技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及 其用途。
背景技术
我国是一个人口大国，因病虫害导致的粮食产量问题非常严峻。农药作为一种农业 生产资料，在维护人类的生命、生活及环境的品质、土地与生物资源的永续利用上均扮 演着重要而不可或缺的角色。据国家统计局数据显示，全国2012年11月农药原药产量 336131吨，较10月产量(303043吨)环比增长10.92％，较去年11月产量(241408吨) 同比增长39.2％。但是，由于人类大量使用化学农药和化肥等，造成病虫害泛滥，地力 下降，加速野生物物种灭绝，栽培物种的品质退化，自然调整能力降低。
为此，我国政府不断推出对高毒农药的管理措施。2011年6月15日，农业部、工 信部、环保部等五部委联合发布第1586号公告，决定对高毒农药采取进一步禁限用管 理措施，停止受理克百威、氧乐果、甲基硫环磷等22种农药新增田间试验申请、登记 申请及生产许可申请；自2011年10月31日起，撤销苯线磷、特丁硫磷等10种高毒农 药的登记证、生产许可证，停止生产，并于2013年10月31日起，停止销售和使用。 因此，利用生物技术创新，开发高效低毒的微生物源农药，是实现农业高效和可持续发 展的一条有效途径。
统计分析表明，我国的农作物浸染性病害中，真菌病害是目前已知植物病害中种类 最多的病害，约占病害种类的80％-90％。由此可见，防治植物真菌性病害的农药具有广 泛的开发潜力和良好的市场前景。
吩嗪类化合物是一类含氮的杂环化合物。由于吩嗪环的存在，几乎所有的吩嗪类化 合物都具有一定的氧化还原活性，能够与细胞内的活性成分作用，在细胞种积累超氧化 物和过氧化物，因此具有广谱的抑制植物病原真菌的作用，而且不易产生耐药性。此外， 吩嗪类化合物在微生态环境下还发挥着极其复杂的生理功能，如信号调控功能、影响生 物膜的形成、厌氧环境下作为电子载体有助于微生物的存活、诱导植物产生系统抗性、 增强微生物在植物根际的定植等。目前发现和研究的吩嗪类化合物有6000多种。其中， 天然的吩嗪类化合物有50多种，比如吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-甲酰胺、2-羟基吩嗪等。
上海交通大学生命科学技术学院许煜泉课题组筛选到一株能同时分泌吩嗪-1-羧酸 和藤黄绿菌素的铜绿假单胞菌M18，并通过分子生物学技术，对该假单胞菌株的相关调 控基因进行突变，并进一步优化培养基组成和发酵工艺条件，PCA的产量达到6000ppm 以上。该研究使PCA的大规模生产成为现实，PCA被命名为申嗪霉素，并获得了农业 部颁发的新农药药证(农药登记证号PD20110314和PD20110315)。申嗪霉素具有安全、 高效、与环境相容性好的特点，已经成为一种广谱防治农作物病害的生物农药。
但是，在农田应用中发现，申嗪霉素的抗菌活性受到环境pH值的严重影响。pH7.0 的条件下，吩嗪-1-羧酸抗菌活性仅为pH5.0时的20％，而在更高的pH环境中，其抑菌 活性完全消失。作为其衍生物，吩嗪-1-甲酰胺具有同样广谱的抗真菌活性，可以用作农 业杀菌剂，但是表现出了良好的稳定性和生物活性。Chin-A-Woeng的研究发现，在中 性或碱性环境下，PCN对尖孢镰刀菌的抗菌活性为PCA的5～10倍(Chin-A-Woeng，et al.Mol.Plant Microb.In.，1998，11(11)∶1069)。此外，PCN及其类似物由于可以抑制拓 扑异构酶I和II的活性，具有潜在的抗癌活性，因此受到了众多科学家的广泛关注。目 前，能合成PCN的微生物菌株包括绿针假单胞菌PCL1391，铜绿假单胞菌PAO1、PUPa3、 MML2212等菌株，但是这些菌株中PCN的产量太低而不足以进行工业开发。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中现有菌株生产吩嗪-1-甲酰胺产量和效率较 低的缺陷，提供一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。
