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1、(10)申请公布号 CN 101955530 A (43)申请公布日 2011.01.26 CN 101955530 A *CN101955530A* (21)申请号 201010529394.1 (22)申请日 2010.11.02 C07K 16/06(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 刘永杰 陆承平 焦大为 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 3。
2、2200 代理人 张素卿 (54) 发明名称 鲫鱼 IgM 提取纯化工艺 (57) 摘要 本发明涉及鲫鱼 IgM 提取纯化工艺， 一种将 鲫鱼 IgM 从鲫鱼血清中与其它化合物相分离， 从 而获得高纯度鲫鱼 IgM 的方法。包括制备鲫鱼血 清 ； 通过 33% 到 50% 饱和硫酸铵分级沉淀法对鲫 鱼血清进行粗提 ； 通过 Macro-prephighQ 强阴离 子交换柱从鲫鱼血清饱和硫酸铵分离沉淀提取物 中进一步提取鲫鱼 IgM ； 经离子交换层析获得的 样品进一步通过 SephacrylTMS-300 葡聚糖凝胶层 析柱进行精细分离纯化。 从5mL鲫鱼血清 （蛋白浓 度 60mg/mL) 。
3、中纯化得到 4.4mgIgM， 得率为 1.4%， 经SDS-PAGE检测、 蛋白扫描仪分析， 纯度达96%以 上。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 CN 101955530 A1/1 页 2 1. 一种鲫鱼 IgM 提取纯化的工艺， 包括 ： 1） 制备鲫鱼血清 ； 2） 通过质量比 33% 到 50% 饱和硫酸铵分级沉淀法对鲫鱼血清进行粗提 ； 3） 通过强阴离子交换柱Macro-prep high Q Cartridge从鲫鱼血清饱和硫酸铵分离沉 淀的提取物中进一步提取鲫鱼 IgM ； 。
4、4） 经离子交换层析获得的样品进一步通过葡聚糖凝胶层析柱 SephacrylTM S-300 进行 精细分离纯化， 所制得的鲫鱼 IgM 重链和轻链分子量分别约为 79.2kDa 和 25.5kDa。 2. 根据权利要求 1 所述的鲫鱼 IgM 提取纯化工艺， 其特征在于 ： 步骤 2） 所述饱和硫 酸铵分级沉淀法对鲫鱼血清进行粗提方法为 ： 33% 硫酸铵饱和度沉淀时弃沉淀留上清， 50% 硫酸铵饱和度沉淀时留沉淀弃上清。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的鲫鱼 IgM 提取纯化工艺， 其特征在于， 步骤 3） 离子交换 层析从鲫鱼血清饱和硫酸铵粗提物中进一步提取 IgM 使用的中高压层。
5、析系统， 离子交换剂 为 Macro-prep high Q， 柱床直径 柱床高度为 2.5cm10cm ； 在 Macro-prep high Q 离 子交换层析过程中， 使用的缓冲液为 ： A 液 ： 30mM Na3PO4， pH 7.0 ； B 液 ： 30mM Na3PO4 + 1.6M NaCl， pH 7.0 ； 梯度洗脱过程中， 鲫鱼 IgM 被洗脱下来的缓冲液浓度为体积 90% 的 A 液 +10% 的 B 液。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的鲫鱼 IgM 提取纯化工艺， 其特征在于， 步骤 4）凝胶 过滤层析进一步提取鲫鱼 IgM 使用的中高压层析系统， 凝胶过滤层。
6、析中使用的凝胶介质 为 SephacrylTM S-300， 柱床直径 柱床高度为 1.5cm80cm， SephacrylTM S-300 High Resolution 凝胶过滤层析缓冲液为 30mM Na3PO4+ 0.15M NaCl， pH 7.4。 5. 权利要求 1-4 之一所述的鲫鱼 IgM 提取纯化的工艺所获得的产品。 权 利 要 求 书 CN 101955530 A1/5 页 3 鲫鱼 IgM 提取纯化工艺 技术领域 0001 本发明涉及一种生物免疫球蛋白的提取纯化方法， 具体地说， 是一种鲫鱼 IgM 提 取纯化工艺。 背景技术 0002 动物的免疫系统是在种系进化过程中。
