(ECD)的条件培养基处理细胞诱导显著的细胞伸 长和扩大以及肌动蛋白细胞骨架的重建(图2A)。在众多细胞系中观察到这 些变化，包括肿瘤细胞系，诸如NCI-H226和SW620，以及CHO细胞(中国 仓鼠卵巢；图2A)。确认这些变化源自β2蛋白质的表达后，使用对β2的ECD 特异性的单克隆抗体可以阻断这些效果(图2B)：许多新近分裂的细胞恢复 至更加正常、圆形的外观。用无关对照抗体(抗豚草抗体)处理的细胞保留 β2诱导的形态变化。

β2含有约129个氨基酸的预测成熟ECD(主要由Ig结构域组成)以及跨 膜区和短(约35个氨基酸)胞内结构域。通过表达设计成自CHO细胞分泌的 C端带his(8)标签的ECD构建物，我们调查了单独的ECD是否能诱导形态变 化。当放置在多种不同细胞类型上时(未处理的CHO细胞、MDCK细胞、 HUVEC(内皮)、或肿瘤细胞系NCI-H226、SW620、SW480、和PC-3；图2A、 图11A)，48-72小时后含有β2ECD的条件培养基能够诱导与上文所述那些相 似的表型变化。为了确认这些效果是由于β2ECD的存在，自培养基消减β2 蛋白质，然后添加至未处理的NCI-H226细胞。使用罗丹明-鬼笔环肽染色评 估了肌动蛋白细胞骨架的变化，而且通过对β2蛋白质的免疫印迹分析了每份 样品(图2C)。经模拟消减的含有β2蛋白质的条件培养基诱导完全的表型变 化。基本上消减了(＞90％)β2的条件培养基不产生可检测的表现变化，而 部分消减了β2的条件培养基产生中间表型，其中细胞扩大且伸长但程度低于 经模拟处理的细胞。这些数据指示在β2ECD条件培养基中观察到的表型变化 依赖于β2ECD并反映β2蛋白质水平。

3.β2促进迁移并赋予针对细胞死亡的保护

与经历EMT的细胞密切相关的一项物理特性是运动升高。通过比较用β2 和载体转染的SW620细胞或用β2ECD处理的细胞穿过Transwell膜迁移至含 有胎牛血清(0.1％)的培养基的能力，调查了β2对肿瘤细胞迁移的影响。转染 效率为约75％，其中用SCN2B转染的池中约40％的细胞展示典型的由β2诱导 的表型变化。18小时后，对用β2转染的细胞和用条件培养基中的β2ECD处理 的细胞都观察到显著的迁移升高(图3A；p分别为0.03和0.0009)。相反，用2 种独立的抗β2抗体处理内源表达β2的SW480细胞(见图5A)导致迁移降低(图 3B，每种抗体的p为0.001)，进一步支持β2在促进细胞迁移中的作用。

EMT的另一项特性是对细胞死亡的抗性升高(Lee et al.，2006)。在经受饥 饿和化疗药物处理二者的SW620细胞中调查了β2影响此特性的能力。使用β2 或载体转染的对照细胞在缺少血清的培养基中经受为期2周的饥饿，并使用 台盼蓝排除测定法与用载体转染的对照细胞比较细胞存活力。β2显著提高细 胞存活力，与用载体转染的对照细胞的35％相比只有少于10％的细胞死亡(p 为0.002，图3C)。β2还提升在暴露于化疗药物多柔比星后对细胞死亡的抗性 (图3D)。在10倍的药物浓度范围里，用β2转染的SW620细胞展示与用载体 转染的对照细胞相比显著升高的存活力，如通过定量细胞存活力测定法(Cell Titer Glo，Promega，Madison，WI)所测定的。最后，我们观察到CHO细胞的β2 表达提高它们对化疗药物甲氨喋呤的抗性，其中甲氨喋呤用于选择用全长β2 转染的CHO细胞。为了独立评估这一点，将来自表达仅β2ECD的CHO细胞 的条件培养基添加至未处理CHO细胞，并与用对照条件培养基处理的细胞比 较。在200nM甲氨喋呤存在48小时的情况中，60％用对照处理的细胞死亡， 而大多数用β2-ECD处理的细胞仍然存活(图3E，p为0.01)，其中只有10％的 细胞死亡。这些数据指示单独的β2ECD赋予对化疗药物的抗性。

