技术领域
本发明具体涉及一种共轭聚合物、合成方法及用其检测依替米星浓度的方法。
背景技术
依替米星（Etimicin，ETM）是我国自行研制的抗感染新药（Chin.J.Antibiot.,1995,20:401-406），广泛的药理、毒理、药效学研究和临床研究表明：ETM是一种毒性低、疗效确切的新氨基糖苷类抗生素。依替米星在青少年、儿童敏感菌引起的痢疾、腹膜炎、肠炎等肠道感染性疾病、手术前清洗肠腔、幽门螺旋杆菌相关的胃炎药物中的应用中，有着极佳的疗效（CN106491515A 、CN106727294A）。该药具有高效、安全、光谱、抗菌、耐药性的等特点，不良反应低，抗交叉耐药性好（J. Pharm. Biomed. Anal., 2012, 70, 212-223、Hum. Exp. Toxicol., 2015, 34(5), 479-486）。由于依替米星没有近紫外吸收，其测定方法主要有微生物法、液相色谱-质谱、HPLC法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）等，但是，这些方法操作较为繁琐、费时（分析试验室, 2011, 30 (9): 22-25、Anal. Methods, 2017, 9, 3845-3851）。
荧光、比色检测具有简单、快速、灵敏、无需标记等特点，其应用已引起了人们的极大兴趣（CN106496197A、CN103323440A、CN106770103A）。而共轭聚合物是一类新型的高灵敏荧光传感检测平台，已有专利报道用于氟离子（CN105295009A）、铜离子（CN101824139A）、ATP（CN105348493A）和BSA（CN103588960A）等生物分子及细胞（CN105348493A）等的检测。然而，现有用于荧光、比色法检测依替米星的共轭聚合物及检测方法上尚属空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种含吡啶和磺酸盐基团的共轭聚合物。
本发明进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种操作简单、成本低、适宜于工业化生产的共轭聚合物的合成方法。
本发明更进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种简单易行，检测准确、迅速、高灵敏，最低检测限为8nmol/L，且检测线性良好，选择性好的检测依替米星浓度的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种共轭聚合物，所述共轭聚合物的化学结构通式为：
，
其中，n=100～150。
所述共轭聚合物的特点为：带有含吡啶和磺酸根基团，可以非共价的方式吸附于银纳米粒子表面，以实现荧光、比色检测；且由于共轭聚合物侧链上引入了亲水性的磺酸基团，它能很好地溶于水以及甲醇等有机溶剂，这种简单的纳米复合材料可以用来构建对依替米星高灵敏、高选择性的检测。通过粘度法测得所述共轭聚合物的分子量为52000～78000g/mol。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是：一种共轭聚合物的合成方法，包括以下步骤：
（1）将水、二甲基甲酰胺和二异丙胺的混合溶液，在惰性气氛保护下，加入2,6-二乙炔基吡啶、1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯与催化剂的混合物中，加热反应，冷却至室温，过滤，用水洗涤所得固体，得共轭聚合物，并将滤液旋转浓缩，得浓缩液；
（2）将步骤（1）所得浓缩液加入到搅拌的有机混合溶剂中沉淀，离心，所得固体先用甲醇溶解，再加入有机混合溶剂中沉降≥2次，得共轭聚合物。
本发明合成方法的原理是：聚合物在无氧条件下通过催化Sonogashira缩聚反应得到。
优选地，步骤（1）中，所述水、二甲基甲酰胺和二异丙胺的混合溶液与2,6-二炔基吡啶、1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯与催化剂的混合物的质量比为50～150:1（更优选70～120:1）。
优选地，步骤（1）中，所述水、二甲基甲酰胺和二异丙胺的质量比为1～3.5:2.5～5.0:1（更优选2～3:3.0～4.5:1）。在所述比例下，更有利于水溶性聚合物的形成。