7、逐步发展起来的， 其中鱼类是最早出现免疫 球蛋白 (Ig) 的动物， 它的免疫系统相对比较原始。尽管鱼类的免疫系统比较原始、 低级， 但 与无脊椎动物相比， 其进化有了重要突破， 已形成包括非特异性免疫应答和特异性免疫应 答在内的相对完善的免疫系统。同其他脊椎动物一样， 鱼类免疫系统包括免疫组织、 免疫 细胞和体液免疫因子三大类。大量的文献证明鱼类能够进行体液和细胞免疫应答， 其中免 疫球蛋白是鱼类特异性体液免疫应答中最主要的介质。与高等脊椎动物相比， 鱼类体液免 疫研究起步较晚， 研究方法也多借助于高等脊椎动物的研究方法。由于鱼类免疫球蛋白在 鱼类免疫学研究中具有重要的作用， 制备高纯度的鱼。
8、类免疫球蛋白对于研究鱼类体液免疫 应答规律、 建立以免疫球蛋白为核心的病原快速诊断和鱼类血清学分析方法具有重要的意 义。 0003 鱼类对抗原刺激的特异性反应主要是通过产生 IgM 来实现的。准确定量血清 IgM 水平， 对研究鱼类疫病防控， 特别是在说明感染后抗体产生以及调查疫苗免疫后抗体生成 情况是非常必要的。如何将鱼类血清 IgM 又快又方便地纯化出来， 成为许多鱼类免疫学家 关心的话题。 一些学者试着采用兽医免疫学上的蛋白纯化方法来纯化鱼类IgM， 采用的方法 包括盐析法、 离子交换法、 凝胶过滤法等。不同方法纯化免疫球蛋白的效率不同， 甚至同一 种方法纯化不同免疫球蛋白的效果也有差异。
9、。 一般来说， 采用盐析法得出的产物纯度不高， 纯化效率和质量极低 ； 离子交换层析往往由于被分离的样品与其它化合物之间等电点等物 理性质相近， 而不能获得较纯的目的样品， 该方法主要适用于蛋白质粗提物的初始纯化 ； 凝 胶过滤层析利用了凝胶的多孔性， 根据溶剂分子的大小进行分离， 因此采用此方法不能分 离分子量近似的蛋白样品。可见， 这几种方法单独使用或者同种方法重复使用都存在一定 的缺陷， 最好联合应用。大量研究证实， 若是已通过离子交换层析柱纯化的蛋白质， 下一步 理想的纯化方法就是凝胶过滤层析， 因为这两种方法可互为补充。但不论采用哪种层析系 统纯化鲫鱼血清， 选择合适的层析介质非常关。
10、键， 比如采用 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶过 滤纯化草鱼血清 IgM 时就发现纯化产物纯度并不高 ( 李亚南 . 嗜水气单胞菌诱导的草鱼免 疫球蛋白分析 J. 动物学报， 2001， 47(2) ： 132-138.)。总之， 要想获得高纯度的鲫鱼 IgM， 需要对多种不同分离技术进行优化组合， 对分离条件进行优化。 发明内容 0004 技术问题 0005 本发明的目的在于提供一种提取纯化鲫鱼 IgM 的工艺方法， 为进一步研究鱼类体 液免疫应答规律、 建立以免疫球蛋白为核心的病原快速诊断和鱼类血清学分析方法奠定基 说 明 书 CN 101955530 A2/5 页 4 础。 0。
11、006 技术方案 0007 本发明是通过以下技术方案实现的， 在本发明中通过饱和硫酸铵分步沉淀结合 Macro-prep high Q 强阴离子交换柱以及 SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶柱层析柱提取纯 化了鲫鱼 IgM， 最终获得了高纯度的鲫鱼 IgM。本发明的步骤包括 ： 0008 1. 制备鲫鱼血清 ； 0009 2. 通过 33到 50饱和硫酸铵分级沉淀法对鲫鱼血清进行粗提， 透析除盐 ； 0010 3.通过Macro-prep high Q强阴离子交换柱从鲫鱼血清饱和硫酸铵分级沉淀提取 物中进一步提取鲫鱼 IgM ； 0011 4. 经离子交换层析获得的样品进一步通过 。