本发明以绿针假单胞菌HT66为出发菌，通过基因工程技术从HT66菌株基因组的 中分别或是同时敲除吩嗪合成过程中的rpeA、psrA负调控基因，构建HT66ΔrpeA、 HT66ΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrA基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲酰胺 (Phenazine-1-carboxamide，CAS号为550-89-0，简称PCN)的产量大幅提高，能够 更加有效用于生物防治。其中HT66ΔrpeAΔpsrA基因工程菌株具有最佳效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，敲除绿针假单 胞菌HT66(Psedunomonas chlororaphis HT66)CCTCC NO：M2013467基因组中的psrA 基因。
优选地，所述psrA基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述敲除psrA基因包括如下步骤：
A、扩增psrA基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；(该质粒为大肠杆菌与假单胞菌 的穿梭质粒。)
B、扩增庆大霉素抗性基因，插入psrA基因中间，使psrA基因发生插入突变；
C、使突变的psrA基因与HT66基因组中的基因发生同源重组，根据抗性筛选出阳 性克隆，即可。
优选地，敲除所述绿针假单胞菌HT66基因组中的rpeA基因。
优选地，所述rpeA基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述敲除rpeA基因包括如下步骤：
A、扩增rpeA基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；
B、扩增卡那霉素抗性基因，插入rpeA基因中间，使rpeA基因发生插入突变；
C、使突变的rpeA基因与HT66基因组或敲除psrA基因的HT66基因组中的基因发 生同源重组，筛选阳性克隆，即可。
第二方面，本发明涉及一种上述的用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在制备防 治植物真菌性病害的微生物农药中的用途。
优选地，所述植物真菌性病害包括大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、 柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿或番茄的根腐病，水稻纹枯 病，西瓜枯萎病或甜叶菊斑枯病。
第三方面，本发明涉及一种上述的用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在制备微 生物肥料中的用途。
第四方面，本发明涉及一种吩嗪-1-甲酰胺的制备方法，将上述的用于生产吩嗪-1- 甲酰胺的基因工程菌株发酵、提取后制备得到所述吩嗪-1-甲酰胺。
优选地，所述发酵具体为将所述基因工程菌株在微生物培养基中发酵20～40h，所 述提取具体为以有机溶剂萃取；有机相经浓缩、结晶后获得所述吩嗪-1-甲酰胺。
优选地，所述吩嗪-1-甲酰胺的CAS号为550-89-0。
优选地，所述发酵温度为20～40℃，摇床转速或发酵罐搅拌转速为150～800转/ 分，发酵时间为20～40h。
优选地，所述有机溶剂包括丁酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一种 或几种。
第五方面，本发明涉及一种上述的制备方法制得的吩嗪-1-甲酰胺在制备防治植物真 菌性病害的微生物源农药中的用途。
优选地，所述植物真菌性病害包括大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、 柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿或番茄的根腐病，水稻纹枯 病，西瓜枯萎病或甜叶菊斑枯病。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、用于生产吩嗪-1-甲酰胺的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此 其环境友好，安全可靠。