优选地，步骤（1）中，所述2,6-二炔基吡啶、1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯与催化剂的质量比为0.6～1.0:4～6:1。通过调节2,6-二炔基吡啶与1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯的摩尔比可实现共轭聚合物中吡啶环的含量变化，摩尔比越相近聚合物含吡啶环数目越高，合适的吡啶环的引入，能有效的改善共轭主链的刚性，提高检测的灵敏度，使共轭聚合物具有更优异的性能。
优选地，步骤（1）中，所述催化剂为四三苯基膦钯和碘化亚铜质量比为5～7:1的混合物。
所述四三苯基膦钯的合成方法是：将PdCl2、三苯基膦和二甲基亚砜以质量比1:5～10:50～150（更优选1:6～8:80～120）混合，在氮气保护下，搅拌升温至140～160 ℃，保温反应12～18 min后，溶液颜色由黄色变红，再以速度0.5～1.5 mL/min，以水合肼与二甲基亚砜的质量比为1:60～100（更优选1:70～90）滴入水合肼，静置，冷却，过滤，滤渣用乙醇抽洗≥4次，乙醚洗涤≥2次，即成。
所述2,6-二乙炔基吡啶的合成方法是：将所述四三苯基膦钯、CuI和2,6-二溴吡啶以质量比5～10:1:20～50混合，在氮气保护下，以上述混合原料与甲苯-二异丙胺混合溶液的质量比为1:6～18（更优选1:8～12），加入甲苯:二异丙胺的体积比为3～5:1的甲苯-二异丙胺混合溶液，然后以0.5～1.0mL/min的速度，甲苯-二异丙胺混合溶液与三甲基硅基乙炔的质量比为10～15:1，加入三甲基硅基乙炔，常温下反应10～15 h后，过滤除去不溶物，再以石油醚:二氯甲烷的体积比为4～6:1的混合溶液作为展开剂，用硅胶柱层析提纯过柱分离，得纯中间产品，再在常温下，将纯中间产品以质量体积比（g/mL）1:10～30溶解在四氢呋喃:甲醇的体积比为1:0.8～1.2的混合溶剂中，混合溶剂与K2CO3的质量比为1～10:1加入K2CO3，室温下搅拌10～15 h，过滤，滤液浓缩，再以石油醚:二氯甲烷的体积比为1～2:1的混合溶液作为展开剂，用硅胶柱层析提纯过柱分离，即成。
所述1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯的合成方法是：在容器中，先以质量比3～5:2～3:1依次加入1,4-二（丙氧基磺酸钠）苯、I2、KIO3，再以体积比10～15:8～12:1依次加入冰醋酸、水和浓硫酸，1,4-二（丙氧基磺酸钠）苯、I2、KIO3质量之和与冰醋酸、水和浓硫酸体积之和的质量体积比（g/mL）为1:5～8，混合均匀后，在50～70℃下恒温回流10～15h后，冰浴冷却，过滤沉淀后，用乙醇和冷水先后交叉冲洗，得白色粉末产物。其中，1,4-二（丙氧基磺酸钠）苯的合成方法是：在质量浓度为8～12%的NaOH溶液中，通入氮气除氧后，以NaOH与对苯二酚的摩尔比为2～3:1，加入对苯二酚，在氮气保护下，以1,3-丙烷磺酸内酯与对苯二酚的摩尔比为2～3:1，迅速加入1,3-丙烷磺酸内酯与二噁烷质量体积比（g/mL）为0.1～0.2:1的混合溶液，在室温下搅拌3～5h后，形成白色粘稠的浆液，冰浴冷却，真空过滤，用乙醇和丙酮先后交叉冲洗，得白色粉末产物。
优选地，步骤（1）中，所述加热反应的温度为60～70℃，时间为12～36h。若温度过高或时间过长，则难以得到合适分子量大小的共轭聚合物。
优选地，步骤（1）中，所述旋转浓缩的温度为50～70℃，时间为8～12h，浓缩至粘稠状。
优选地，步骤（1）中，所述惰性气氛为氮气。本发明所使用的惰性气氛纯度≥99.9%。
优选地，步骤（2）中，所述浓缩液与有机混合溶剂的体积比为0.05～0.10:1。
优选地，步骤（2）中，所述搅拌的速度为50～65r/min。转速过快或过慢均不利于充分反应。
优选地，步骤（2）中，所述有机溶剂为丙酮和乙醚体积比为1～2:1的混合溶剂。使用丙酮-乙醚混合液溶解杂质，更有利于共轭聚合物的分离。
优选地，步骤（2）中，所述固体与甲醇的质量体积比（g/mL）为0.01～0.10:1（更优选0.02～0.06:1）。由于甲醇极性较大，目标产物可以更好的溶于甲醇中。
优选地，步骤（2）中，沉降时，溶有固体的甲醇与有机混合溶剂的体积比为1～2:1。沉降目的是提高共轭聚合物的收率。
步骤（2）对浓缩液进行进一步的处理，可以提高共轭聚合物的产率。
本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测依替米星浓度的方法，包括以下步骤：