4.β2诱导E-钙粘着蛋白丧失和波形蛋白获得且此过程依赖于EMT相差 转录因子Twist1

E-钙粘着蛋白充当上皮表型看护(caretaker)之一，而且其丧失与肿瘤引发 和进展二者有关(Thiery和Sleeman，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7：131-142，2006)。 E-钙粘着蛋白的丧失还与经历EMT的细胞强烈有关。SW620细胞表达E-钙粘 着蛋白(图4A)，而且用β2转化或用条件培养基中的β2ECD处理48小时大大 降低E-钙粘着蛋白蛋白质水平，如通过免疫荧光(图4A)和FACS分析(图 4B)所证明的。所诱导的间充质中间丝蛋白波形蛋白表达是经历EMT的上皮 细胞的另一项特性(Huber et al.，Curr.Opin.Cell Biol.17：548-558，2005；Lee et al.，J.Cell Biol.172：973-981，2006；Thiery和Sleeman，见上文)。表达全长β2或 用条件培养基中的β2ECD及抗波形蛋白抗体处理的SW620细胞的免疫荧光 染色揭示了相对于其它方式情况下波形蛋白不可检测的水平而言，波形蛋白 蛋白质表达有实质性升高(图4C)。

考虑到全长β2和β2ECD二者诱导E-钙粘着蛋白丧失和形态转化的能力， 调查了能够介导EMT的转录因子的表达。为了便于检测可能展示瞬时表达或 经受反馈调节的转录物，用条件培养基中的β2ECD处理SW620细胞，并在不 同时间点分离RNA。微阵列分析揭示了用β2ECD处理后6小时对Twist1转录 物的诱导，在后续时间点有振荡表达样式(图12A)。RT-PCR分析确认了Twist1 的表达(图12B)，而且没有对其它已表征EMT转录因子诸如Snail和 Slug/Snail2的转录物的诱导的显著或强烈证据(未显示)。已经为多种转录因 诸如HES1(其介导它们自己的负调节)(Hirata et al.，Science 298：840-843， 2002)报告了振荡调节样式(oscillating pattern of regulation)，而且我们对Twist1 的观察结果提示它受到类似调节或由以此方式振荡的转录因子诱导的可能 性。因为Twist1是对E-钙粘着蛋白启动子中E盒序列起作用的转录阻抑物，且 能够在上皮细胞中诱导EMT(Batlle et al.，Nat.Cell Biol.2：84-89，2000；Bolos et al.，J.Cell Sci.116：499-511，2003；Cano et al.，Nat.Cell Biol.2：76-83，2000； Conacci-Sorrell et al.，J.Cell Biol.163：847-857，2003；Yang et al.，Cell 117：927-939，2004)，所以这些数据提示暴露于β2后对Twist1表达的诱导可能 在所观察到的形态转化中发挥重大作用。

为了进一步调查Twist1在由β2诱导的EMT样形态转化中的作用，使用 siRNA敲低自SW620细胞消减Twist1。然后用条件培养基中的β2ECD处理细 胞(图4D)，并评估肌动蛋白细胞骨架和E-钙粘着蛋白染色。在用非靶向 siRNA处理的对照细胞中，β2处理诱导肌动蛋白细胞骨架重建和E-钙粘着蛋 白丧失，而对照条件培养基对细胞没有效果。然而，在存在对Twist1特异性 的siRNA的情况中，β2不再能够诱导EMT；E-钙粘着蛋白染色仍然呈阳性且 细胞形态是正常的(图4D)。对来自细胞的多个独立视野的E-钙粘着蛋白染 色的定量分析揭示了消减了Twist1的用β2ECD处理的细胞与对照细胞相比 的统计学显著差异(图4E，p为0.001和0.009)。这些数据指示SW620中由β2 诱导的EMT依赖于Twist1的存在。发育中EMT相关转录因子间的对话和合作 已有记载(Aybar et al.，Development 130：483-494，2003；Ganguly et al.， Development 132：3419-3429，2005)，而且虽然在此研究中没有强烈检测到它 们的转录物，但是可能的是转录因子诸如Snail和Slug也能在β2诱导的EMT中 发挥作用，或是在这些细胞中或是在不同的细胞类型中。总之，考虑到β2ECD 处理对Twist1的诱导和由β2诱导的形态转化对Twist1(一种已表征的诱导 EMT的转录因子)的依赖性二者，这些结果强烈支持我们的发现β2确实诱导 EMT的表型数据。

