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1、(10)授权公告号 CN 101724306 B (45)授权公告日 2012.09.05 CN 101724306 B *CN101724306B* (21)申请号 200910213705.0 (22)申请日 2009.12.08 C09D 5/16(2006.01) (73)专利权人 中国科学院南海海洋研究所 地址 510301 广东省广州市新港西路 164 号 (72)发明人 严涛 刘永宏 曹文浩 杨斌 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 漆淑华等 . 海洋细菌 Pseudomonas sp. 抗菌 代谢产物的研究 .天然产物研究与开发 .2。
2、009, 第 21 卷 ( 第 3 期 ),420-423. 郭秀春等 . 海洋微生物中二酮哌嗪类化合物 的研究进展 . 微生物学通报 .2009, 第 36 卷 (第 10 期 ),1596-1603. (54) 发明名称 环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在海洋污损 生物防除中的应用 (57) 摘要 本发明公开了环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异 亮 氨 酸 在 海 洋 污 损 生 物 防 除 中 的 应 用， 其 分 子 式 为 C11H18N2O3， 分 子 量 226， 结 构 式 为 ： 其对海洋生物在固体 上的附着具有显著的抑制作用， 低含量涂覆下即 有显著效果 ； 同时，。
3、 其为天然存在的有机化合物， 不会造成水体环境的污染 ； 安全无毒， 在抑制海 洋动物附着的同时， 不会杀灭海洋生物 ； 并且， 不 同于大多已有的由海洋生物中提取的防污物质， 其人工合成工艺成熟， 获取途径简便， 适合于大规 模生产， 具有可靠稳定的来源， 在各类海洋人工设 施的污损生物防除中具有良好的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 詹红彬 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在海洋污损生物防除中的应用， 其分。
4、子式为 C11H18N2O3， 分子量 226， 结构式为 ： 所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸的最低涂覆量为 1g/cm2； 所述海洋污损生物 为马氏珠母贝。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 将所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸 涂覆于固体表面。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨 酸的最低涂覆量为 1g/cm2。 4. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸是 通过从海洋生物中提取获得或通过人工合成获得。 权 利 要 求 。
5、书 CN 101724306 B 2 1/5 页 3 环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在海洋污损生物防除中的 应用 技术领域 0001 本发明属于海洋防污涂料领域， 具体涉及一种环二肽在海洋污损生物防除中的应 用。 背景技术 0002 海洋污损生物是指固着或栖息在船舶和各种人工设施水下固体表面上， 对人类经 济活动产生不利影响的海洋生物， 其危害主要为增加船舶行进阻力， 降低航速， 增大燃料消 耗 ； 堵塞用水管道 ； 改变金属腐蚀过程， 导致局部腐蚀或穿孔 ； 妨碍各类海洋设施的正常工 作， 引发漂移、 失衡甚至导致倾覆 ； 在海洋水产养殖方面， 还会与养殖贝类争夺附着基和饵 料， 。
6、妨碍养殖对象的生长发育， 并降低水产品品质等。 0003 在海洋污损生物防除技术和方法中， 以防污涂料的应用最为广泛。传统的防污涂 料以毒料释放型防污为主要途径， 通过释放涂料中的铜、 汞、 锡、 砷等防污剂， 在材料周围形 成对海洋植物孢子以及海洋动物幼虫有毒杀作用的毒料浓度层， 从而达到防污目的。 然而， 以砷、 汞等的化合物为防污剂的防污涂料因毒性太大， 已于上世纪 50 年被淘汰， 从 20 世纪 60 年代起， 含铜和含锡的防污涂料开始被大量使用。 0004 有机锡化合物涂料曾经是世界上应用最为广泛的海洋防污产品， 以三丁基锡 (TBT， Tribultytin) 为代表， 其作用机。
