发明背景
替代合成聚合物的生物聚合物具有重大益处。从可再生资源可持续 地产生的生物可降解聚合物提供了目前由合成聚合物制造的广泛产品的 环境持续性所必需的重要技术发展。
已研究了用于产生生物聚合物材料的许多天然材料，包括聚乳酸、 大豆蛋白质、淀粉、壳多糖和其他天然结构材料。然而，生物聚合物材 料一直存在问题，包括在使潜在的粮食作物转向非食物用途时材料资源 的可持续性，物理性质(特别地当变湿时)，和使用与合成聚合物工业 中使用的工业流程类似的流程加以加工的能力。
以其天然形式存在的角蛋白展示了通常从合成聚合物寻求的所需坚 固性，但还不可能以有用的方式处理角蛋白来产生合成聚合物材料的替 代品，因为其不是天然热塑性的或可成形的。当与其他天然材料相比较 时，角蛋白的坚固性的一个原因是角蛋白材料例如角、蹄、毛发、羊毛、 羽毛和指(趾)甲中存在高比例的纤维状蛋白质。除该纤维状蛋白质组 织成纤维状结构的倾向性外，该蛋白质的高度有序的性质是角蛋白成为 非常适合于生物聚合物材料生产的又一重要因素。
从天然来源分离角蛋白的先前方法已使得具有前景、但在生产坚固 材料时不太实用的材料能够以工业可接受的方法进行加工。
从角蛋白形成重建材料的一般方法包括使用溶剂浇铸或熔体加工 (melt processing)将角蛋白与其他聚合物混合。混合的聚合物通常不 是完全生物聚合性的材料，因此从可持续性前景来看不太理想，此外， 它们可能因成分的不完全混合而不具有充足的物理性能。已通过浇铸来 自多种溶剂(最常见地基于水的溶剂)的材料而从纯的角蛋白构建一些 材料。在这些情况下，浇铸材料的形式是有限的。薄膜和纤维比更大体 积或显著更厚的材料更容易使用这些方法产生。此外，这些材料通常不 具有充足的物理性质，特别是当与水接触时。
概述
本公开内容包括制品和用于制造包含已塑形或成形的角蛋白制剂的 制品的方法。将角蛋白的干粉或湿粉制剂经历压力和任选地加热以使角 蛋白处于玻璃化或流动可塑状态。随后通过使角蛋白制剂在模具中回复 至环境状态来模塑角蛋白制剂，或可将其挤出和成型。模塑或成型的产 品展示良好的物理强度和湿态强度(wet strength)，并且可通过加入 增塑剂或通过使用弹性角蛋白共聚物而将其制造得更加抗水或更加柔 韧。
模塑制品可用于许多产品领域，包括但不限于医疗设备例如植入物， 包括但不限于矫形外科植入物、脊柱植入物、填充剂、螺丝(screw)或 紧固件(fastener)、组织扩展器(tissue expander)或支架、人造组 织或器官、伤口愈合绷带或创伤修复材料、结构制品例如瓶子或容器， 并且也可例如将其作为熔化挤出赋形剂(melt extruded excipients) 与药学活性剂一起共挤出。
在整个本公开内容中，除非上下文另有所指，否则词语“包含”或 变型例如“包括”或“含有”应理解为表示“包括，但不限于”，从而 未被明确提及的其他要素也可被包括在内。此外，除非上下文另有所指， 否则术语“a”或“the”的使用可表示单个物体或要素，或其可表示复 数，或此类物体或要素的一个或多个。
详述
角蛋白是特征在于高水平的半胱氨酸的蛋白质家族，所述半胱氨酸 通过二硫键赋予角蛋白以高度交联性。角蛋白存在于广泛的生物组织中， 在皮肤、毛发和其他材料中发挥结构作用。