5.在肿瘤细胞中敲低REST导致由β2介导的EMT样形态转化

REST(一种在非神经组织中限制神经元基因表达的负转录调节物)最 近表征为结肠和可能其它癌症中的肿瘤阻抑物(Westbrook et al.，Cell 121：837-848，2005)。II型电压依赖性钠通道及相关蛋白质在神经元中和在发 育中表达，而SCN2A是已鉴定的第一批受REST调节的基因之一。对SCN2B 基因组区(编码β2)的分析揭示了第一内含子中的一簇4个共有REST结合位 点，提示REST可能调节β2表达。我们使用结肠肿瘤细胞系进一步调查了肿 瘤细胞中的β2表达与REST失调之间的可能联系。将细胞系对REST和β2蛋白 质染色，揭示了交互的表达(reciprocal expression)：结肠细胞系SW480、记载 为REST阴性的SW1417(Westbrook et al.，见上文)、及SW1116是β2阳性的， 而在REST阳性系SW620中没有检测到β2(图9、图5A)。DLD-1表达缺少阻 抑物结构域的突变型REST蛋白质(Westbrook et al.，见上文)且β2染色呈阳性 (图9)。这些数据与β2受到REST的转录抑制(直接地或间接地)一致。通 过免疫组织化学对结肠肿瘤中REST和β2蛋白质表达的分析揭示了这种联系 持续存在：我们发现了较早描述的III级腺癌和转移性结肠肿瘤样品中REST 和β染色的交互样式(reciprocal pattern)。在来自41名患者中18名的肿瘤中观察 到点状REST染色(44％；图5A)，而且只在一份肿瘤中有REST和β2染色交 叠(在41例中22例中检测到β2表达)。在62份正常结肠样品中40份中检测到 REST染色(65％)，无一β2呈阳性。这些结果指示表达中的反相关不仅仅是 细胞系现象，而且对于肿瘤组织也如此，支持如下的假设，即人类肿瘤细胞 中REST的丧失会促成β2的表达。

我们进一步调查了REST肿瘤阻抑物和β2之间的生物学相关功能联系的 可能性。为了确定在肿瘤细胞背景中REST的丧失是否能导致β2表达和EMT 诱导，使用RNAi消减了SW620中的REST。SW620显示与SW480相反的REST 和β2染色样式(图5A)，但来自于同一个体的肿瘤。用REST特异性siRNA转 染后5天，免疫印迹分析确认了与用非靶向对照siRNA转染的细胞相比，REST 的实质性降低和β2蛋白质的实质性升高(图5B、C；图13A、B)。在REST 敲低细胞中，与由β2诱导的EMT一致的细胞形态变化(如使用肌动蛋白细胞 骨架的罗丹明-鬼笔环肽染色所显现的)、E-钙粘着蛋白的实质性降低、和对 波形蛋白的诱导是明显的(图5D)。对来自细胞的多个独立视野的E-钙粘着 蛋白染色的定量分析揭示了与用非靶向对照siRNA转染的细胞相比，用REST 特异性siRNA转染的细胞有统计学显著降低(图5E；p为0.001)。总之，这些 数据指示在肿瘤细胞背景中REST的丧失的一个后果是β2的表达和对与EMT 一致的形态变化的诱导。

在证明敲低REST诱导与EMT一致的形态变化和标志物表达后，我们使 用功能阻断性β2单克隆抗体来确定源自REST丧失的EMT的诱导是否主要由 β2表达介导。使用siRNA消减SW620细胞中的REST，并在存在针对β2或无关 靶物(豚草)的抗体的情况中让细胞生长4天。然后将细胞用鬼笔环肽染色 以显现肌动蛋白细胞骨架，或者用抗E-钙粘着蛋白或抗波形蛋白抗体染色。 用抗豚草抗体处理的细胞经历对于由β2诱导的EMT和REST敲低而言典型的 形态变化和E-钙粘着蛋白丧失。然而，消减了REST的、用β2特异性阻断性 单克隆抗体3D1和2E3处理的细胞具有正常形态、强E-钙粘着蛋白表达、和少 或无波形蛋白表达，与对非靶向siRNA对照观察到的相似(图5D)。对来自 细胞的多个独立视野的E-钙粘着蛋白染色的定量分析揭示了与未处理的 siREST或用抗豚草处理的siREST细胞相比，用独立的β2功能阻断性抗体3D1 和2E3每一项处理的siREST细胞中的E-钙粘着蛋白水平有统计学显著升高 (图5E，p分别为0.02和0.01)。这些结果与由REST丧失诱导的、由β2介导的 且确实需要β2胞外表达的EMT样形态转化一致。

6.β2对EMT样形态转化的诱导依赖于刻缺蛋白1

刻缺蛋白信号传导是一种古老的且保守的系统，其在发育中和在成体自 我更新细胞中调节细胞命运(Artavanis-Tsakonas et al.，Science 284：770-776， 1999)。HES1是刻缺蛋白途径信号传导的一种已表征靶物(Jarriault et al.， Nature 377：355-358，1995)，其由于自我介导的负调节而经历转录物表达的振 荡周期(Hirata et al.，Science 298：840-843，2002)。来自β2ECD处理的SW620 细胞的转录物表达数据中早期时间点(6-24小时)的振荡HES1表达(图12A) 提示刻缺蛋白信号传导在由β2诱导的EMT中的作用。转录物分析指示刻缺蛋 白1是在SW620细胞上以显著水平表达的唯一刻缺蛋白家族受体(图11B、C、 D)。为了确定刻缺蛋白1是否是β2ECD在SW620细胞中诱导EMT所需要的， 将细胞用对刻缺蛋白1特异性的siRNA或非靶向对照siRNA处理，用条件培养 基中的β2ECD处理，并分析E-钙粘着蛋白的丧失，作为Twist1活性和EMT的 首要标志。与用对照培养基处理的细胞相比，用非靶向siRNA转染并用β2 ECD处理的细胞展现E-钙粘着蛋白染色丧失，但是刻缺蛋白1消减阻断此形 态转化并导致E-钙粘着蛋白呈阳性的、具有正常肌动蛋白细胞骨架的细胞 (图6A、C)。这些数据指示刻缺蛋白1是β2诱导EMT样形态转化所必需的。