7、制在于破坏生物细胞膜的正常功能， 妨碍氧化磷酸化 过程， 破坏动物的线粒体， 影响生物体正常的生命活动， 造成污损生物体的死亡和脱落。自 其 20 世纪 60 年代投入市场以来， 因良好的防污效果倍受市场的青睐。然而， 有机锡类化合 物会干扰牡蛎的钙代谢， 诱发海产腹足类性畸变， 累积在鱼、 贝等生物体内， 通过食物链对 人类健康产生不良影响， 并对海洋生态系统造成严重的破坏。自上世纪 80 年代中期以来， 在世界各地的海水、 底泥和生物中都相继发现了有机锡化合物的存在。 因此， 国际海事组织 (IMO) 规定， 自 2008 年起全面禁止在防污涂料中使用有机锡化合物。 0005 而含铜的防污。
8、涂料的大量使用则会导致铜元素也会在海洋中， 特别是海港中 大量的聚集， 从而对海洋生态环境产生不良影响， 故其应用势必也会受到一定限制。目 前海洋防污领域仍缺乏有效而安全的防污涂料， 由此导致的环境问题已经十分严峻， 因 此， 防污涂料的研究对象越来越倾向于由海洋动物中获取天然的防污物质。如目前已 有报到从红藻 (Delisea pulchra) 中分离纯化得到的一系列卤代呋喃酮混合物， 能够 有效抑制纹藤壶、 石莼和某些海洋细菌的附着 ； 从苔藓动物 (Zoobotryon pellucidum) 中提取的 2， 5， 6- 三溴 -1- 甲基芦竹碱 (TBG) 对纹藤壶幼虫的附着有显著地抑。
9、制作 用 ； 从棘皮动物海星的体壁提取物也能抑制纹藤壶和多室草苔虫 Bugula neritina 的 附着 ； 从海绵提取物中分离出硫酸化甾醇、 萜类、 溴化产物和脂肪酸等多种次级代谢产 物， 其中从海绵 Acanthellacavernosa 提取的 9 种吡喃类次级代谢产物对纹藤壶的附 着有抑制作用， 从海绵 Toxadocia zumi 中提取的 3 种甾体硫酸盐则可阻止管栖多毛类 Salmacinatribranchiata 的生长 ； 而从海绵 Aplysina fistularis 受伤组织中分离出的两 说 明 书 CN 101724306 B 3 2/5 页 4 种复合物也与该。
10、海绵良好的防污特性有关。 此外， 人们从不同海绵提取的嘌呤碱、 酰胺及呋 喃萜类次级代谢物， 均被证实具有一定的防污作用。海洋生物中具有如此丰富的具有防污 效果的物质， 是与他们的生理习性及长期的净化结果密切相关的。由于海洋环境中各物种 之间对空间的竞争十分激烈， 各种大型动物和植物都是其他生物潜在的附着污损对象， 为 避免其它生物附着可能产生的危害， 海洋中一些生物在长期的进化过程中， 各自形成了许 多独特的自我保护机制来保持自身体表的洁净。 0006 因此， 海洋世界中蕴含着极为丰富的防污资源有待研究及利用开发。 但是， 目前在 防污领域的相关研究应用仍很少， 被发现的防污物质仅占极少部分。
11、， 并且， 这些物质多为海 洋生物体中含量低的代谢产物， 自然生物体中含量极少， 且其合成工艺复杂， 不利于推广应 用。 因此， 寻求更为适用于大规模人工合成和推广应用的天然海洋防污物质， 成为这一领域 一大迫切的问题。 0007 环二肽 (2， 5- 二酮哌嗪 ) 是最小的环肽， 许多天然环二肽化合物都具有明确的生 物活性。环二肽结构的特殊性使得这类化合物的合成自成体系， 通常由 N 端游离的直链肽 酯在极性溶剂中回流， 便可以很容易地得到目的物。 因此， 这类物质在人工合成方面研究深 入， 合成工艺成熟， 获取途径简便， 适合于大规模生产。但目前， 在海洋防污领域， 未有任何 相关报道公开。
12、过有环二肽在污损生物防除中的作用。 发明内容 0008 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种安全无毒的， 易于人工合成的天 然产物在海洋污损生物防除中的应用。 0009 本发明通过以下技术方案实现上述目的 ： 0010 本发明是环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在海洋污损生物防除中的应用， 其分子 式为 C11H18N2O3， 分子量 226， 结构式为 ： 0011 0012 本发明所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸通过涂覆于固体表面， 可以抑制海 洋生物在固体表面的附着。但涂覆于固体表面仅是应用本发明的其中一种方式， 任何将该 物质应用于防治海洋生物附着的都属于本。
13、发明的保护范围。 0013 本发明所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在涂覆量为 1g/cm2以上时， 即对 污损生物的附着产生明显的抑制作用。其优选的涂覆量为 5g/cm2以上。试验表明， 环脯 氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在抑制海洋动物附着的同时， 并不会杀灭海洋生物， 毒性极小。 0014 本发明经过大量的实验， 发现脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸对蔓足类和双壳类的 附着有很好的抑制作用。 由于海洋污损生物由动物、 植物和微生物三大类组成， 其中危害较 大且附着后难以清除的种类主要是具石灰质外壳、 营固着生活的无柄蔓足类 ( 藤壶 ) 和双 说 明 书 CN 1。