（1）将所述共轭聚合物的水溶液、纳米银溶液加入到缓冲液中，搅拌反应后，静置，得均一体系，测定其荧光强度F0；
（2）在步骤（1）所得均一体系中，加入含有待测依替米星的溶液，搅拌反应后，静置，测定其荧光强度F或650nm时的吸光度A650和393nm时的吸光度A393；
（3）用荧光法检测依替米星时，计算Y=（F0-F）/F0，当依替米星的摩尔浓度为8.0×10-9～2.0×10-7mol/L时，由表达依替米星与荧光强度之间关系的公式Y= 0.595+0.0518*logC依替米星，R=0.997，计算C依替米星；当依替米星的摩尔浓度为＞2.0×10-7～5.0×10-6mol/L时，由表达依替米星与荧光强度之间关系的公式Y = 2.04+ 0.267*logC依替米星，R = 0.996，计算C依替米星；
用比色法检测依替米星时，计算Y=A650/A393，当依替米星的浓度为2.0×10-7～7.0×10-7时，由表达依替米星与吸光度之间关系的公式Y=-0.0623+328000*C依替米星，R=0.992，计算C依替米星。
本发明荧光法检测的基本思路是：在加入依替米星之前测得共轭聚合物-银纳米体系的荧光强度，加入依替米星后，该体系中的荧光被猝灭，通过检测荧光的变化，再通过测试不同依替米星浓度下的荧光强度值，得到表达依替米星与荧光强度之间关系的公式，最终计算出依替米星浓度。
本发明荧光法检测的机理如下所示：
由上可知，本发明共轭聚合物兼具优良光电性质和水溶性，共轭聚合物中含有吡啶基团，基于吡啶基团强的给电子能力，可以提高检测的灵敏性，银纳米粒子具有良好的消光系数，共轭聚合物对银纳米粒子有很好的分散作用，且能够和银纳米粒子形成新型银纳米复合物，将依替米星加入到含共轭聚合物-银的缓冲溶液后，由于依替米星含有五个碱性氮原子和三个羟基，依替米星的氨基通过静电作用可以吸附在银纳米粒子的表面，通过静电作用并伴随着氢键的作用诱导了银纳米粒子的团聚，导致银纳米复合物在488 nm处荧光的猝灭，溶液颜色由黄色变为蓝色，从而实现依替米星的比色检测和可视化检测。
本发明比色法检测的基本思路是：由于加入依替米星后导致共轭聚合物-银纳米粒子的团聚，引起了在393nm处的吸收强度逐渐降低，同时在长波方向650nm处出现新的吸收峰，其强度逐渐增强，从而实现依替米星的比色检测和可视化检测。
优选地，步骤（1）中，所述共轭聚合物与纳米银的摩尔比为1:3～7。由于纳米银材料对共轭聚合物有一定的猝灭作用，当加入的共轭聚合物与纳米银的比值≥1时，效果更佳。
优选地，步骤（1）中，所述共轭聚合物的水溶液和纳米银溶液之和与缓冲液的体积比为1:0.5～1.0。缓冲液的体积达到所配均一体系总体积一半以上更能保证缓冲体系的有效性。
优选地，步骤（1）中，所述缓冲液为pH值为6.5～8.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或pH值为8.5～9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
优选地，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液是由0.15～0.25mol/L的磷酸氢二钠溶液与0.05～0.15mol/L的柠檬酸溶液，以体积比为3～40:1配制而成。
优选地，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液是由0.05～0.15mol/L的碳酸钠溶液与0.05～0.15mol/L的碳酸氢钠溶液，以体积比为1:5～7配制而成。
优选地，步骤（1）中，所述纳米银溶液为银纳米粒子溶液，银纳米粒子的粒径为10～15nm。
优选地，步骤（1）中，所述银纳米粒子溶液的制备方法为：将硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液同时加入水中，搅拌混匀，再一次性加入新配制的硼氢化钠溶液，继续搅拌，即成。
优选地，所述硝酸银溶液、柠檬酸钠溶液与水的体积比为0.01～0.015:0.002～0.004:1。
优选地，所述硼氢化钠溶液与水的体积比为0.008～0.010:1。
优选地，所述硝酸银溶液的摩尔浓度为0.01～0.03mol/L。
优选地，所述柠檬酸钠溶液的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。
优选地，所述硼氢化钠溶液的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。