刻缺蛋白信号传导的激活需要ADAM蛋白酶和γ-分泌酶二者切割受体 以释放刻缺蛋白胞内结构域(NICD)。因此我们提问阻止刻缺蛋白信号传导的 γ-分泌酶抑制剂(De Strooper et al.，Nature 398：518-522，1999)是否也会抑制由 β2诱导的EMT。将SW620细胞与DMSO(媒介对照)或DMSO中的500nM特 异性γ-分泌酶抑制剂DAPT(N-[N-(3，5-二氟苯基乙酰基-L-丙氨酸)]-S-苯甘氨 酸叔丁酯)混合，用条件培养基中的β2ECD处理，并分析E-钙粘着蛋白丧失。 与全长β2不同，β2ECD构建物不含已表征的γ-分泌酶切割位点(Kim et al.，J. Biol.Chem.280：23251-23261，2005)，且因此不是DAPT加工的抑制的靶物。 与用对照条件培养基处理的细胞相比，在存在DMSO的情况中用β2ECD处理 的细胞显示典型的E-钙粘着蛋白丧失。然而，在存在DAPT的情况中用β2 ECD处理的细胞仍然E-钙粘着蛋白呈阳性，提示刻缺蛋白1信号传导是β2诱 导EMT所需要的(图6B、C)。siRNA敲低和γ-分泌酶抑制实验二者中对E-钙 粘着蛋白的定量分析确认了刻缺蛋白1遭到消减或刻缺蛋白1信号传导遭到 抑制的、用β2ECD处理的细胞中E-钙粘着蛋白水平的统计学显著差异(图 6C)。

SW620细胞表达刻缺蛋白配体锯齿蛋白1和锯齿蛋白2(图11D)，然而不 经历EMT。考虑到刻缺蛋白信号传导在由β2诱导的EMT中的明显作用，我们 调查了来自锯齿蛋白或德耳塔样家族的刻缺蛋白配体是否诱导EMT。通过外 源添加各种形式的配体锯齿蛋白1或DLL1，包括反式即与表达配体的细胞共 培养或使用板结合的配体，刺激细胞，但是在任何所使用的条件下没有观察 到EMT的证据(数据未显示)。作为阳性对照，表达刻缺蛋白配体的细胞与 用刻缺蛋白1转染的3T3细胞的共培养产生了刻缺蛋白途径信号传导的证据， 如通过来自CSL结合启动子构建物的萤光素酶报告物测定法所测定的(数据 未显示)。然而，在与表达锯齿蛋白1或DLL1的细胞进行的类似共培养测定 法中对SW620的处理未能发生由报告物构建物诱导的EMT样形态变化或显 著活性(数据未显示)。可能的是报告物构建物的灵敏度不足以检测SW620 中的内源刻缺蛋白信号传导，但是尽管有这种考虑，没有证据证明锯齿蛋白 1或DLL1诱导EMT或相关形态变化，提示这些已表征刻缺蛋白配体的表达和 存在在反式情况中在这些细胞中不足以诱导EMT。

7.β2结合刻缺蛋白1并诱导刻缺蛋白胞内结构域(NICD)的核定位

用β2ECD处理细胞在不内源表达β2的细胞(例如SW620)中诱导表型变 化，指示β2经由其起作用的受体不是β2自身。在确立由β2诱导的EMT依赖于 刻缺蛋白1和刻缺蛋白途径信号传导，且观察到早在表型变化出现(24-72小 时)前在6小时时间点对HES1转录物的诱导(图12A)后，我们调查了β2可能 是刻缺蛋白1的配体或结合配偶的可能性。β2(一种Ig结构域蛋白质)不分 享经典刻缺蛋白配体诸如锯齿蛋白-1或2和DLL1的序列特性。然而，两种其 它Ig结构域蛋白质(接触蛋白/F3和NB3)被描述为促成在神经元前体中决定 细胞命运的新的刻缺蛋白配体(Cui et al.，J.Biol.Chem.279：25858-25865， 2004；Hu et al.，Cell 115：163-175，2003)。在考虑刻缺蛋白1作为β2的候选受体 时，预期响应β2ECD而经历形态变化的细胞中会有刻缺蛋白1(或可能的刻 缺蛋白2)表达。转录物分析揭示了β2响应性肿瘤细胞系表达刻缺蛋白1(且 经常还有刻缺蛋白2，图11B、C中的例子)。内皮HUVEC细胞表达刻缺蛋白1 且也响应β2，而不响应β2显示表型变化(图11A)的HEK293细胞不表达刻缺 蛋白1(Hicks et al.，Nat.Cell Biol.2：515-520，2000；Ray et al.，J.Biol.Chem. 274：36801-36807，1999)。这些观察结果与刻缺蛋白1是β2的效应器或受体是 一致的。