角蛋白是天然不溶的，并且以例如羊毛或羽之类形式存在，所述形 式不容易加工成可用作生物聚合物制品的形式。然而，角蛋白可被改性 成为可溶性的，并且随后被分离为以粉末形式存在，用作使用压缩法生 产生物聚合物材料的原料。用于产生角蛋白粉末形式的任何方法可用于 产生适合于压制法的角蛋白形式。
一个这样的方法包括化学修饰角蛋白以形成S-磺化的角蛋白，如 2006年12月12日授权的美国专利No.7,148,327(通过引用并入本文) 中所描述的。S-磺化的角蛋白是指已经历这样的过程的角蛋白，在所述 过程中，角蛋白中半胱氨酸之间的二硫键被可逆地修饰以产生允许最初 存在于角蛋白中的天然二硫键交联的受控再引入的极性官能团。S-磺化 的角蛋白具有主要以S-磺酸半胱氨酸的形式存在的半胱氨酸/胱氨酸。 该高度极性的基团赋予蛋白质以一定程度的可溶性。虽然在溶液中是稳 定的，但S-磺基是不稳定的半胱氨酸衍生物，对硫氢基例如半胱氨酸和 其他还原剂具有高度反应性。与还原剂的反应导致S-磺基半胱氨酸基团 逆转回胱氨酸。S-磺基半胱氨酸在化学上与磺基丙氨酸不同，虽然两个 基团都包含SO3-基团。磺基丙氨酸可通过半胱氨酸或胱氨酸的氧化不可 逆地产生，并且一旦形成，其不能返回与半胱氨酸形成二硫键交联。S- 磺基半胱氨酸对于半胱氨酸是反应性的并且容易形成二硫键交联。包含 S-磺化和氧化的磺基丙氨酸的蛋白质在本公开内容的实施中是有用的。
在S-磺化角蛋白的情况下，S-磺化形式向交联二硫化物形式的转化 可通过应用还原条件例如通过应用硫氢基来实现。S-磺化的角蛋白可通 过许多方法来制备，包括2006年12月12日颁布的美国专利No. 7,148,327(通过引用并入本文)中描述的方法。
如下概括了用于将胱氨酸二硫键修饰成半胱氨酸S-磺酸盐的机制， 其中K为角蛋白：
K-S-S-K →2K-S-SO3-
可如下概括重新形成这种交联的机制，其中K是角蛋白，并且R是 还原剂：
K-S-SO3-+R-S-→K-S-S-R+SO32-
K-S-S-R+R-S-→K-S-+R-S-S-R
2K-S-SO3-+R-S-→K-S-S-K+SO32-
角蛋白可以是角蛋白级分。角蛋白级分是来自角蛋白家族内的独特 族群，包括中间丝蛋白质类、高硫蛋白质和高甘氨酸-酪氨酸蛋白质。
中间丝蛋白质类由Orwin等人进行了详细描述(Structure and Biochemistry of Mammalian Hard Keratin，Electron Microscopy Reviews，4，47，1991)，并且也被Gillespie称为低硫蛋白质 (Biochemistry and physiology of the skin，第1卷，Ed.Goldsmith Oxford University Press，London，1983，pp.475-510)。中间丝蛋白 质类家族的主要特征是分子量在40至60kD的范围内和半胱氨酸含量 (以胱氨酸的一半测量)为约4％。
高硫蛋白质家族也由Orwin和Gillespie在上文中参考的相同出版 物中详尽地描述。该蛋白质家族具有很大程度的异质性，但可被表征为 具有10至30kD范围内的分子量和大于10％的半胱氨酸含量。该家族的 一个亚组是超高硫蛋白，其可具有达到34％的半胱氨酸含量。
高甘氨酸-酪氨酸蛋白质家族也由Orwin和Gillespie在上文中参考 的相同出版物中进行了详尽描述。该家族也称为高酪氨酸蛋白质，其具 有低于10kD的分子量、通常大于10％的酪氨酸含量和通常大于20％的甘 氨酸含量的特征。