优选地，加入硼氢化钠溶液后继续搅拌的时间为20～40min。
优选地，步骤（1）中，所述搅拌反应的时间为15～25 min。
优选地，步骤（1）中，所述静置的时间为10～30min。
优选地，步骤（2）中，所述搅拌反应的时间为15～30 min。
优选地，步骤（2）中，所述静置的时间为10～30min。
步骤（3）中，荧光检测法采用了两个方程式，分别用于依替米星低浓度和高浓度下更准确的检测，这是因为随着浓度的不断增加，在488 nm处的荧光逐渐下降，（F0-F）/F0的比值在依替米星浓度较低时，变化比较缓慢，而在浓度较高时，则变化快速，因而具有两段线性范围。
本发明中，将共轭聚合物简称为P2，依替米星简称为etimicin，银纳米离子简称为AgNPs。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明共轭聚合物含带有含吡啶和磺酸根基团，可以非共价的方式吸附于银纳米粒子表面，以实现荧光、比色检测；且由于共轭聚合物侧链上引入了亲水性的磺酸基团，它能很好地溶于水以及甲醇等有机溶剂；分子量是52000～78000g/mol；
（2）本发明合成方法操作简单、成本低、适宜于工业化生产；
（3）本发明检测方法巧妙地将共轭聚合物与银纳米粒子结合，构成新的纳米复合体系，明显提高了依替米星检测的灵敏性，简单易行，检测准确、迅速、高灵敏，检测线性良好，选择性好，在最优条件下，荧光检测法的检测限为8nmol/L，比色检测法的检测限为100 nmol/L。
附图说明
图1是本发明参考例1单分散银纳米粒子体系的TEM图；
图2是本发明参考例1单分散银纳米粒子体系的粒径分布图；
图3是本发明实施例1-4 步骤（1）中P2-AgNPs的TEM图；
图4是本发明实施例1-4步骤（2）中加入依替米星后的P2-AgNPs的TEM图；
图5是本发明实施例1-4共轭聚合物-银纳米粒子体系（pH=8.0）荧光法检测对不同离子的选择性响应柱状图；
图6是本发明实施例1-4共轭聚合物-银纳米粒子体系对不同浓度依替米星的荧光响应图；
图7是本发明实施例1-4共轭聚合物-银纳米粒子体系对不同浓度依替米星的荧光响应线性图（图中，C依替米星表示依替米星在步骤（2）所得混合溶液中的浓度）；
图8是共轭聚合物-银纳米粒子体系中不同纳米银溶液的浓度对依替米星的荧光响应图（本发明实施例1-1～1-5为从左至右第5～9点；图中，CAgNPs表示步骤（1）加入的纳米银溶液的浓度）；
图9是共轭聚合物-银纳米粒子体系中缓冲液不同pH值对依替米星的荧光响应图（本发明实施例2-1～2-3为从左至右第5～7点）；
图10是共轭聚合物-银纳米粒子体系中反应时间对依替米星的荧光响应图（本发明实施例3-1～3-4为从左至右第8～11点）；
图11是共轭聚合物-银纳米粒子体系中不同纳米银溶液的浓度对依替米星的荧光响应图（本发明实施例4-1～4-5为从左至右第5～9点；图中，CAgNPs表示步骤（1）加入的纳米银溶液的浓度）；
图12为本发明实施例5共轭聚合物-银纳米粒子体系中比色法检测对不同离子的选择性响应柱状图；
图13是本发明实施例5共轭聚合物-银纳米粒子体系中对不同浓度依替米星的紫外-可见光谱图；
图14是本发明实施例5共轭聚合物-银纳米粒子体系中A650/A393与依替米星浓度的线性关系图（图中，C依替米星表示依替米星在步骤（2）所得混合溶液中的浓度）。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的氮气为纯度≥99.9%的高纯氮气；本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
四三苯基膦钯的合成方法参考例1
将0.8867 g（5 mmol）PdCl2、6.5573 g（25 mmol）三苯基膦和80 mL（88 g）二甲基亚砜混合，在氮气保护下，搅拌升温至150 ℃，保温反应15min后，溶液颜色由黄色变红，再以速度1.0 mL/min，滴入0.97 mL（20 mmol，1g）水合肼，静置，冷却，过滤，滤渣用乙醇抽洗5次，乙醚洗涤3次，即成。
二乙炔基吡啶的合成方法参考例2