为了确定刻缺蛋白1和β2是否能物理结合，我们实施了免疫共沉淀和对 用全长β2转染的SW620细胞的免疫印迹分析，在免疫沉淀中使用抗β2单克隆 抗体或无关对照抗体(抗豚草)。用刻缺蛋白1特异性单克隆抗体进行的免疫 沉淀揭示了抗β2抗体与来自用β2转染的细胞溶胞物的内源刻缺蛋白1共沉 淀。此共沉淀表现为特异性的，因为我们使用对照抗体或使用抗β2抗体及来 自不表达β2的细胞的对照溶胞物没有观察到刻缺蛋白1沉淀(图7A)。

使用C端带组氨酸标签的β2ECD和纯化的含有大部分EGF重复区(重复 6-36)及C端FLAG标签的刻缺蛋白1ECD区调查了β2能直接结合刻缺蛋白1 的可能性。将刻缺蛋白1ECD(0.33μg/ml)与条件培养基中的β2ECD(β2 估算为0.4μg/ml)一起温育，然后使用Ni-NTA珠收集β2蛋白质。或者，使用 Ni-NTA珠自条件培养基富集β2，随后与PBS中的带标签的刻缺蛋白1ECD (3.3μg/ml)一起温育。与含有无关的带组氨酸标签的蛋白质的对照条件培 养基相比，这两种办法都产生β2对带标签的刻缺蛋白1的回收(图7B)。值得 注意的是，β2-刻缺蛋白1结合甚至在这两种蛋白质都为低浓度(大约1nM 刻缺蛋白1ECD和20nM β2ECD，图7B第1道)时和在存在血清、其它由CHO 生成的蛋白质、和条件培养基中存在的降解性酶的情况中也发生。纯化的刻 缺蛋白1ECD作为双重带迁移，可能是由于糖基化或其它修饰(图7B)。然 而，结合β2导致带标签的刻缺蛋白1ECD的单一、清楚限定的带，提示与结 合有关的特异性，或可能的修饰。总之，这些结果支持β2作为刻缺蛋白1的 结合配偶的作用。与其它刻缺蛋白配体相似，我们预计β2也会结合在一些β2 响应性细胞系上高度表达的刻缺蛋白2密切同系物。

为了进一步表征β2和刻缺蛋白1的结合，如上所述将含有带标签的β2 ECD的条件培养基与纯化的含有EGF重复10-21或22-33的刻缺蛋白1ECD片 段一起温育。(锯齿蛋白-1结合刻缺蛋白1的EGF重复11-13，而果蝇德耳塔和 锯齿蛋白结合刻缺蛋白的EGF重复11-12。)这些刻缺蛋白1ECD片段每一项 含有C端FLAG标签以容许用抗FLAG抗体在免疫印迹上检测。β2ECD特异性 结合含有EGF重复10-21的刻缺蛋白1ECD片段，对含有EGF重复22-33的ECD 片段没有可检测的结合(图7C)。这些数据指示β2和刻缺蛋白1的结合是特异 性的，而非经由EGF重复结构的非特异性结合。

配体对刻缺蛋白1的激活导致切割以释放NICD，其移位至核，并与其它 蛋白质协作来直接调节刻缺蛋白靶基因转录。我们分析了是否能响应β2在细 胞中检测到核NICD。因为NICD在历史上难以检测，所以我们在存在蛋白酶 体抑制剂(100um乳胞素)的情况中培养细胞以帮助蛋白质稳定，并使用高 分辨率共聚焦显微术来成像。与用载体转染的对照(其中除1个细胞外，只 观察到细胞质或膜染色)相比，在大多数用β2转染的细胞中检测到核NICD (图7D)。类似地，用条件培养基中的β2ECD处理后6小时在SW620细胞中 检测到核NICD(图7D)，与6小时时在这些细胞中观察到的升高的HES1转录 物一致。这些数据指示β2诱导对刻缺蛋白信号传导途径的激活。

综上所述，我们的数据指示，在作为附属蛋白质或粘着分子的作为之外， β2能诱导与EMT一致的形态转化。此神经元蛋白质在肿瘤中的表达可源自 REST(非神经元组织中神经元基因表达的转录阻抑物)的丧失。此外，由β2 诱导的形态转化依赖于刻缺蛋白(发育、分化和细胞命运的进化保守的主调 节物)(Artavanis-Tsakonas et al.，Science 284：770-776，1999)。在经一种新的刻 缺蛋白结合配偶β2联系REST丧失和刻缺蛋白途径信号传导时，我们描述了 所有三项在肿瘤进展和转移中的作用。