2、吩嗪-1-甲酰胺的开发成本低：绿针假单胞菌的营养需求不高，稳定性较好，生 产工艺简单易行。
3、本发明中使用的绿针假单胞菌，其野生株液体培养时吩嗪-1-甲酰胺浓度高达 420mg/L，为目前国际上吩嗪-1-甲酰胺产量最高的野生菌株，因此其生防功能强大。
4、本发明的菌剂具有广谱的抗真菌活性，可以用于防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病、 甜叶菊斑枯病或大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、 大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等作物的根腐病。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
图1为吩嗪-1-甲酰胺的核磁共振氢谱图；
图2为吩嗪-1-甲酰胺的核磁共振碳谱图；
图3为吩嗪-1-甲酰胺的分子结构示意图；
图4为绿针假单胞菌HT66基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；
图5为绿针假单胞菌HT66基因工程菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的 技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些 都属于本发明的保护范围。
本发明的绿针假单胞菌HT66(Pseudomonas choloraphis HT66)，该菌株已在中国典 型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编 为：430072，保藏日期为：2013年10月12日，保藏编号为：CCTCC NO∶M 2013467。
实施例1、吩嗪-1-甲酰胺的制备与鉴定
1)绿针假单胞菌菌种的活化：分别配制固体的LB或者KMB培养基；取出冷冻保 藏的绿针假单胞菌HT66，接种固体培养基上面于26～32℃活化48h，然后转种到新的 固体培养基上，继续传代2～3次；
2)绿针假单胞菌的种子制备：配制液体LB或者KMB培养基；挑取一环活化的菌 体，接种到50mL液体培养基(装于250mL三角瓶)中，置于26～32℃的恒温摇床上 震荡培养10～20h，摇床转速为150～5000转/分钟。然后，将该种子液进一步转接到 1000～5000mL的液体培养基中，于相同条件下培养，以获得大量的生长旺盛而且健壮 的种子；
其中，所述LB培养基的组成为：每升培养基中含胰蛋白胨10克，酵母提取物5 克，氯化钠10克，pH7.5；固体培养基为在相应的液体培养基中添加1.2％的琼脂粉。
其中，所述King′sB培养基(KMB)：每升培养基中含胰蛋白胨20克，K2HPO40.392 克，甘油15mL，MgSO40.732克，pH7.2；固体培养基为在相应的液体培养基中添加1.2～ 1.5％的琼脂粉。
3)绿针假单胞菌的发酵培养：配制大体积的液体LB或者KMB培养基，装入发酵 罐中于121℃灭菌20min；待发酵罐温度冷却到26～32℃时，以1～5％的比例接入绿针 假单胞菌的种子液；然后于26～32℃下通气搅拌培养，发酵罐搅拌桨转速为150～1000 转/分钟，通气比为1∶0.5～1(VVM)，发酵时间为30～40h。
发酵培养基的组成并无特殊要求，其中碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖或者甘油，氮源 可以为蛋白胨、豆粕、肉膏、玉米浆等，另外添加适量的磷酸盐和硫酸镁等无机盐，发 酵液的pH值保持在7.0～8.0。
4)吩嗪-1-甲酰胺的提取：在发酵液中加入0.1～0.5‰的破乳剂如十二烷基溴化吡 啶，然后按照1∶1的比例加入丁酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯等有机溶 剂中的一种，进行充分的震荡或搅拌，待静置分层后分离有机溶剂相；于薄膜浓缩设备 中减压浓缩，并逐步降低温度至吩嗪-1-甲酰胺析出。