将参考例1所得0.462 g（0.4 mmol）四三苯基膦钯、0.076 g（0.4 mmol）CuI和1.90 g（8 mmol）2,6-二溴吡啶混合，在氮气保护下，加入30 mL甲苯-二异丙胺混合溶液（甲苯:二异丙胺的体积比为4:1，总质量22.4g），然后以0.8mL/min的速度，加入2.2 mL（1.529g）三甲基硅基乙炔，常温下反应12h后，过滤除去不溶物，再以石油醚:二氯甲烷的体积比为5:1的混合溶液作为展开剂，用硅胶柱层析提纯过柱分离，得1.7g纯中间产品，再在常温下，将纯中间产品溶解在36mL四氢呋喃:甲醇的体积比为1:1的混合溶剂中，加入7.08 g K2CO3，室温下搅拌12h，过滤，滤液浓缩，再以石油醚:二氯甲烷的体积比为1.5:1的混合溶液作为展开剂，用硅胶柱层析提纯过柱分离，即成。
二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯的合成方法参考例3
在三颈瓶中，依次加入1.58 g 1,4-二（丙氧基磺酸钠）苯、1.01 g I2、0.41g KIO3、10 mL冰醋酸、7.5 mL水和0.75 mL浓硫酸，混合均匀后，在60℃下恒温回流12h后，冰浴冷却，过滤沉淀后，用乙醇和冷水先后交叉冲洗，得白色粉末产物。其中，1,4-二（丙氧基磺酸钠）苯的合成方法是：在25mL质量浓度为8%的NaOH（50mmol）溶液中，通入氮气除氧后，加入2.21 g（20 mmol）对苯二酚，在氮气保护下，迅速加入含有6.21g（50 mmol）1,3-丙烷磺酸内酯和40mL二噁烷的混合溶液，在室温下搅拌4h后，形成白色粘稠的浆液，冰浴冷却，真空过滤，用乙醇和丙酮先后交叉冲洗，得白色粉末产物。
银纳米粒子溶液的制备方法参考例4
将1.2 mL 0.02 mol/L的硝酸银溶液和0.32 mL 0.25mol/L的柠檬酸钠溶液同时加入100mL水中，搅拌混匀，再一次性加入新配制的0.96mL 0.25mol/L硼氢化钠溶液，继续搅拌30min，即成。
如图1所示，本参考例所得银纳米粒子溶液中，含有均一分散的的银纳米粒子，粒径为10～15nm。
如图2所示，通过粒子直径分布的分析，本参考例所得银纳米粒子溶液中，银纳米粒子的粒径主要分布于10～15nm，与图1一致。
如图3所示，在银纳米粒子溶液中加入共轭聚合物后形成了银纳米复合物。
如图4所示，在银纳米复合物中，进一步加入依替米星后，由于依替米星所含的氨基能够与银纳米静电作用结合，并且伴随着氢键的作用，使得银纳米发生团聚。
如图5所示，考察了荧光检测依替米星的选择性，发现相对于其它12种干扰物质，只有加入依替米星后，荧光强度比值F/F0才出现明显的下降，而其它干扰物质基本没有太大的变化，这表明P2-AgNPs纳米复合体系对依替米星的检测具有高选择性。
缓冲液的制备方法参考例5
将16.47 mL，0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液与3.53 mL，0.1mol/L的柠檬酸溶液混合，得pH=7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1；
将19.45 mL，0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液与0.55 mL，0.1mol/L的柠檬酸溶液混合，得pH=8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2。
将1.4 mL的碳酸钠溶液与8.6 mL的碳酸氢钠溶液混合，得pH=9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液1。
实施例1
共轭聚合物：
其化学结构通式为：
，
其中，n=100～150，分子量为52000～78000g/mol。
共轭聚合物的合成方法：
（1）将5mL水、7.5mL（7.11g）二甲基甲酰胺和2.5mL（1.79g）二异丙胺的混合溶液，在氮气气氛保护下，加入0.025g参考例2所得2,6-二乙炔基吡啶，0.131g参考例3所得1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯与0.03g催化剂（参考例1所得四三苯基膦钯和碘化亚铜质量比为6:1的混合物）的混合物中，在65℃下，加热反应30h，冷却至室温，过滤，用水洗涤所得固体，得共轭聚合物1，并在60℃下，将滤液旋转浓缩10h，至粘稠状，得0.2mL浓缩液；
（2）将步骤（1）所得0.2mL浓缩液加入到以速度60r/min搅拌的4mL有机混合溶剂（丙酮和乙醚体积比为1.5:1的混合溶剂）中沉淀，离心，所得0.20g固体先用4mL甲醇溶解，再加入3mL有机混合溶剂（丙酮和乙醚体积比为1.5:1的混合溶剂）中沉降2次，得共轭聚合物1。
实施例2
共轭聚合物：
，