为了本公开内容的目的，“角蛋白级分”是主要(虽然不是全部) 包含一种如上所述的独特蛋白质族群的角蛋白纯化形式。
可溶性角蛋白或蛋白质级分也可以是完整的。术语完整是指未被明 显水解的蛋白质，其中水解被定义为通过添加水产生的肽键的切割。 Gillespie认为完整是指以角质化聚合物状态存在的蛋白质，并且还指 复合而形成羊毛和毛发中的完整角蛋白的多肽亚单位。它们等同于天然 形式存在的、不具有通过角质化过程形成的二硫键交联的角蛋白。
完整角蛋白和角蛋白级分更详细地论述于在2006年6月19日提交 的共同未决、共同拥有的美国专利申请系列No.10/583,445(其整个申 请通过引用并入本文)中。
角蛋白也可以是氧化的角蛋白。氧化的角蛋白可通过将角蛋白与氧 化剂接触而产生，从而导致胱氨酸转化成磺基丙氨酸以及角蛋白被转化 成可溶性或粉末形式。
角蛋白还可以是还原的角蛋白。还原的角蛋白可通过将角蛋白与还 原剂例如硫醇、膦类化合物或其他相似还原剂接触而产生。这将存在的 胱氨酸转化成半胱氨酸或可选择的衍生物，切割交联键并且将不溶性角 蛋白转化成可被干燥成粉末形式的可溶性形式。
角蛋白可从任何角蛋白来源，包括羊毛、羽毛、动物或人毛发、蹄、 角、指(趾)甲、皮肤、爪、喙提取。
在某些实施方案中，角蛋白分子可以是主要为β角蛋白的分离的级 分。β角蛋白是形成β折叠片结构的蛋白质。它们是龟的背甲和腹甲、 蛇的表皮和鸟的羽毛的角质材料主要成分。某些β角蛋白，特别是例如 鸟类角蛋白，其特征在于更高比例的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨 酸。β角蛋白材料的优良来源是禽类羽毛，包括家禽加工的副产品。
在本公开内容的实施中，将角蛋白来源例如清洁的家禽羽毛经历分 级分离，或者通过氧化(包括氧化性亚硫酸分解)，氧化后还原，或还 原，然后在水溶液或醇溶液中过滤来进行。过滤后，可将可溶性滤出液 或通过过滤保留的不溶性部分用于本公开内容的实施。不溶性部分主要 是β角蛋白，并且可包括来源于源蛋白质的β角蛋白部分的70、80、90 或甚至95％的蛋白质。
随后在材料的塑性流动所需的压力和温度下将β角蛋白进行模压成 型以形成模塑制品。
先前不知道角蛋白是可使用常规工业聚合物加工法例如使用加热、 压缩和挤压的加工法来加工的。
已确定有可能通过应用加热和压缩来实现角蛋白颗粒的融合。此外， 融合的材料可在这些条件下实现塑性流动，从而可使用常规工业方法加 工。
角蛋白的简单压缩可产生有用的材料，但此类材料不容易经历充分 的形状改变或将颗粒融合在一起。为了获得角蛋白的塑性流动特征和向 一种材料内融合，必需加入正确用量的水以允许角蛋白在压力下经历相 变，但不要太湿以至于阻止角蛋白在那些相同条件下的融合。水对角蛋 白的理想比例为1比4。水对角蛋白的比例将部分取决于角蛋白来源和 角蛋白级分。例如，羊毛在基质中具有较低的疏水性蛋白质浓度，从而 具有比人毛发角蛋白显著更高的玻璃化温度，据报导人毛发为144℃， 羊毛为174℃(Wortmann等人，Biopolymers 2006Apr 5；81(5)：371-5)。 玻璃化也取决于水浓度。Katoh等人，(Biomaterials，2004(25) 2265-2272)在脱水S-磺基角蛋白中未发现转化，还发现随着水含量增加， 其转变温度降低。本文中描述的实例也显示可通过对水化的角蛋白施加 压力来在环境温度下实现角蛋白的玻璃化。