5)使用傅里叶红外光谱仪对高纯度产物做红外光谱，红外光谱的数据清晰的显示 了NH基团、酰胺基团以及苯环骨架的存在，同时也显示了产物中没有羧基。使用核磁 共振波谱仪(AvanceIII400MHz)进行分析。图1为吩嗪-1-甲酰胺的核磁共振氢谱图， 氢谱的频率是400MHz，由图1可知，所有氢原子的化学位移分别是： H-2(d8.46，dd)，H-3(d8.07，dd)，H-4(d8.86，dd)，H-6(d8.38，ddd)，H-7(d8.00，ddd)，H-8(d8.02，ddd)， H-9(d8.29，ddd)。图2为吩嗪-1-甲酰胺的核磁共振碳谱图，碳谱的频率是100MHz，溶剂 是氘代甲醇。由图2可知，所有碳原子化学位移分别为： C-1.128.93ppm，C-2，133.68ppm，C-3，129.23ppm，C-4，134.89ppm，C-a，141.84ppm，C-b，143.06p pm，C-6，131.89ppm，C-7，129.44ppm，C-8，129.76ppm，C-9，131.42ppm，C-c，142.93ppm，C-d，140. 66ppm，C-11，167.50ppm，与以下的PCN结构式完全吻合，见图3。
图3为吩嗪-1-甲酰胺的分子结构示意图。由图3可知，该化合物是一个含两个氮原 子的杂环化合物，属于吩嗪类衍生物。同时，在1位碳原子上有一个酰胺基团，可能与 其杂环稳定性及抗菌活性有密切的关系。
实施例2、rpeA基因体外突变体的构建
以质粒pUCGM为模板，扩增其中的庆大霉素抗性基因aacC1。根据绿针假单胞菌 HT66基因组中rpeA序列设计引物 5′-TATTAATCTAGACCTGTTCAGCCGTTCCGAAT-3′(XbaI，如SEQ ID NO.3)和 5′-AATTATGAATTC-CCACGCCCAGTTGATCCT-3′(EcoRI，如SEQ ID NO.4)，以该基因 组DNA为模版，扩增基因组中的相应片段。将PCR产物与pMD19T载体相连接、转化 大肠杆菌后提取质粒验证，获得质粒pMD19TA和pMD19TG，将这两种质粒分别使用 ClaI酶切，过柱纯化，使用T4连接酶连接，获得质粒pMD19TAG，使用EcoRI和XbaI 对穿梭质粒pEX18Tc和pMD19TAG进行双酶切，并且将酶切产物过柱纯化，将获得的 突变质粒得到体外突变质粒pEX18TcAG转化大肠杆菌SM10。
充分活化含有rpeA体外突变质粒的SM10菌株，接种于含有四环素20mg/L，庆大 霉素40mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的HT66菌接种于 LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，分别用100uL 重悬菌体，并将两种细菌混在一起。取无菌的滤纸片于普通LB平板上，将混匀的菌体 涂布在滤纸片上，37℃培养24h。刮取菌体，重悬于100uLLB培养基中，并涂布在含有 蔗糖15％，壮观霉素100mg/L，庆大霉素40mg/L的LB平板中。28℃倒置培养3d，将 长出来的菌落用无菌牙签分别依次点在含壮观霉素100mg/L，四环素150mg/L的LB平 板和含壮观霉素100mg/L，庆大霉素40mg/L的LB平板上，在第一个平板上不能生长 而在第二个平板上能够正常生长的菌落即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66菌的 rpeA基因中插入了长约1KMB的庆大抗性基因，并命名为HT66ΔrpeA，而野生型中则 无此基因。
实施例3、psrA基因体外突变体的构建
以pBS(kan)质粒为模板，PCR扩增得到1.0KMB的kan基因(卡那抗性基因)。根据 绿针假单胞菌HT66基因组中psrA基因的序列设计引物， 5’-TTAAGCTTACGGTCGGGTCGTCGCTGCATA-3’(HindIII，如SEQ ID NO.5)和 5’-AAGAGCTCCGCTGTTCATGCCACGGATAAAG-3’(SacI，如SEQ ID NO.6)。以HT66 基因组DNA为模板，PCR扩增得到1.5KMB的psrA基因，使用HindIII和SacI酶切后， 克隆至pEX18Tc质粒的相同位点，得到重组质粒pEX18Tc-psrA。转入E.coli DH5α的感 受态细胞，使其具有四环素抗性。