12、SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶层析柱 进行精细分离纯化。 0012 步骤 2) 所述饱和硫酸铵分级沉淀法对鲫鱼血清进行粗提的方法为 ： 33硫酸铵 饱和度沉淀时， 弃沉淀留上清， 进一步以 50硫酸铵饱和度沉淀时留沉淀弃上清。步骤 3) 离子交换层析从鲫鱼血清饱和硫酸铵粗提物中进一步提取 IgM， 使用中高压层析系统， 离子 交换剂为 Macro-prep high Q， 柱床直径 柱床高度为 2.5cm10cm ； 在 Macro-prep high Q离子交换层析过程中， 使用的缓冲液为 ： A液 ： 30mM Na3PO4， pH 7.0 ； B液 ： 30mM Na3P。
13、O4+1.6M NaCl， pH 7.0 ； 梯度洗脱过程中， 鲫鱼 IgM 被洗脱下来的缓冲液浓度为体积 90的 A 液 +10的 B 液。步骤 4) 凝胶过滤层析进一步提取鲫鱼 IgM， 使用中高压层析系统 ； 凝胶过 滤层析中使用的凝胶介质为 SephacrylTM S-300， 柱床直径 柱床高度为 1.5cm80cm， SephacrylTM S-300 凝胶过滤层析缓冲液为 30mM Na3PO4+0.15M NaCl， pH 7.4。 0013 鲫鱼 IgM 提取纯化工艺所获得的产品， 其重链和轻链分子量分别约为 79.2kDa 和 25.5kDa。 附图说明 0014 图1为鲫。
14、鱼血清50饱和硫酸铵提取物经Macro-prep high Q强阴离子交换层析 柱分离， 出现 5 个蛋白吸收峰， 经 SDS-PAGE 检测， 目的蛋白 IgM 在第二峰。 0015 图 2 为经 Macro-prep high Q 强阴离子交换层析柱分离纯化的第二峰经 SephacrylTM S-300葡聚糖凝胶层析柱进一步分离， 出现3个蛋白吸收峰， 经SDS-PAGE检测， 目的蛋白 IgM 在第二峰。 0016 图3中1-4泳道分别为鲫鱼血清、 粗提物及经Macro-prep high Q强阴离子交换层 析柱分离的第二峰、 经 SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶柱层析柱进。
15、一步分离纯化第二峰 IgM 的 SDS-PAGE 图谱， M 为标准蛋白分子质量。 0017 有益效果 0018 本发明通过对所述样品分离介质的优选和工艺的优化， 从而大幅度提高了对所述 样品分离纯化的效率和质量。首先， Macro-prep high Q 强阴离子交换剂与传统的同类介 质相比， 对复杂生物混合物分子具有更高的分辨率、 载量并可承受中压和高流速的特点， 亲 水基质可减少非特异性结合， 巨孔颗粒可提高离子位点的结合以及化学、 机械和热稳定性 ； 其次， SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶的球蛋白分离范围为 1104-1.5106Da， 分辨率较 高， 而鲫鱼 IgM 。
16、分子量为 7105-8105Da， 因此 SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶可有效将目 说 明 书 CN 101955530 A3/5 页 5 的蛋白鲫鱼 IgM 从杂蛋白中分离出来 ； 第三， 由于通过离子交换梯度洗脱获得的粗提样品 中含有高浓度盐缓冲液， 在经 SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化目的蛋白时， 还可以进一步除去高盐。因此， 通过盐析法 - 离子交换层析 - 凝胶过滤层析三种分离方法 的合理有序组织和实施， 实现了由目的样品的粗提、 大量捕获到最后的精提， 从而获得单一 的、 高纯度的目的样品。 0019 本发明在各种不同分离方法实施过程中。
17、， 对分离目的样品的条件进行了大量的摸 索和优化， 如不同分离阶段流动相的盐浓度、 速度等进行了优化， 将目的样品与其它化合物 完全分离。 因此， 本发明首先选择采用Macro-prep high Q强阴离子交换剂可迅速大量捕获 目的蛋白并去除绝大多数杂质， 使所述样品得到初步纯化， 从而有效提高了纯化的速度和 效率 ； 然后将Macro-prep high Q强阴离子交换剂分离获得的样品再经SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶进一步分离去除其余杂质， 使所述样品得到进一步精提纯化， 从而获得纯度较 高的样品。本发明通过对所述样品分离介质的优选和工艺的优化， 不仅可以有效提高纯化 的。