其中，n=100～110，分子量为52000～57000g/mol。
共轭聚合物的合成方法:
（1）将4mL水、6mL（5.69g）二甲基甲酰胺和2mL（1.52g）二异丙胺的混合溶液，在氮气气氛保护下，加入0.015g 参考例2所得2,6-二乙炔基吡啶、0.08g参考例3所得1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯与0.018g催化剂（参考例1所得四三苯基膦钯和碘化亚铜质量比为5:1的混合物）的混合物中，在60℃下，加热反应36h，冷却至室温，过滤，用水洗涤固体，得共轭聚合物2，并在70℃下，将滤液旋转浓缩8h，至粘稠状，0.3mL得浓缩液；
（2）将步骤（1）所得0.3mL浓缩液加入到以速度55r/min搅拌的4mL有机混合溶剂（丙酮和乙醚体积比为1:1的混合溶剂）中沉淀，离心，所得0.18g固体先用4mL甲醇溶解，再加入2mL有机混合溶剂（丙酮和乙醚体积比为1:1的混合溶剂）中沉降2次，得共轭聚合物2。
实施例3
共轭聚合物：
，
其中，n=100～135，分子量为52000～70000g/mol。
共轭聚合物的合成方法:
（1）将4.5mL水、6.7mL（6.35g）二甲基甲酰胺和2mL（1.52g）二异丙胺的混合溶液，在氮气气氛保护下，加入0.020g 参考例2所得2,6-二乙炔基吡啶、0.104g参考例3所得1,4-二碘代-2,5-二丙氧基磺酸钠苯与0.024g催化剂（参考例1所得四三苯基膦钯和碘化亚铜质量比为7:1的混合物）的混合物中，在70℃下，加热反应20h，冷却至室温，过滤，用水洗涤固体，得共轭聚合物3，并在50℃下，将滤液旋转浓缩12h，至粘稠状，得0.4mL浓缩液；
（2）将步骤（1）所得0.4mL浓缩液加入到以速度65r/min搅拌的4mL有机混合溶剂（丙酮和乙醚体积比为2:1的混合溶剂）中沉淀，离心，所得0.15g固体先用4mL甲醇溶解，再加入2mL有机混合溶剂（丙酮和乙醚体积比为2:1的混合溶剂）中沉降2次，得共轭聚合物3。
用共轭聚合物检测依替米星的方法实施例1-1～1-5
（1）将10μL，1×10-3 mol/L的共轭聚合物1的水溶液，分别与500μL，参考例4所得银纳米粒子溶液配制的摩尔浓度分别为0.72×10-4 mol/L、0.84×10-4 mol/L、1.08×10-4 mol/L、1.2×10-4 mol/L、1.32×10-4 mol/L的纳米银溶液，加入到500μL参考例5所得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2（pH=8）中，搅拌反应20min后，静置15min，分别得均一体系1-1～1-5，分别测定其荧光强度F0；
（2）分别在步骤（1）所得均一体系1-1～1-5中，加入含有待测依替米星的溶液（理论浓度为1×10-6 mol/L），搅拌反应20min后，静置15min，分别测定其荧光强度F；
（3）分别计算Y=（F0-F）/F0=0.441，0.446，0.463，0.479，0.454，由表达依替米星与荧光强度之间关系的公式Y= 2.04+ 0.267*logC依替米星，R=0.996，分别计算C依替米星=1.03×10-6mol/L，1.07×10-6 mol/L，1.24×10-6 mol/L，1.42×10-6 mol/L，1.15×10-6mol/L。
如图3、4所示，通过比较本发明实施例1-4步骤（1）所得混合溶液（即共轭聚合物-银纳米粒子体系，下同）中，单分散的共轭聚合物-银纳米粒子加入依替米星前后的电镜图发现，加入依替米星后，共轭聚合物-银纳米粒子体系被氧化刻蚀，进而使得共轭聚合物的荧光发生猝灭，以此达到检测依替米星的目的。
如图5所示，不同粒子对于本发明实施例1-4步骤（1）所得混合溶液具有不同的响应，但只有加入依替米星，荧光强度比值F/F0才出现明显的下降，而其它干扰物基本没有太大的变化，说明本发明方法步骤（1）所得混合溶液对于依替米星有良好的选择性。
如图6所示，说明本发明实施例1-4步骤（1）所得混合溶液对不同浓度依替米星的荧光具有较为明显的响应区别。