在一个优选实施方案的实施中，将水加入角蛋白无水颗粒，使其平 衡以便水均匀分布在角蛋白中。需要正确量的水来促进蛋白质分子的再 组织。太多的水会阻碍蛋白质分子的融合，并且所得的材料具有较差的 物理性质。取决于所使用的角蛋白和待制造的制品，可将水加至约10％ 至约50％w/w的浓度。如所声明的，相对于羊毛而言，需要给人毛发角 蛋白加入更少的水，而向α角蛋白或完整中间丝蛋白质类加入则更少的 水。
按要求将角蛋白粉末压缩至约3MPa至约700MPa的压力。该压力 是实现角蛋白的融合和塑性流动所必需的。低于3MPa的压力，蛋白质颗 粒不融合，并且所得的材料具有较差的物理性质。
当在压缩时加热角蛋白可增强该蛋白质融合以及流动(以与热塑性 聚合物相似的方式)的能力，从而获得所需的物理形式。在压缩下从约 40℃加热至约175℃可使角蛋白和水组合通过其玻璃化温度，并且因此 增强塑性流动。精确的加热温度取决于角蛋白在压缩下的确切性质。在 压缩下将S-磺化的角蛋白中间丝蛋白质类加热至70℃以获得坚固的生 物聚合物材料。
不将本公开内容的实施限定于任何特定理论，预期坚固的物理性质 是因角蛋白在压缩过程中被组织或排列所致。为了实现这一效果，角蛋 白优选具有高分子量，并且不被水解或具有低分子量。它们优选是完整 蛋白质。
在某些实施方案中，使用基本上完整的中间丝蛋白质类。已知此类 蛋白质是高度有序的纤维状结构。因此，纤维状中间丝蛋白质类可在压 缩过程中获得一定程度的有序性，得到可用于制品的坚固材料。其他蛋 白质级分例如高硫蛋白质和高甘氨酸高酪氨酸蛋白质也经历压缩以产生 适合用于某些制品的材料。
在压缩过程中除去在压缩前加入角蛋白的水。达到充分的脱水对于 在所得的材料中获得充分的湿态强度是非常重要的。脱水使得角蛋白的 相互作用增强，中间丝经历纤维状蛋白质链之间的多极性和非极性相互 作用。蛋白质分子之间的紧密相互作用的组合效应抵抗水渗入所得的材 料。
当湿润时维持物理强度是生物聚合物材料的一个所需特征。获得该 特征的一个方法是通过使用以酸性形式存在的角蛋白或处于它们的等电 点的角蛋白以减少角蛋白的极性。使用以酸性形式存在的S-磺化角蛋白 产生了与使用具有更大程度离子性基团或磺酸盐的角蛋白相比较时溶解 性显著降低的材料。可压缩因亚硫酸分解(sulfitolysis)产生的酸性形 式的S-磺化角蛋白和因氧化产生的酸性形式的氧化角蛋白或羊毛硫氨酸 化的(lanthionized)角蛋白，以产生具有良好物理强度的生物聚合物 材料。
在利用模压成型产生的材料中获得湿润时所需的物理性质。所述材 料可在环境或升高的温度下在水中维持延长的时间，并且该材料维持尺 寸稳定性。在水中维持会引起一定的刚性减小，但减少量不会大至降低 该材料在生物聚合物应用中的有用性。
可在压缩之后处理角蛋白的极性形式，例如氧化的或以盐形式存在 的S-磺化角蛋白，以产生酸性形式。可利用酸例如无机酸或有机酸实现 处理。还可用硫羟酸实现处理，所述硫羟酸具有在角蛋白材料中重形成 二硫键交联，从而增强湿态强度的额外有利方面。
用于当湿润时维持物理强度的另一个方法是使用还原形式或二硫键 键合形式的角蛋白。当使用压缩进行处理时，所述角蛋白可模塑形成在 湿润时具有所需物理性质的坚固材料。