14、01724306 B 4 3/5 页 5 壳类软体动物 ( 贻贝和牡蛎 ) 等生物。因此， 防污化合物筛选测试工作多选用无柄蔓足类 和双壳类为实验对象。其中的无柄蔓足类又以网纹藤壶为代表， 网纹藤壶是主要的污损生 物中的一种， 在浙江南部的洞头岛以南海域， 其在污损生物群落中占绝对优势 ； 而马氏珠母 贝是一种生活在热带、 亚热带海区的双壳类软体动物， 在我国南海广泛分布， 栖息于自低潮 线附近至水深 10m 左右的海底， 成体终生以足丝附着在岩礁、 石砾上生活， 可作为双壳类污 损生物的代表。 因此， 本发明的验证试验采用网纹藤壶和马氏珠母贝作为实验对象， 具有重 要的代表性意义。 0015。
15、 基于污损生物通常可分为两个生活阶段， 其一为从幼虫脱出卵膜发育至时断时续 地探索物体表面准备附着变态为止， 为浮游生活阶段 ； 自幼虫选好定居位置， 在其表面附 着、 变态形成幼体后， 为固着或附着生活阶段。从污损角度来看， 污损生物对人类产生危害 始于其营固着或附着生活以后。如能有效地抑制幼虫的附着变态， 就能达到污损生物防除 的目的。 因此， 本发明采用该两类海洋生物的幼虫为实验对象来检验化合物的防污效果， 是 具有科学合理性和代表性意义的。 0016 本发明所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸可以通过从海洋生物中提取获得。 0017 其提取方法包括以下步骤 ： 将海绵用酒精提。
16、取， 提取液经减压浓缩、 氯仿萃取后， 再用石油醚萃取得初提液 ； 初提液经反相硅胶柱进行 2 次纯化后， 洗脱液再用半制备高效 液相分离即得。其中所述的酒精优选 95的工业酒精 ； 洗脱液均为水 / 甲醇。 0018 本发明的提取方法优选以下方案 ： 0019 将采集的美丽属海绵用 95的工业酒精常温下提取三次， 浸提液减压浓缩后分散 于水并用氯仿萃取三次 ； 氯仿萃取部分用 85酒精溶解并用石油醚萃取三次 ； 85酒精萃 取部分经反相硅胶柱层析， 以水 / 甲醇 (6 4 ； 5 5 ； 4 6 ； 3 7 ； 2 8 ； 1 9 ； 0 10) 梯度洗脱得到25个组分F1-F25 ； 将。
17、其中的组分F2进一步用反相硅胶柱层析分离， 以水/甲 醇 (9 1 ； 8 2 ； 7 3 ； 6 4 ； 5 5) 梯度洗脱得到 12 个组分 G1-G12 ； 用半制备高效液 相分离组分 G2， 流动相为水 / 甲醇 (75 25)， 即可获得该化合物。 0020 本发明所述的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸还可以通过人工合成获得。环脯氨 酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸属于环二肽中的一种， 容易通过人工合成途径获得。 0021 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 0022 1.本发明公开的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸对海洋生物在固体上的附着具有 显著的抑制作用， 。
18、当固体表面涂覆了低含量的该物质时， 即有明显的防治海洋生物附着的 作用。 0023 2. 本发明公开的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸为天然存在的有机化合物， 不会 造成水体环境的污染， 不会通过食物链传递导致其在生物体中的富集， 对环境友好， 安全性 高。 0024 3. 本发明公开的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸在有效抑制海洋生物附着的同 时， 安全无毒， 不含铜和锡等重金属元素， 不会杀灭海洋生物， 只起到驱赶作用， 从环境保护 角度而言具有良好的社会效益。 0025 4. 本发明公开的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸是天然产物， 但其人工合成工艺 成熟， 获取。
