发明领域
本发明涉及生物技术领域，特别是通过色谱方法从细胞培养收获物中纯化肠道病毒71型（EV71）的方法。
背景技术
手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒引起的一种急性传染病，主要通过密切接触或消化道传播，多发生于10岁以下的婴幼儿，以手、足、口腔等部位皮肤粘膜的皮疹、疱疹、溃疡为典型表现，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。该病自1957年首次报道以来，许多国家曾多次流行，我国自1981年在上海发现本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东等十几个省（市）均有报导。二十一世纪初以来，我国报告的手足口病患者逐年递增，该病已经对学龄前儿童的健康和生命造成严重的危害，我国卫生部于2008年5月2日起，将手足口病列为丙类传染病管理。大量的流行病学研究表明，肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是引发手足口病的主要病原体之一，而且重症病例往往由EV71病毒感染引起。肠道病毒71型属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员，EV71病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径大约在27nm，核酸为单股正链RNA（messenger-zctive RNA）。EV71分为A、B、C等三个基因型，其中A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亚型。几年来在我国分离的EV71病毒绝大部分属于C4亚型。迄今为止，尽管该病毒在我国引起较多的发病，但有效的特异性疫苗尚未上市。
在疫苗研究及其它应用研究中，肠道病毒多采用非洲绿猴肾细胞（Vero）或者人二倍体细胞培养。从细胞培养中收集到的病毒培养液不仅含有所需要的病毒抗原，而且还含有培养过程中的杂质，例如宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸，牛血清和抗生素等。病毒抗原的纯化是研究和生产中的一个关键问题。一个好的病毒抗原工艺应该去除各种培养过程中带来的杂蛋白、脱氧核糖核酸
（Deoxyribonucleic acid，DNA）、内毒素及其它杂质，同时应具有很好的抗原回收率，并且易于自动化。
传统的肠道病毒类疫苗纯化多采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀、凝胶过滤层析等方法。随着国家对疫苗安全性进一步重视，特别对于从连续传代和异倍体细胞系获得的疫苗产品而言，允许的细胞DNA最大限制量为100 pg/剂。传统的纯化方法已越来越难满足疫苗产品对细胞DNA限制量的要求，其它方法例如添加核酸酶和鱼精蛋白处理可以去除DNA，但是不仅成本昂贵，而且也存在着最终产品中需要检测添加物残留的问题。因此，需要摸索一种更有效的病毒纯化方法以满足要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种从细胞培养物中直接纯化EV71病毒，最终获得低残留高纯度的EV71病毒纯化液。所得的病毒纯化液可以用于手足口病灭活疫苗的制备，同时可以用于诊断试剂中参比抗原和抗体的制备，并适用于小型研究和大规模生产。
本发明包括澄清病毒的细胞培养物，随后进行超滤浓缩病毒，再使用凝胶过滤层析和阴离子交换层析纯化病毒，连续层析步骤具有纯化病毒且避免层析缓冲液更换、避免pH值和电导率调整的优点，所制备的病毒纯化液具有低宿主蛋白和宿主DNA残留的优点。该方法制备的EV71纯化液可用于手足口病灭活疫苗的制备，同时可以用于诊断试剂中参比抗原和抗体的制备。
本发明肠道病毒71型（EV71）纯化方法，是从细胞培养物中直接纯化EV71病毒，澄清病毒的细胞培养物，随后进行超滤浓缩病毒，再使用凝胶过滤层析和阴离子交换层析纯化病毒。
具体步骤以下：
⑴提供含高滴度EV71病毒的细胞培养物；
⑵离心或过滤澄清病毒的细胞培养物；
⑶超滤浓缩病毒悬液；
⑷凝胶过滤层析纯化病毒悬液；
⑸阴离子交换层析纯化病毒悬液。
该方法制备的EV71纯化液可用于手足口病灭活疫苗的制备，同时可以用于诊断试剂中参比抗原和抗体的制备。
本发明病毒的细胞培养物可由细胞工厂或生物反应器产生。