18、效率和产量， 而且可以获得纯度较高的目的样品。 具体实施方式 0020 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规方法， 例如蛋白质技术 手册 ( 汪家政， 范明主编 . 科学出版社， 2000) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。 0021 1. 鲫鱼 IgM 提取纯化 0022 (1) 鲫鱼血清的制备 0023 用 75的酒精棉擦拭鲫鱼体表， 进行消毒， 然后尾静脉采血。加入灭菌的试管中， 置 37温箱 1h， 然后 4静置过夜， 使血清充分析出。次日， 4， 3000g/min 离心 20min， 用 微量移液器吸取上清液， 分装到 1.5mL 的 EP 管中， -。
19、20保存备用。 0024 (2) 饱和硫酸铵分级沉淀 0025 将5mL鲫鱼血清与灭菌PBS缓冲液等量稀释， 冰浴条件下， 用磁力搅拌器边缓慢搅 拌边逐滴加入5mL pH7.4的饱和硫酸铵(28氨水调pH)， 使最终饱和度为33， 4静置过 夜 ； 次日， 4， 10,000g/min 离心 20min 后， 弃沉淀留上清。上清在冰浴条件下， 用磁力搅拌 器边缓慢搅拌边逐滴加入 5mL pH7.4 的饱和硫酸铵， 使最终饱和度为 50， 4静置过夜 ； 次日， 4条件下 10,000g/min 离心 15min 后， 弃上清， 沉淀用 5mL 灭菌 PBS 重悬， 装入预处 理好的透析袋， 以。
20、 30mMNa3PO4， pH 7.0 缓冲液 4透析 48h 除盐， 24h 内换液 3 4 次， 直至 用 1 BaCl2检查透析液呈阴性为止。透析产物用 0.22m 的滤膜过滤， 分装于 2mL 的灭菌 EP 管中， -20保存备用。 0026 (3)Macro-prep high Q 强阴离子交换层析 0027 装柱及平衡 ： 装柱前先用去离子水冲洗玻璃层析柱 (2.5cm30cm， Bio-Rad 公 司 )， 沥干后垂直安装固定于中高压层析系统 (Bio-Rad 公司 ) 固定架上 ； 将 Macro-prep high Q 强离子交换剂用 30mM Na3PO4， pH 7.0 。
21、进行平衡、 减压处理后， 缓慢引流灌入玻璃 层析柱中， 以 4mL/min 的流速加压平衡柱床， 直至体积不再改变为止， 以提高其分辨率。 Macro-prep high Q强离子交换柱装填好后再以平衡缓冲液30mM Na3PO4， pH 7.0进行平衡， 直到 UV 基线平稳即可使用， 柱床直径 柱床高度为 2.5cm10cm。 说 明 书 CN 101955530 A4/5 页 6 0028 加样及洗脱 ： 将 2mL 处理完毕的样品用进样针推注到进样环中， 选择自动洗脱， 进行程序编写。自动洗脱程序如下 ： 首先， 以 2mL/min 流速将样品引入柱床， 再以 2mL/min 的流速，。
22、 30mM Na3PO4， pH 7.0 的洗脱缓冲液 80mL 洗脱未结合蛋白 ； 其次， 以 4mL/min 流 速， 90 30mMNa3PO4， pH 7.0 和 10 30mMNa3PO4+1.6M NaCl， pH 7.0 的洗脱缓冲液 80mL 洗脱目的蛋白 IgM， 并进行收集 ； 最后， 以 4mL/min 流速， 84 30mMNa3PO4， pH 7.0 和 16 30mMNa3PO4+1.6M NaCl， pH 7.0 的洗脱缓冲液 80mL 洗脱非目的蛋白。 0029 再生及平衡 ： 以 4mL/min 流速， 100 30mM Na3PO4+1.6M NaCl， p。