还可通过利用另外的交联剂例如通常用于蛋白质交联的那些交联剂 处理材料来进一步增强物理性质。此类交联剂包括醛类、环氧化物、酸 酐等。交联的角蛋白聚合物或弹性体也可利用甲硅烷交联剂来制备，其 中甲硅烷或siloxide聚合物包括与角蛋白共价结合的环氧化物或乙烯 基终端的聚合物。
这样可在压缩之前(以便压缩处理的粉末)或在压缩后(以便处理 以其成型的形状存在的所得材料)用交联剂处理角蛋白。还应理解，在 某些实施方案中，模塑制品可以不以最终的功能形状存在，而是所述模 塑制品可通过切割、研磨或抛光来进一步成型。
可通过在压缩前将增塑剂包含在混合物中来减小生物聚合物材料的 刚性以获得所需柔韧材料。增塑剂可选自任何常用增塑剂，包括甘油、 聚乙二醇或相似的多元醇。可通过在压缩之前以4∶1的角蛋白对增塑剂 溶液的比例用1-5％甘油水溶液水化S-磺化角蛋白粉末来完成柔性生物 聚合物材料的制备。
实施例
实施例1
可将以干粉形式存在的酸化的S-磺化角蛋白中间丝蛋白与水以4∶1 的质量比例组合。使所述混合物在环境条件下平衡12小时。平衡后，将 混合物转移至直径38mm的圆柱形模具，经历25MPa的压力，进行20 分钟。在从模具取出时，蛋白质粉末已融合成具有透明琥珀外观的单个 蛋白质块。所述蛋白质块随后能够加工成任何所需形状。将该蛋白质块 浸入沸水中进行2小时，在外观或尺寸上未发生可观察到的变化。将该 蛋白质块在环境温度下再浸入水中进行2周，在外观或尺寸上未发生可 观察到的变化。在两个情况下，蛋白质块变得更柔韧。
实施例2
以与实施例1相同的方式制备和模塑蛋白质，然而，将用于压缩的 模具以及蛋白质、水混合物预加热至70℃。
实施例3
将酸化的S-磺化角蛋白中间丝蛋白以干粉形式与增塑剂溶液 (20％w/w的甘油水溶液)以4∶1的比例组合。使混合物在环境条件下平衡 12小时。平衡后，如实施例1中所述对混合物进行模塑。所得的蛋白质 块与实施例1中制备的蛋白质块相比较而言刚性较低，并且更容易被机 器塑造成所需形状。
实施例4
用巯基乙酸铵(0.25M，缓冲至pH 7.4的0.1M磷酸钾)处理酸化的 S-磺化角蛋白中间丝蛋白1小时，用水充分洗涤，然后冻干。将所得的 材料研磨成粉末，随后以4∶1的比例将其与水组合。使混合物在环境条 件下平衡12小时。在平衡后，如实施例1中所述对混合物进行模塑。
实施例5
在环境温度下，将实施例1中产生的蛋白质块于戊二醛的水溶液 (5％w/w)中交联，进行30分钟。干燥后，所得的蛋白质块具有比实施例 1中产生的块更大的刚性。
实施例6
以4∶1的比例将氧化的角蛋白与水组合。使混合物在环境条件下平 衡12小时。在平衡后，如实施例1中所述对混合物进行模塑。
实施例7
以4∶1的比例将羊毛硫氨酸化的(Lanthionised)角蛋白与水混合。 使混合物在环境条件下平衡12小时。平衡后，如实施例1中所述对混合 物进行模塑。
虽然在本文中以优选实施方案的方式描述了本发明的具体实施方 案和本发明的方法步骤，但是，未明确公开的、但在本领域内已知的其 他改变均包括在本公开内容的范围内。因此，对于本领域技术人员来说 很显然的是，可对本文中描述的材料、装置和/或方法以及方法的步骤 或步骤的序列进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。对于本领 域技术人员很显然的所有此类相似的替代和修饰被认为在如由所附权 利要求确定的本发明的精神、范围和概念内。