如图7所示，为本发明实施例1-4步骤（1）所得混合溶液对不同浓度依替米星（8.0×10-9 mol/L，1.0×10-8 mol/L，2.0×10-8 mol/L，4.0×10-8 mol/L，6.0×10-8 mol/L，8.0×10-8 mol/L，1.0×10-7 mol/L，2.0×10-7 mol/L，3.0×10-7 mol/L，4.0×10-7 mol/L，5.0×10-7 mol/L，6.0×10-7 mol/L，1.0×10-6 mol/L和5.0×10-6mol/L）的荧光响应线性图，当依替米星的摩尔浓度为8.0×10-9～2.0×10-7 mol/L，2.0×10-7～5.0×10-6mol/L时，（F0-F）/F0与logC依替米星呈两段良好的线性关系，并以此作为步骤（3）的计算公式，计算含依替米星溶液的未知浓度。此方法的检出限为8nmol/L。
随着浓度的不断增加，在488 nm处的荧光逐渐下降，（F0-F）/F0的比值在依替米星浓度较低（8.0×10-9～2.0×10-7mol/L）时，团聚程度很小，P2 的荧光猝灭较慢，（F0-F）/F0的比值变化比较缓慢，而在浓度较高（＞2.0×10-7～5.0×10-6mol/L）时，团聚程度很大，P2 的荧光猝灭较快，（F0-F）/F0的比值变化快速，因而具有两段线性范围。
如图8所示，为本发明实施例1-1～1-5步骤（3）所得Y=（F0-F）/F0的曲线图（从左至右第5～9点），由此可知，在所述银纳米粒子在体系中的浓度范围内，随着银纳米粒子浓度的增加，（F0-F）/F0值先增大后减小，当银纳米粒子浓度为1.2×10-4 mol/L时，（F0-F）/F0值最大，荧光猝灭率最大，因此选择该浓度为最佳浓度。
用共轭聚合物检测依替米星的方法实施例2-1～2-3
（1）将10μL，1×10-3 mol/L的共轭聚合物1的水溶液和500μL，参考例4所得银纳米粒子溶液配制的摩尔浓度为1.2×10-4 mol/L的纳米银溶液，分别加入到500μL参考例5所得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1（pH=7）、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2（pH=8）、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液1（pH=9）中，搅拌反应15min后，静置30min，分别得均一体系2-1～2-3，分别测定其荧光强度F0；
（2）分别在步骤（1）所得均一体系2-1～2-3中，加入含有待测依替米星的溶液（理论浓度为8.0×10-7 mol/L），搅拌反应20min后，静置25min，分别测定其荧光强度F；
（3）分别计算Y=（F0-F）/F0=0.409，0.417，0.406，由表达依替米星与荧光强度之间关系的公式Y = 2.04+ 0.267*logC依替米星，R = 0.996，分别计算C依替米星得7.8×10-7 mol/L，8.3×10-7 mol/L，7.6×10-7 mol/L。
如图9所示，为本发明实施例2-1～2-3步骤（3）所得Y=（F0-F）/F0的曲线图（从左至右第5～7点），由此可知，在所述pH值范围内，随着pH值的增加，（F0-F）/F0值先增大后减小，pH值为8时，（F0-F）/F0值最大，荧光猝灭率最大，因此选择pH值=8为最佳。原因是：当pH值较低时，共轭聚合物中的吡啶官能团容易质子化，质子化的吡啶基团容易和相邻的磺酸基团结合，导致共轭聚合物的团聚，而且pH值较低，银纳米粒子表面带负电荷数减少，破坏了静电平衡，会使得银纳米粒子发生团聚。
用共轭聚合物检测依替米星的方法实施例3-1～3-4
（1）将10μL，1×10-3 mol/L的共轭聚合物1的水溶液，与500μL，参考例4所得银纳米粒子溶液配制的摩尔浓度为1.2×10-4 mol/L的纳米银溶液，加入到500μL参考例5所得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2（pH=8）中，搅拌反应15min后，静置20min，分别得均一体系3-1～3-4，分别测定其荧光强度F0；
（2）在步骤（1）所得均一体系3-1～3-4中，加入含有待测依替米星的溶液（理论浓度为1.5×10-6 mol/L），搅拌反应30min后，分别测定静置16min、18 min、20 min、22 min后的荧光强度F；
（3）分别计算Y=（F0-F）/F0=0.466，0.477，0.490，0.493，由表达依替米星与荧光强度之间关系的公式Y = 2.04+ 0.267*logC依替米星，R = 0.996，分别计算C依替米星得1.27×10-6 mol/L，1.4×10-6 mol/L，1.57×10-6 mol/L，1.61×10-6 mol/L。