将kan基因和重组质粒pEX18Tc-psrA分别用SphI酶切，割胶回收后，使用T4DNA 连接酶进行连接过夜。连接产物直接42℃热激转化E.coli DH5α的感受态细胞。转化过 的感受态细胞于37℃，180转/分钟复苏1h，然后5000转/分钟离心5min，去除上清， 用100uLLB培养基重悬菌体，并涂布在含有卡那霉素50mg/L和四环素20mg/L抗性的 LB平板上筛选阳性的重组质粒pEX18Tc-psrA-kan。使用热激法将其转入E.coli SM10 的感受态细胞中，通过含有四环素20mg/抗性筛选得到含有pEX18Tc-psrA-kan质粒的 E.coli SM10细胞。
将充分活化的HT66细胞接种于LB培养基中，28℃，180转/分钟培养12h。接种 导入了pEX18Tc-psrA-kan质粒的E.coli SM10细胞于四环素20mg/L，卡那霉素50mg/L 的LB培养基中，37℃，180转/分钟培养12h。分别1mL绿针假单胞菌HT66菌液和2mL 含pEX18Tc-psrA-kan质粒的E.coli SM10细胞，5000转/分钟离心5min，用LB培养基 洗涤菌体3次。各使用100uL培养基重悬菌体，并将HT66菌液与含pEX18Tc-psrA-kan 质粒的E.coliSM10细胞菌体混合在一起，37℃静置培养1h。取灭菌的滤纸片于普通LB 平板上，分别将混合菌液小心的涂布在滤纸片上，将平板置于37℃培养箱中培养24h， 完成质粒从SM10菌株到HT66菌株的转移。用枪头刮取滤纸片上的菌体，重悬于100uL 的LB培养基中，将混合菌液全部涂布于含蔗糖15％，壮观霉素100mg/L，卡那霉素 50mg/L的LB平板上。28℃倒置培养3d。将长出来的菌落用无菌牙签分别依次点在含 壮观霉素100mg/L，四环素150mg/L的LB平板和含壮观霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L 的LB平板上，在第一个平板上不能生长而在第二个平板上能够正常生长的菌落即为同 源重组成功的菌落。PCR验证重组菌的psrA基因中插入了长约1KMB的卡那抗性基因， 将其命名为HT66ΔpsrA，而野生型中则无此基因。
实施例4、rpeA和psrA双突变株HT66ΔrpeAΔpsrA的构建
将充分活化的HT66ΔrpeA细胞接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。接 种导入了pEX18Tc-psrA-kan质粒的E.coli SM10细胞于四环素20mg/L，卡那霉素50mg/L 的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。分别取1mL两种菌液，5000转/分离心5min， 用LB培养基洗涤菌体3次。各使用100uL重悬菌体，并将两种菌体混合在一起，37℃ 静置培养1h。所有操作应尽量轻柔，以减少对菌体鞭毛的影响。取灭过菌的滤纸片于普 通LB平板上，将混合菌液小心的涂布在滤纸片上，将平板置于37℃培养箱中培养24h， 完成质粒从SM10菌株到HT66的转移。用枪头刮取滤纸片上的菌体，重悬于100uLLB 培养基中，将混合菌液全部涂布于含蔗糖15％，壮观霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L 的LB平板上。28℃倒置培养3d。将长出来的菌落用无菌牙签分别依次点在含壮观霉素 100mg/L，四环素150mg/L的LB平板和含壮观霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L的LB 平板上，在第一个平板上不能生长而在第二个平板上能够正常生长的菌落即为同源重组 成功的菌落。PCR验证重组菌的psrA基因中插入了长约1KMB的卡那抗性基因，将其 命名为HT66ΔrpeAΔpsrA而野生型中则无此基因。
实施例5、基因工程菌HT66ΔrpeAΔpsrA中PCN的生物合成