8.抗体交叉阻断实验提示三种不同表位

实施了抗体交叉阻断实验来确定下列抗β2单克隆抗体是结合相同还是 不同表位：3D1、12A9、12E3、2E3、和3G5。在那些实验中，在存在无标 记的“竞争者”抗体的情况中评估了生物素化抗体对β2抗原的结合，如图14 所描绘的。结果指示抗体3D1和12A9结合第一表位(“表位A”)；抗体12E3 结合第二表位(“表位B”)；而抗体2E3和3G5结合第三表位(“表位C”)。

这些保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 (Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自 保藏之日起30年和最近一次请求提供保藏物样品后至少5年保存保藏的存活 培养物。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从 Genentech公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后，保藏 人对公众获取所保藏材料施加的所有限制将不可撤回的取消；保证了在有关 美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居 先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代；而且保证了依 据35U.S.C.§122及依照它的管理章程(包括37C.F.R.§1.14，特别要提及 886OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的 后代。

本申请的受让人已同意，若保藏的培养物在合适条件下培养时死亡、丢 失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的存活样本更换。所 保藏细胞系的可用性并不解释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授 予的权利实践本发明的许可。

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了 上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。在此通过述及而明确 收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。

序列表

<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)

     Hongo，Jo-Anne S.

     Li，Jing

     Smith，Victoria

<120>用于抑制肿瘤进展的组合物和方法

<130>P2478R1

<150>US 60/988,874

<151>2007-11-19

<160>11

<210>1

<211>2556

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro

  1               5                  10                  15

Ala Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr

                 20                  25                  30

Cys Leu Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala

                 35                  40                  45

Cys Val Cys Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Gln Asp Pro

                 50                  55                  60

Asn Pro Cys Leu Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His

                 65                  70                  75

Val Val Asp Arg Arg Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Ala

                 80                  85                  90

Leu Gly Phe Ser Gly Pro Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala

                 95                 100                 105

Cys Leu Thr Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu

                110                 115                 120

Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly

                125                 130                 135

Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys Ala Ser Asn Pro Cys Ala

                140                 145                 150

Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ala Ser Tyr Ile Cys His

                155                 160                 165

Cys Pro Pro Ser Phe His Gly Pro Thr Cys Arg Gln Asp Val Asn

                170                 175                 180

Glu Cys Gly Gln Lys Pro Arg Leu Cys Arg His Gly Gly Thr Cys

                185                 190                 195

His Asn Glu Val Gly Ser Tyr Arg Cys Val Cys Arg Ala Thr His

                200                 205                 210

Thr Gly Pro Asn Cys Glu Arg Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro Ser

                215                 220                 225

Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Val Thr

                230                 235                 240

His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Gln Asn Cys Glu

                245                 250                 255

Glu Asn Ile Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly

                260                 265                 270

Ala Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Pro Cys Pro Pro

                275                 280                 285

Glu Trp Thr Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln

                290                 295                 300

Leu Met Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr

                305                 310                 315

His Gly Gly Tyr Asn Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu

                320                 325                 330

Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cy s Ala Ser Ala Ala Cys Phe

                335                 340                 345

His Gly Ala Thr Cys His Asp Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu

                350                 355                 360

Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu Leu Cys His Leu Asn Asp Ala

                365                 370                 375

Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly Ser Asn Cys Asp Thr Asn

                380                 385                 390

Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys Pro Ser Gly Tyr Thr

                395                 400                 405

Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala

                410                 415                 420

Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser

                425                 430                 435

Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu

                440                 445                 450

Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp Ala

                455                 460                 465

Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Met Cys Met Pro

                470                 475                 480

Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Val Asn Thr Asp Glu Cys Ala

                485                 490                 495

Ser Ser Pro Cys Leu His Asn Gly Arg Cys Leu Asp Lys Ile Asn

                500                 505                 510

Glu Phe Gln Cys Glu Cys Pro Thr Gly Phe Thr Gly His Leu Cys

                515                 520                 525

Gln Tyr Asp Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly

                530                 535                 540

Ala Lys Cys Leu Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr

                545                 550                 555

Glu Gly Tyr Thr Gly Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys

                560                 565                 570

Asp Pro Asp Pro Cys His Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala

                575                 580                 585

Thr Phe Thr Cys Leu Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys

                590                 595                 600

Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ser Ser Gln Pro Cys Arg Leu Arg

                605                 610                 615

Gly Thr Cys Gln Asp Pro Asp Asn Ala Tyr Leu Cys Phe Cys Leu

                620                 625                 630

Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cy s Glu Ile Asn Leu Asp Asp Cys

                635                 640                 645

Ala Ser Ser Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu Asp Lys Ile Asp

                650                 655                 660

Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly Ser Met Cys

                665                 670                 675

Asn Ser Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Asn Pro Cys His Asn Gly

                680                 685                 690

Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Asn Gly Phe Thr Cys Arg Cys Pro

