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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711057285.2 (22)申请日 2017.11.01 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号 (72)发明人 贺振陈春峰刘娴李良俊 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 代理人 戴朝荣郑慧娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒 及检测方法 (57)摘要。
2、 本发明公开了一种莲藕中苹果茎沟病毒的 检测试剂盒及检测方法， 其包括引物ASGVF4641 和ASGVR5784、 ASGVF4791和ASGVR5609， M-MLV反 转录酶、 M-MLV酶反应缓冲液、 dNTPs、 TaqDNA聚 合酶、 Mg2+、 PCR反应缓冲液。 本发明还公开了一 种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的方法。 本发明在 分子水平上为莲藕中苹果茎沟病毒的检测提供 了一种快速、 灵敏、 简便的方法， 也为莲藕生产中 苹果茎沟病毒的防治及其脱毒苗的制备提供了 有效方法。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 107794311 A 2018.03.13 CN 。
3、107794311 A 1.一种莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括4条特异性引物： ASGVF4641： 5 -TTAGGTGAGAGGCTTTACAC-3 ； ASGVR5784： 5 -TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC-3 ； ASGVF4791： 5 -CTATCGTCAACGTCAACC-3 ； ASGVR5609： 5 -TTCAATTCTAGCCGAGAG-3 。 2. 根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、 M- MLV酶反应缓冲液、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、 Mg2+、 PCR反应缓冲液。 3.。
4、根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括标准阳性模板。 4. 一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总RNA （2） 设计并合成引物， 包括4条特异性引物： ASGVF4641： 5 -TTAGGTGAGAGGCTTTACAC-3 ； ASGVR5784： 5 -TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC-3 ； ASGVF4791： 5 -CTATCGTCAACGTCAACC-3 ； ASGVR5609： 5 -TTCAATTCTAGCCGAGAG-3 ； （3） 巢式RT-PCR 反转录合成c。
5、DNA 以莲藕叶片总RNA为模板， 以ASGVR5784引物， 通过反转录酶为MLV， 合成cDNA， 反转录体 系为： 模板RNA 600ng， ASGVR5784 0.5 L， RTase M-MLV 0.5 L， 5M-MLV Buffer 2 L， dNTP Mixture 2 L， RNase Inhibitor 0.25 L， ddH2O至10 L； 反应过程为： 混匀， 离心后， 42保温60 min， 然后置冰上待用， 进行PCR扩增； PCR扩增 PCR反应体系如下： cDNA 2 L， 2Taq Mix 10 L， ASGVF4641 2 L， ASGVR5784 2 L，。
6、 ddH2O 至10 L； PCR程序为： 94预变性5 min； 94变性1 min， 55退火1 min， 72延伸1 min， 共进 行20个循环， 72延伸7 min， 4保存； 巢式PCR 将PCR反应产物10倍稀释作为模板， 以ASGVF4791和ASGVR5609为引物进行巢式PCR扩 增， 反应体系如下： PCR产物稀释液 2 L， 2Taq Mix 10 L， ASGVF4791 2 L， ASGVR5609 2 L， 加ddH2O至10 L； PCR程序为： 94预变性5 min； 94变性1 min， 55退火1 min， 72延伸1 min， 共进 行35个循环， 72。
7、延伸7 min， 4保存； （4） 电泳检测 吸取2.5 L巢式PCR产物进行0.8-1.5%的琼脂糖凝胶电泳， 经核酸染色， 通过凝胶成像 仪观察， 在感染苹果茎沟病毒的莲藕样品中有836 bp的核酸条带。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107794311 A 2 一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及植物病毒检测技术领域， 具体涉及莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒 及检测方法。 背景技术 0002 莲藕(Nelumbo nucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物， 原产中国和印 度， 有三千多年的栽培历史， 生产上可分为藕莲、 籽莲和花莲。
8、。 莲藕富含淀粉、 蛋白质、 维生 素、 矿物质等多种营养成分， 是我国南方地区的主要水生蔬菜， 其栽培面积近33.3万hm2。 0003 苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus， ASGV)属于乙型线状病毒科 (Betaflexiviridae)发样病毒属(Capillovirus)， 是常见的潜隐性植物病毒之一， 可通过 嫁接、 种子、 汁液摩擦等方式传播， 能够危害蔷薇科、 百合科、 豆科、 茄科、 禾本科等多种作 物。 本研究首次在莲藕中分离得到ASGV的基因组序列， 该序列ORF1与已报道的ASGV其他分 离物的相似性在78.2-90.7， 属于一种新株系。。
9、 由于目前ASGV莲藕株系无特异性抗血清， 无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。 发明内容 0004 本发明目的在于提供一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒及检测方法。 0005 为了实现本发明目的， 本发明首先提供一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒， 其特征在于包括4条特异性引物。 引物具体序列如下： 0006 外引物ASGVF4641： TTAGGTGAGAGGCTTTACAC； 0007 外引物ASGVR5784： TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC； 0008 内引物ASGVF4791： CTATCGTCAACGTCAACC； 0009 内引物ASGVR5609： TTC。