19、途径简便， 适合于大规模生产， 不受限于生物体内的含量， 具有可靠稳定的来源， 推广应用潜力大， 在各类海洋人工设施的污损生物防除中具有良好的应用前景。 说 明 书 CN 101724306 B 5 4/5 页 6 具体实施方式 0026 实施例 1 0027 实验组 I ： 将环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸用甲醇溶解， 配制浓度为 28.26g/ ml 的溶液。在直径为 6cm 的培养皿中加入 1ml 该溶液， 并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶 剂完全挥发后， 涂覆于培养皿底部的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸含量为 1g/cm2。加 入 10ml 海水。 0028 实验组 。
20、II ： 将环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸用甲醇溶解， 配制浓度为 149.78g/ml 的溶液。在直径为 6cm 的培养皿中加入 1ml 该溶液， 并使其均匀覆盖培养 皿底部。待溶剂完全挥发后， 涂覆于培养皿底部的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸含量为 5.3g/cm2。加入 10ml 海水。 0029 对照组 ： 加 1ml 甲醇， 使溶液均匀分布于培养皿底部， 待溶剂挥发完全， 再加入 10ml 海水。 0030 空白组 ： 加入 10ml 海水。 0031 实验组、 空白组和对照组各设 5 个平行样。于各样品中分别加入 30 只网纹藤壶金 星幼虫。置于温度为 29左右。
21、的恒温培养箱内于黑暗环境中培养。每隔 24 小时观察一次。 培养 72 小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。 0032 表 1 列出了实验组、 对照组和空白组网纹藤壶金星幼虫的附着和死亡率。可见， 在 恒温培养箱中培养 72 小时后， 空白组的幼虫附着率约为 54， 对照组约 50， 空白组和对 照组金星幼虫的附着率无显著差异 (p 0.05)， 表明作为溶剂的甲醇挥发后不会遗留影响 金星幼虫活性的有害物质， 适于溶解该化合物。至于经环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸处 理的实验组， 其金星幼虫的附着率为0， 远远低于对照组， 差异极其显著(p0.01)， 表明这 种化合物。
22、具有极好的抑制网纹藤壶金星幼虫附着的能力。 0033 表 1 0034 组别 测试剂量 附着率 ( ) 死亡率 ( ) 空白组 - 54.4 0 对照组 - 50.0 0 实验组 I 1g/cm2 0 0 实验组 II 5.3g/cm2 0 0 0035 实施例 2 0036 实验组 ： 将环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸用甲醇溶解， 配制浓度为 282.6g/ml 的溶液。在直径为 6cm 的培养皿中加入 1ml 该溶液， 并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂 完全挥发后， 涂覆于培养皿底部的环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸含量为 10g/cm2。加入 说 明 书 CN 1017。
23、24306 B 6 5/5 页 7 10ml 海水。 0037 对照组 ： 加 1ml 甲醇， 使溶液均匀分布于培养皿底部， 待溶剂挥发完全， 再加入 10ml 海水。 0038 空白组 ： 加入 10ml 海水。 0039 幼虫数量的确定 ： 从育苗池取含马氏珠母贝面盘幼虫的水体并用筛绢浓缩。分三 次各取 50ml， 滴入 1-2 滴福尔马林溶液杀死幼虫后于显微镜下计数， 所得平均值即为水体 中幼虫的密度。 0040 实验组、 空白组和对照组均设 5 个平行样， 在各样品中加入约 30 个幼虫。在温度 约为 26的培养箱中于黑暗环境下培养。每隔 24 小时观察一次。培养 72 小时后对各组幼。
24、 虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。 0041 表 2 列出了实验组、 对照组和空白组马氏珠母贝幼虫的附着和死亡率。可见， 在恒 温培养箱中培养 72 小时后， 空白组的幼虫附着率约为 33， 对照组约 32， 空白组和对照 组面盘幼虫的附着率无显著差异 (p 0.05)， 表明作为溶剂的甲醇挥发后不会遗留影响面 盘幼虫活性的有害物质， 适于溶解该化合物。而经环脯氨酸 -2-N- 羟基 - 异亮氨酸处理的 实验组， 其幼虫的附着率为0， 远远低于对照组， 差异极其显著(p0.01)， 表明这种化合物 能有效地抑制马氏珠母贝幼虫的附着。 0042 表 2 0043 组别 测试剂量 附着率 ( ) 死亡率 ( ) 空白组 - 32.6 0 对照组 - 31.8 0 实验组 10g/cm2 0 0 说 明 书 CN 101724306 B 7 。