如图10所示，为本发明实施例3-1～3-4步骤（3）所得Y=（F0-F）/F0的曲线图（从左至右第8～11点），由此可知，在所述反应时间范围内，随着反应时间的增加，（F0-F）/F0值逐渐增大，当反应时间达到20 min时，（F0-F）/F0比值趋于稳定，因此选择20min为最佳反应时间。
用共轭聚合物检测依替米星的方法实施例4-1～4-5
（1）将10μL，1×10-3 mol/L的共轭聚合物1的水溶液，分别与500μL，参考例4所得银纳米粒子溶液配制的摩尔浓度分别为0.72×10-4 mol/L、0.84×10-4 mol/L、1.08×10-4 mol/L、1.2×10-4 mol/L、1.32×10-4 mol/L的纳米银溶液，加入到500μL参考例5所得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2（pH=8）中，搅拌反应20min后，静置15min，分别得均一体系4-1～4-5，分别测定其荧光强度F0；
（2）分别在步骤（1）所得均一体系4-1～4-5中，加入含有待测依替米星的溶液（理论浓度为1.5×10-7 mol/L），搅拌反应20min后，静置15min，分别测定其荧光强度F；
（3）分别计算Y=（F0-F）/F0=0.238，0.239，0.240，0.244，0.237，由表达依替米星与荧光强度之间关系的公式Y= 0.595+0.0518*logC依替米星，R=0.997，分别计算C依替米星=1.28×10-7mol/L，1.34×10-7 mol/L，1.40×10-7 mol/L，1.67×10-7 mol/L，1.23×10-7 mol/L。
如图11所示，为本发明实施例4-1～4-5步骤（3）所得Y=（F0-F）/F0的曲线图（从左至右第5～9点），由此可知，在所述银纳米粒子在体系中的浓度范围内，随着银纳米粒子浓度的增加，（F0-F）/F0值先增大后减小，当银纳米粒子浓度为1.2×10-4 mol/L时，（F0-F）/F0值最大，荧光猝灭率最大，因此选择该浓度为最佳浓度。
用共轭聚合物检测依替米星的方法实施例5
（1）将10μL，1×10-3 mol/L的共轭聚合物1的水溶液和500μL，参考例4所得银纳米粒子溶液配制的摩尔浓度为1.2×10-4 mol/L的纳米银溶液，加入到500μL参考例5所得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2（pH=8）中，搅拌反应20min后，静置15min，得均一体系；
（2）在步骤（1）所得均一体系中，加入含有待测依替米星的溶液（理论浓度为4×10-7mol/L），搅拌反应20min后，静置15min，测定其650nm时的吸光度A650和393nm时的吸光度A393；
（3）计算Y=A650/A393=0.0666，由表达依替米星与吸光度之间关系的公式Y=-0.0623+328000*C依替米星，R=0.992，计算C依替米星得3.93×10-7mol/L。
如图12所示，不同粒子对于本发明实施例5步骤（2）所得混合溶液具有不同的响应，但只有加入依替米星，吸光度比值A650/A393才出现明显的上升，而其它干扰物基本没有太大的变化，说明依替米星的加入导致P2-AgNPs剧烈团聚，而其它干扰物质对体系的影响不是很大，本发明方法步骤（2）所得混合溶液对于依替米星有良好的选择性。
如图13所示，说明本发明实施例5步骤（2）所得混合溶液对不同浓度依替米星的荧光具有较为明显的响应区别。
如图14所示，为本发明实施例5步骤（2）所得混合溶液对不同浓度依替米星（1.0×10-7 mol/L，2.0×10-7 mol/L，3.0×10-7 mol/L，4.0×10-7 mol/L，5.0×10-7 mol/L，6.0×10-7 mol/L，7.0×10-7 mol/L，8.0×10-7 mol/L，9.0×10-7 mol/L和 1.0×10-6 mol/L）的荧光响应线性图，当依替米星的浓度2.0×10-7～7.0×10-7 mol/L 范围内时，A650/A393与C依替米星呈良好的线性关系，并以此作为步骤（3）的计算公式，计算含依替米星溶液的未知浓度。此方法的检出限为100 nmol/L（S/N=3）。
由本发明实施例5可知，依替米星诱导团聚的过程进一步被紫外-可见光光谱、TEM证实；将不同浓度的依替米星标准溶液加入P2-AgNPs溶液中，随着浓度的逐渐增大，P2-AgNPs在393nm处的吸光度值逐渐降低，在长波方向出现新的吸收带，其强度逐渐增强，这是由于P2-AgNPs的团聚并伴随着P2的团聚引起。