10、AATTCTAGCCGAGAG。 0010 优选所述外引物ASGVF4641和ASGVR5784的浓度均为10pmol/ l， 所述内引物 ASGVF4791和ASGVR5609的浓度均为20pmol/ l。 0011 进一步地， 本发明的试剂盒还包括M-MLV反转录酶、 M-MLV酶反应缓冲液、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、 Mg2+、 PCR反应缓冲液。 优选地， 所述试剂盒还包括标准阳性模板。 0012 在另一个方面中， 本发明还提供了一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测方法， 其利用 巢式PCR技术， 包括以下步骤： 0013 (1)采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总RNA 0。
11、014 (2)设计并合成引物， 包括4条特异性引物： 0015 ASGVF4641： 5 -TTAGGTGAGAGGCTTTACAC-3 ； 0016 ASGVR5784： 5 -TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC-3 ； 0017 ASGVF4791： 5 -CTATCGTCAACGTCAACC-3 ； 0018 ASGVR5609： 5 -TTCAATTCTAGCCGAGAG-3 ； 0019 (3)巢式RT-PCR 说明书 1/4 页 3 CN 107794311 A 3 0020 反转录合成cDNA 0021 以莲藕叶片总RNA为模板， 以ASGVR5784引物， 通过反转录。
12、酶为MLV， 合成cDNA， 反转 录体系为： 0022 0023 反应过程为： 轻弹管壁混匀， 稍离心后， 42保温60min， 然后置冰上待用进行PCR 扩增； 0024 PCR扩增 0025 PCR反应体系如下： 0026 0027 PCR程序为： 94预变性5min； 94变性1min， 55退火1min， 72延伸1min， 共进 行20个循环， 72延伸7min， 4保存； 0028 巢式PCR 0029 将PCR反应产物10倍稀释作为模板， 以ASGVF4791和ASGVR5609为引物进行巢式PCR 扩增， 反应体系如下： 0030 0031 PCR程序为： 94预变性5min。
13、； 94变性1min， 55退火1min， 72延伸1min， 共进 行35个循环， 72延伸7min， 4保存； 0032 (4)电泳检测 说明书 2/4 页 4 CN 107794311 A 4 0033 吸取2.5 L巢式PCR产物进行0.8-1.5的琼脂糖凝胶电泳， 经核酸染色Goldview， 通过凝胶成像仪观察， 在感染苹果茎沟病毒的莲藕样品中有836bp的核酸条带。 0034 优选的植物总RNA的提取方法为多糖多酚植物组织的裂解法。 0035 本发明显著优点： 0036 本发明提供了一种在莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒及检测方法， 利用巢式 RT-PCR方法检测莲藕中苹果茎沟病毒。
14、， 克服了莲藕中病毒含量低， 难于检测的问题； 且直接 提取莲藕总RNA， 克服了分离莲藕病毒核酸的繁琐步骤， 节省时间， 大大提高了检测的可操 作性、 灵敏性和可重复性， 为莲藕中苹果茎沟病毒的防治、 脱毒苗的检测提供了有效方法。 附图说明 0037 图1是RT-PCR检测电泳图。 具体实施方式 0038 下述实施例是为说明本发明而进行的进一步详细描述， 不构成对本发明的任何限 制： 0039 (1)引物设计与合成 0040 根据已获得苹果茎沟病毒莲藕分离物序列， 设计并合成在莲藕中检测苹果茎沟病 毒的 特 异 性 引物 ： A S G V F 4 6 4 1 (T T A G G T G 。
15、A G A G G C T T T A C A C) 和A S G V R 5 7 8 4 (TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC)、 ASGVF4791(CTATCGTCAACGTCAACC)和ASGVR5609 (TTCAATTCTAGCCGAGAG)； 0041 采用PAGE的纯化方式， 送上海生工生物工程股份公司进行合成。 0042 (2)总RNA提取 0043 多糖多酚植物组织裂解法 0044 (3)巢式RT-PCR 0045 反转录合成cDNA 0046 以莲藕叶片总RNA为模板， 以ASGVR5784引物， 通过反转录酶为MLV， 合成cDNA， 反转 录体系为： 004。
16、7 0048 轻弹管壁混匀， 稍离心后， 42保温60min， 然后置冰上待用； 0049 PCR扩增 说明书 3/4 页 5 CN 107794311 A 5 0050 PCR反应体系如下： 0051 0052 PCR程序为： 94预变性5min； 94变性1min， 55退火1min， 72延伸1min， 共进 行20个循环， 72延伸7min， 4保存； 0053 巢式PCR 0054 将PCR反应产物10倍稀释作为模板， 以ASGVF4791和ASGVR5609为引物进行巢式PCR 扩增， 反应体系如下： 0055 0056 PCR程序为： 94预变性5min； 94变性1min， 5。
17、5退火1min， 72延伸1min， 共进 行35个循环， 72延伸7min， 4保存； 0057 (4)电泳检测 0058 吸取2.5 L巢式PCR产物进行0.8-1.5的琼脂糖凝胶电泳， 经核酸染色Goldview， 通过凝胶成像仪观察， 在感染苹果茎沟病毒的莲藕样品中有836bp的核酸条带。 如图1所示。 0059 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 本领域技术人员对之可作一些修改或改进。 但是， 在不偏离本发明内涵的基 础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 4/4 页 6 CN 107794311 A 6 序列表 扬州大学 一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒及检测方法 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA 人工序列() 1 ttaggtgaga ggctttacac 20 2 22 DNA 人工序列() 2 tgcaaagaag aaggtaaagc tc 22 3 18 DNA 人工序列() 3 ctatcgtcaa cgtcaacc 18 4 18 DNA 人工序列() 4 ttcaattcta gccgagag 18 序列表 1/1 页 7 CN 107794311 A 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 107794311 A 8 。