23、H 7.0 洗脱缓冲液 80mL 洗脱结合较紧的非目的蛋白 ； 最后， 以 4mL/min 流速， 100 30mM Na3PO4， pH 7.0 洗脱 缓冲液 80mL 洗脱再次平衡柱床。 0030 (4)Sephacryl S-300 葡聚糖凝胶过滤层析 0031 装柱及平衡 ： 装柱前先用去离子水冲洗玻璃层析柱 (1.5cm100cm， Bio-Rad)， 沥 干后垂直安装固定于中高压层析系统 (Bio-Rad 公司 ) 固定架上 ； 将 SephacrylTM S-300 葡 聚糖凝胶用 30mM Na3PO4， pH 7.0 进行平衡、 减压处理后， 缓慢引流灌入玻璃层析柱中， 以 。
24、2mL/min 的流速加压平衡柱床， 直至柱床体积不再改变为止， 以提高其分辨率。SephacrylTM S-300 葡聚糖凝胶层析柱装填好后， 再以 30mMNa3PO4+0.15MNaCl， pH 7.4 平衡缓冲液进行平 衡， 直到 UV 基线平稳即可使用， 柱床直径 柱床高度为 1.5cm80cm。 0032 加样及洗脱 ： 将 1mL 处理完毕的样品用进样针推注到进样环中， 选择自动洗脱， 进 行程序编写。 自动洗脱程序如下 ： 首先， 以0.5mL/min流速将样品引入柱床， 再以0.5mL/min 的流速 30mM Na3PO4， pH 7.0 洗脱缓冲液 200mL 进行洗脱并。
25、收集 ； 最后， 以 0.5mL/min 流速 30mM Na3PO4， pH 7.0 平衡缓冲液 200mL 进行再次平衡柱床。 0033 样品浓缩及保存 ： 将洗脱下来的目的蛋白装到超滤浓缩管 ( 截留量 100KDa， Millipore 公司 ) 中， 4离心 5min， 3500g/min。浓缩后的样品分装到 1.5mL EP 管中， 1mL/ 管， -20保存。 0034 经过多步分离纯化， 从5mL鲫鱼血清(蛋白浓度60mg/mL)中纯化得到4.4mg IgM， 得率为 1.4， 经 SDS-PAGE 检测、 蛋白扫描仪分析， 纯度达 96以上。 0035 2. 鲫鱼 IgM 的。
26、检测 0036 SDS-PAGE分析 ： 配制12的分离胶(16mL ddH2O， 2.0mL 30丙烯酰胺溶液， 1.3mL 1.5M Tris 缓冲液 pH 8.8， 0.05mL 10 SDS， 0.05mL 10过硫酸铵， 0.002mL 四甲基乙二 胺 ) 和 5的浓缩胶 (1.4mL ddH20， 0.33mL 30丙烯酰胺溶液， 0.25mL 1M Tris 缓冲液 pH 6.8， 0.02mL 10SDS， 0.02mL 10过硫酸铵， 0.002mL四甲基乙二胺)。 样品添加上样缓冲 液沸水煮 10min。浓缩胶电压 80V， 分离胶电压 120V。电泳 2.5h。考马斯亮兰。
27、染色 2h， 脱色 液脱色。 0037 结果观察 ： 仅在约79.2kDa、 25.5kDa处有两条明显的条带出现， 即鲫鱼IgM的重链 及轻链。 0038 综上所述， 本发明鲫鱼 IgM 的提取纯化工艺， 可获得高纯度的鲫鱼 IgM， 对于研究 鱼类体液免疫应答规律、 建立以免疫球蛋白为核心的病原快速诊断和鱼类血清学分析方法 具有重要的意义。本发明有以下创新点 ： 1. 通过盐析法 - 离子交换层析 - 凝胶过滤层析三 种分离方法合理有序的组织和实施， 实现了目的样品由粗提、 大量捕获到最后精提 ； 2. 本 发明使用的 Macro-prep high Q 强阴离子交换剂对复杂生物混合物分子具有更高的分 说 明 书 CN 101955530 A5/5 页 7 辨率、 更大的载量， 并可承受中压和高流速的特点 ； 3. 凝胶过滤层析中使用的凝胶介质为 SephacrylTM S-300， 分辨率较高， 其对蛋白分离范围 1104-1.5106Da， 可有效分离鲫鱼 IgM。 本发明通过对所述样品分离介质的优选和工艺的优化， 不仅可以有效提高纯化的效率 和和产量， 而且可以获得纯度较高的目的样品。 说 明 书 CN 101955530 A1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101955530 A2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 。