                695                 700                 705

Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys

                710                 715                 720

Asn Ser Asn Pro Cys Val His Gly Ala Cys Arg Asp Ser Leu Asn

                725                 730                 735

Gly Tyr Lys Cys Asp Cys Asp Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys

                740                 745                 750

Asp Ile Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly

                755                 760                 765

Gly Thr Cys Lys Asp Met Thr Ser Gly Ile Val Cys Thr Cys Arg

                770                 775                 780

Glu Gly Phe Ser Gly Pro Asn Cys Gln Thr Asn Ile Asn Glu Cys

                785                 790                 795

Ala Ser Asn Pro Cys Leu Asn Lys Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val

                800                 805                 810

Ala Gly Tyr Lys Cys Asn Cys Leu Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Thr

                815                 820                 825

Cys Glu Val Val Leu Ala Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn

                830                 835                 840

Gly Gly Glu Cys Arg Gln Ser Glu Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Cys

                845                 850                 855

Val Cys Pro Thr Ala Gly Ala Lys Gly Gln Thr Cys Glu Val Asp

                860                 865                 870

Ile Asn Glu Cys Val Leu Ser Pro Cys Arg His Gly Ala Ser Cys

                875                 880                 885

Gln Asn Thr His Gly Gly Tyr Arg Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr

                890                 895                 900

Ser Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asp Ile Asp Asp Cys Arg Pro Asn

                905                 910                 915

Pro Cys His Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Gly Ile Asn Thr Ala

                920                 925                 930

Phe Cys Asp Cys Leu Pro Gly Phe Arg Gly Thr Phe Cys Glu Glu

                935                 940                 945

Asp Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asp Pro Cys Arg Asn Gly Ala Asn

                950                 955                 960

Cys Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Ala Gly

                965                 970                 975

Phe Ser Gly Ile His Cys Glu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Glu

                980                 985                 990

Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser

                995                1000                1005

Phe Thr Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln

               1010                1015                1020

His Val Val Asn Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu Leu Gly Gly

               1025                1030                1035

Thr Cys Gln Asp Gly Arg Gly Leu His Arg Cys Thr Cys Pro Gln

               1040                1045                1050

Gly Tyr Thr Gly Pro Asn Cys Gln Asn Leu Val His Trp Cys Asp

               1055                1060                1065

Ser Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly Lys Cys Trp Gln Thr His Thr

               1070                1075                1080

Gln Tyr Arg Cys Glu Cys Pro Ser Gly Trp Thr Gly Leu Tyr Cys

               1085                1090                1095

Asp Val Pro Ser Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Arg Gln Gly

               1100                1105                1110

Val Asp Val Ala Arg Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp

               1115                1120                1125

Ala Gly Asn Thr His His Cys Arg Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly

               1130                1135                1140

Ser Tyr Cys Glu Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser Pro Cys

               1145                1150                1155

Gln Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser Cys

               1160                1165                1170

Lys Cys Val Ala Gly Tyr His Gly Val Asn Cys Ser Glu Glu Ile

               1175                1180                1185

Asp Glu Cys Leu Ser His Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu

               1190                1195                1200

Asp Leu Pro Asn Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln

               1205                1210                1215

Gly Val His Cys Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys Asn Pro Pro Val

               1220                1225                1230

Asp Pro Val Ser Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys

               1235                1240                1245

Val Asp Gln Val Gly Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe

               1250                1255                1260

Val Gly Glu Arg Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn

               1265                1270                1275

Pro Cys Asp Ala Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn

               1280                1285                1290

Asp Phe His Cys Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys

               1295                1300                1305

Glu Ser Val Ile Asn Gly Cys Lys Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly

               1310                1315                1320

Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys

               1325                1330                1335

Lys Cys Pro Ala Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala

               1340                1345                1350

Arg Thr Cys Gly Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile

               1355                1360                1365

Ser Gly Pro Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Pro Phe Thr

               1370                1375                1380

Gly Pro Glu Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Gly Gly

               1385                1390                1395

Asn Pro Cys Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Ser

               1400                1405                1410

Pro Phe Tyr Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu

               1415                1420                1425

Cys His Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp

               1430                1435                1440

Ile Pro Pro Pro Leu Ile Gl u Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys

               1445                1450                1455

Gln Glu Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn

               1460                1465                1470

His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn

               1475                1480                1485

Asp Pro Trp Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr

               1490                1495                1500

Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys

               1505                1510                1515

Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn

               1520                1525                1530

Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His

               1535                1540                1545

Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu

               1550                1555                1560

Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu

               1565                1570                1575

Val Val Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser

               1580                1585                1590

Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val

               1595                1600                1605

Val Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr

               1610                1615                1620

Tyr Gly Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala

               1625                1630                1635

Ala Glu Gly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys

               1640                1645                1650

Ala Ser Leu Leu Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg

               1655                1660                1665

Glu Leu Asp Pro Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu

               1670                1675                1680

Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln

               1685                1690                1695

Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu

               1700                1705                1710

Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu

               1715                1720                1725

Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Ala Gln Leu His Phe Met Tyr Val