将活化后的绿针假单胞菌HT66以及其基因工程菌株HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA、 HT66ΔrpeAΔpsrA，分别接种于KMB培养基中，置于28℃的恒温摇床上(180转/分) 培养至光密度(OD600)为0.5～2.0之间时，将上述菌液以1～10∶100的体积比，加入 到新配制的KMB培养基中，24～30℃进行震荡培养，摇床转速100～300转/分钟，培 养时间为24～72h后收获菌液。取发酵液0.5mL，加入3mL乙酸乙酯，充分振荡混匀， 6000转/分离心5min，取0.2mL有机相，蒸发后用甲醇溶解。使用HPLC检测发酵液中 吩嗪-1-甲酰胺产量。
HPLC检测条件：
流动相为乙腈-25mM乙酸铵，色谱柱为WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5 μm；4.6×250mm，Shimadzu，Japan)，检测波长254nm，检测条件：0-2min，8％乙腈 -92％25mM乙酸铵，2-20min，乙腈浓度从8％升至60％，乙酸铵浓度从92％下降至40％， 20-21min，8％乙腈-92％25mM乙酸铵。
图4为绿针假单胞菌HT66的不同基因工程菌与野生株中吩嗪-1-甲酰胺的产量变化 图。由图4可知，rpeA基因的敲除导致PCN的产量由野生株的424mg/L上升到703mg/L， 提高了1.66倍；psrA基因的敲除导致PCN的产量由野生株的424mg/L上升到1300mg/L， 提高了3.06倍；两个基因的双敲除突变株中，PCN的产量达到1800mg/L，与野生株相比 提高了4.24倍。
实施例6、假单胞菌HT66及基因工程菌HT66ΔrpeAΔpsrA生长曲线的测定
接种充分活化的假单胞菌HT66及基因工程菌到新鲜的KMB培养基中，培养16小 后测定菌液的OD600值，以灭菌后的新鲜培养基按一定比律稀释该菌液到OD600值为 0.02。分别取四株绿针假单胞菌的稀释液200μL加入到96孔板中，每个菌株进行5个 平行实验，置于全自动微生物生长曲线分析仪(Bioscreen，USA)中培养，培养温度为 28℃，以180转/分的速度摇动96孔板。每隔3h测定一次菌液OD600值，共测定72h。
图5为绿针假单胞菌HT66的野生株及不同基因工程菌的生长曲线。由图5可知， rpeA基因的敲除对菌体的生长不大；psrA基因的敲除使菌体浓度明显增加；但是，在 rpeA和psrA双敲除突变株中，菌体浓度显著低于其它菌株，表明这两个基因对菌体的 生长有着复杂的影响。
实施例7、吩嗪-1-甲酰胺的抗真菌效果
向马铃薯葡萄糖培养基中，分别加入一定量吩嗪-1-甲酰胺，配制成直径为9cm、浓 度分别为0.05mg/L和0.10mg/L的铃薯葡萄糖固体培养基平板，不添加吩嗪-1-甲酰胺的 葡萄糖培养基平板为对照，每个处理设置三个重复；在空白马铃薯葡萄糖培养基上预培 养水稻纹枯病菌、终极腐霉、甜叶菊斑枯病菌和西瓜枯萎病菌五天，在实验组和对照组 平板中央接入直径为8mm的病原菌菌丝块，置于28℃恒温培养箱中培养；5天后，采 用十字交叉法分别测定接种在各种马铃薯葡萄糖培养基中的菌块的直径。抑菌率即对真 菌生长的抑制效率的计算方法为：抑菌率＝(对照菌斑平均直径-实验菌斑平均直径)/ (对照菌斑平均直径-初始菌斑直径)×100％，结果见表1。
表1绿针假单胞菌HT66产物PCN的抑菌活性表
由表1可知，0.05mg/mL的吩嗪-1-甲酰胺(PCN)对水稻纹枯病菌、终极腐霉、甜 叶菊斑枯病菌和西瓜枯萎病菌的抑菌活性分别为47.98％、68.48％、57.39％、70.34％。 0.10mg/mL的PCN对水稻纹枯病菌、终极腐霉、甜叶菊斑枯病菌和西瓜枯萎病菌的抑 菌活性分别为70.29％、88.87％、88.88％、99.72％。
其中，所述马铃薯葡萄糖培养基中含有的组分重量百分比为：马铃薯20％、葡萄糖 2％琼脂1.5％、余量为水。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上 述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改， 这并不影响本发明的实质内容。