技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产角蛋白酶的短小芽孢杆菌及其粗酶性质。
背景技术
角蛋白广泛存在于自然界中，主要以动物毛发、羽毛、蹄角为主要存在形式，是一种很难降解的硬性蛋白，角蛋白酶作为一种能专一性降解角蛋白的酶类，在角蛋白废弃物再利用上具有广泛的应用前景。
我国的废次羊毛和家禽羽毛资源极其丰富，其主要成分是难被降解的角蛋白。目前这些优良的蛋白资源大部分未被有效利用，造成了资源浪费，有的甚至造成环境污染。角蛋白酶具有特异性降解角蛋白的特性，可将角蛋白转变成可溶性蛋白、氨基酸等，广泛应用于皮革工业、医药原料、动物饲料等。能产生角蛋白酶的微生物种类很多，如芽孢杆菌、链霉菌、单胞菌、真菌等。
本发明的目的在于提供一株产角蛋白酶的短小芽孢杆菌，并对其粗酶性质进行了研究。
发明内容
角蛋白酶产生菌株的筛选、鉴定方法为：
（1）初筛：土壤样品采集地点为江南大学附近农村羊圈，以羊毛为唯一碳氮源进行平板初筛，将所采土样制备土壤悬液，逐级稀释涂布至初筛平板，置于30℃培养箱中培养3天。挑取能在羊毛为唯一碳氮源的初筛平板上生长的单菌落，稀释涂布至得到单菌落。
（2）复筛：将初筛得到的菌株接种至羊毛为唯一碳氮源的摇瓶发酵培养基，培养至合适时间，检测发酵上清液角蛋白酶活力，得到酶活较高的菌株。
（3）菌株的分子鉴定：对菌株进行16SrDNA鉴定。方法为：提取菌株总DNA，用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，得到基因序列为1500bp左右的16SrDNA序列，与Genbank数据库进行序列比对，结果为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，并将其命名为K9，于2013年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.8046。
上述初筛培养基（g/L）：羊毛粉5，琼脂粉20，NaCl0.5，K2HPO40.4；
上述复筛摇瓶发酵培养基（g/L）：羊毛粉10，NaCl0.5，K2HPO40.4。
优化培养条件方法：
培养条件优化采用了单因素及正交实验，优化了菌株的发酵培养基及发酵条件，结果得到最适培养基配方为羊毛1-3%，麦芽糖1-2%，酵母粉1-2%，磷酸氢二钾0.04%，氯化钠0.05%，培养条件为：初始pH值为8.5，接种量8%，培养温度35℃，转速220r/min，装液量25ml/250ml，发酵周期48h，产角蛋白酶活力达到214.5U/ml。
粗酶性质研究：
在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下测定酶活，结果表明该角蛋白酶的最适作用温度为55-65℃范围内。配制不同pH值（3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的缓冲液测定pH对该酶活力的影响，得到结果为最适pH为9.0，且所产角蛋白酶在碱性环境(pH8.0-11.0)中酶活都比较稳定。
角蛋白酶活力的测定方法：
将发酵液离心得到发酵上清液，取1.0mL发酵上清液，加入1.0mL0.05mol/L的Tris-HCl(pH=9.0)缓冲液和10mg羊毛粉底物，于55℃恒温振荡水浴锅中反应1h，加入0.4mol/L三氯乙酸2.0mL终止反应，12000rpm离心15min，取上清液于280nm处测定其吸光值。以反应前添加三氯乙酸处理作为对照。
酶活定义为：在上述反应体系中，280nm处吸光值增加0.01为1个酶活力单位(U/mL)。
具体实施方式
实施例1角蛋白酶产生菌株的筛选与鉴定
1、实验材料
土样来源：江南大学附近农村羊圈采集的土壤样品。
平板初筛培养基(g/l)：羊毛粉5，琼脂粉20，NaCl0.5，K2HPO40.4。
LB培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
发酵培养基(g/l)：羊毛粉10，NaCl0.5，K2HPO40.4
2、平板初筛
将所采土样制备土壤悬液，按常规方法稀释得到10-1-l0-7稀释度悬液。分别取各稀释度悬液0.1mL涂布于羊毛为唯一碳氮源的初筛培养基平板，于30℃培养箱中恒温培养2-3天，挑取菌落较大、形态各异的菌落若干株，划线分离2-3次至得到单菌落。
3、摇瓶复筛
将初筛得到的菌株，按照形态初步分类为放线菌、真菌、细菌，对这三类菌株分别使用高氏培养基、察氏培养基和LB培养基作为种子培养基，制备种子悬液，然后按2%的接种量接种至羊毛为唯一碳氮源的发酵培养基，于30℃，220r/min条件下培养48h，测定发酵上清液中角蛋白酶的活力，得到22号菌酶活力较高，为113.2U/ml。
4、16SrDNA分子鉴定
活化培养该株产酶较高的菌株，提取其总DNA，用细菌16SrDNA通用引物PCR扩增目的片段，得到1500bp左右的基因序列，与Genbank数据库进行序列比对，结果与短小芽孢杆菌的序列同源性高达99%，所以初步鉴定其为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，并将其命名为K9。
实施例2菌株发酵产角蛋白酶条件优化
培养条件优化采用了单因素及正交实验，优化了菌株的发酵培养基及发酵条件，结果得到最适培养基配方为羊毛1-3%，麦芽糖1-2%，酵母粉1-2%，磷酸氢二钾0.04%，氯化钠0.05%，培养条件为：初始pH值为8.5，接种量8%，培养温度35℃，转速220r/min，装液量25ml/250ml，发酵时间为48h，产角蛋白酶活力达到214.5U/ml，较优化前提高了1.9倍。
实施例3粗酶性质研究
在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下测定酶活，结果表明该角蛋白酶的最适作用温度为55-65℃范围内。配制不同pH值（3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的缓冲液测定pH对该酶活力的影响，得到结果为最适pH为9.0，且所产角蛋白酶在碱性环境(pH8.0-11.0)中酶活都比较稳定，提示该菌适用于此条件下。