               1730                1735                1740

Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val

               1745                1750                1755

Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe

               1760                1765                1770

Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg

               1775                1780                1785

Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn

               1790                1795                1800

Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly

               1805                1810                1815

Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val

               1820                1825                1830

Val Leu Pro Asp Leu Asp Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr

               1835                1840                1845

Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala

               1850                1855                1860

Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val

               1865                1870                1875

Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala Ser

               1880                1885                1890

Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu

               1895                1900                1905

Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser

               1910                1915                1920

Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu

               1925                1930                1935

Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu

               1940                1945                1950

Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro

               1955                1960                1965

Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile

               1970                1975                1980

Leu Ile Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp

               1985                1990                1995

Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly

               2000                2005                2010

Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val

               2015                2020                2025

Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn

               2030                2035                2040

Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys

               2045                2050                2055

Asp Met Gln Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala

               2060                2065                2070

Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe

               2075                2080                2085

Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp

               2090                2095                2100

Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp

               2105                2110                2115

Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro Leu

               2120                2125                2130

Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly

               2135                2140                2145

Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg

               2150                2155                2160

Lys Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys

               2165                2170                2175

Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys

               2180                2185                2190

Leu Leu Asp Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu

               2195                2200                2205

Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu

               2210                2215                2220

Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu

               2225                2230                2235

Pro Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val

               2240                2245                2250

Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu

               2255                2260                2265

Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala

               2270                2275                2280

Ser Gly Thr Ser Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu

               2285                2290                2295

Asn Phe Thr Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu

               2300                2305                2310

Trp Leu Ser Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn

               2315                2320                2325

Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala

               2330                2335                2340

Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser Ser Leu

               2345                2350                2355

Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu Pro

               2360                2365                2370

Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln

               2375                2380                2385

Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro

               2390                2395                2400

Ala Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro

               2405                2410                2415

Pro Gln Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu

               2420                2425                2430

Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val Gln

               2435                2440                2445

Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln

               2450                2455                2460

Glu Ser Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro

               2465                2470                2475

Pro Val Thr Ala Ala Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser

               2480                2485                2490

Tyr Ser Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val

               2495                2500                2505

Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln

               2510                2515                2520

Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn Val Ser Asp Trp Ser Glu

               2525                2530                2535

Gly Val Ser Ser Pro Pro Thr Ser Met Gln Ser Gln Ile Ala Arg

               2540                2545                2550

Ile Pro Glu Ala Phe Lys

               2555

<210>2

<211>215

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met His Arg Asp Ala Trp Leu Pro Arg Pro Ala Phe Ser Leu Thr

  1               5                  10                  15

Gly Leu Ser Leu Phe Phe Ser Leu Val Pro Pro Gly Arg Ser Met

                 20                  25                  30

Glu Val Thr Val Pro Ala Thr Leu Asn Val Leu Asn Gly Ser Asp

                 35                  40                  45

Ala Arg Leu Pro Cys Thr Phe Asn Ser Cys Tyr Thr Val Asn His

                 50                  55                  60

Lys Gln Phe Ser Leu Asn Trp Thr Tyr Gln Glu Cys Asn Asn Cys

                 65                  70                  75

Ser Glu Glu Met Phe Leu Gln Phe Arg Met Lys Ile Ile Asn Leu

                 80                  85                  90

Lys Leu Glu Arg Phe Gln Asp Arg Val Glu Phe Ser Gly Asn Pro

                 95                 100                 105

Ser Lys Tyr Asp Val Ser Val Met Leu Arg Asn Val Gln Pro Glu

                110                 115                 120

Asp Glu Gly Ile Tyr Asn Cys Tyr Ile Met Asn Pro Pro Asp Arg

                125                 130                 135

His Arg Gly His Gly Lys Ile His Leu Gln Val Leu Met Glu Glu

                140                 145                 150

Pro Pro Glu Arg Asp Ser Thr Val Ala Val Ile Val Gly Ala Ser

                155                 160                 165

Val Gly Gly Phe Leu Ala Val Val Ile Leu Val Leu Met Val Val

                170                 175                 180

Lys Cys Val Arg Arg Lys Lys Glu Gln Lys Leu Ser Thr Asp Asp

                185                 190                 195

Leu Lys Thr Glu Glu Glu Gly Lys Thr Asp Gly Glu Gly Asn Pro

                200                 205                 210

Asp Asp Gly Ala Lys

                215

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>3

caacgaaucu acccauauuu u 21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>4

gcgacgagcu ggacuccaau u 21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>5

gcgacaaggu guugacguuu u 21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>6

cugcagacgc agcgggucau u 21

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>7

ggaguccgca gucuuacgau u 21

<210>8

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>8

gagcaagauu cagacccucu u 21

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>9

gaugcgagau cgacgucaau u 21

<210>10

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>10

gaacggggcu aacaaagauu u 21

<210>11

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列是合成的

<400>11

gcaaggacca cuucagcgau u 21