本发明病毒的细胞培养物其细胞株为适用于EV71病毒培养的细胞，包括非洲绿猴肾细胞（Vero）和人胚肺二倍体细胞。
本发明使用离心或过滤技术澄清细胞培养物,采用5000～10000g，2～8℃离心10～30分钟；或采用2.5μM和0.45μM孔径的过滤器进行两次过滤。
本发明在步骤⑴中感染细胞的EV71病毒毒株分离至临床病人标本，并且在细胞株上进行了适应性传代，细胞株为适用于EV71病毒培养的任何细胞，就EV71病毒而言，优选为非洲绿猴肾细胞（Vero）和人胚肺二倍体细胞（KMB17）。培养方式包括细胞工厂和生物反应器。细胞培养物可以是细胞培养上清，也可以是细胞裂解产物。病毒收获产物经1:1000～1:10000（V/V）的甲醛37℃灭活3～12天。病毒灭活也可以在病毒纯化以后进行。
在步骤⑵中可以使用离心或过滤技术澄清细胞培养物；a)离心澄清，优选的方法是以5000～10000g离心力在2～8℃离心10～30分钟，收取上清，即为病毒澄清液；b) 过滤澄清，优选的方法是先通过2.5μM孔径的表面过滤器进行预过滤；然后通过具有0.45μM孔径的过滤器进行再次过滤。滤过液即为病毒澄清液。
在步骤⑶中，采用超滤浓缩病毒悬液的超滤膜的截留分子量优选100KD～500KD，浓缩倍数为30～50倍，用缓冲液洗滤2～3次，获得病毒浓缩液。
在步骤⑷中，病毒浓缩液采用柱层析纯化，凝胶过滤层析采用的介质优选为Sepharose 4 Fast Flow或Sephacryl S-400 HR，平衡缓冲液优选pH6.5－7.5的磷酸盐缓冲液（PBS），紫外吸收波长280nm、254nm测吸收值，收集病毒抗原峰。
在步骤⑸中，凝胶过滤层析纯化的病毒液继续用阴离子交换层析纯化，采用的介质优选为SOURCE 30 Q或Q Sepharose XL。平衡缓冲液优选pH7.5～8.0的20mM三羟甲基氨基甲烷（Tris）；洗脱缓冲液优选pH7.5～8.0的20mM Tris，含0.1～1.0M的氯化钠。紫外吸收波长280nm、254nm测吸收值，收集病毒抗原峰。
本发明制备的EV71病毒液必须是经过灭活的，可以对病毒的细胞培养收获液灭活后进行纯化，也可以在纯化后再进行灭活。
纯化的EV71病毒液可根据用途进行后续处理，例如除菌过滤、灭活后添加稳定剂或佐剂等制备疫苗，免疫动物制备抗体等。
本发明的优点在于：
⑴工艺易于放大，可大规模处理细胞工厂或生物反应器生产的大量病毒液，能满足手足口病灭活疫苗的生产需求，病毒抗原回收率高且工艺稳定，重复性好；
⑵本发明制备的EV71病毒纯化液用于疫苗生产，具有无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留低，病毒灭活完全，安全性好；
下面的示例通过一些本发明的具体实施方案来进一步阐述本发明的内容，但并不是要将本发明的范围局限在这些实例中。
附图说明
图1 EV71病毒浓缩液凝胶过滤层析图谱
图2 EV71病毒浓缩液阴离子交换层析图谱
图3 EV71病毒精纯液HPLC－TSK4000色谱图
图4 EV71病毒精纯液SDS-PAGE分析图谱
图5 EV71病毒精纯液透射电镜图谱。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围
实施例1
1）离心澄清：根据细胞培养物的体积选择合适的离心机及转子，以9000g离心力在4℃离心30分钟，合并离心上清，即为病毒澄清液；
2）超滤浓缩
将装上适宜数目（根据需要处理的样品数量而定）100KD～500KD膜包的超滤系统用0.5M氢氧化钠（NaOH）以适宜的压力（进口压20～30psi，回流压力8psi，透过口压力0psi）和流速（1～3LPM）冲洗60分钟，然后用5倍体积的注射用水清洗系统以去除残留的NaOH，再用PBS冲洗至pH值中性；将上述澄清后的病毒液用此超滤系统浓缩至原体积的1/30～1/50，洗滤2～3次，最后得到EV71病毒浓缩液。
3）凝胶过滤层析
将Sephacryl S-400 HR装入层析柱内，以1%丙酮测柱效合格后，用0.5MNaOH以20cm/h的流速清洗层析柱四个柱体积，保证作用时间2小时，以进行消毒和去除内毒素，最后用PBS缓冲液平衡层析柱至pH值和电导值稳定时为止。将实施例2中所获得的EV71病毒浓缩液缓慢加入层析柱内，上样量为层析柱总体积
的5～10%左右。上样完毕后，以60cm/h流速用PBS连续洗脱，分部收集洗脱液。
4）阴离子交换层析
将Source 30 Q凝胶装入层析柱内，以1%丙酮测柱效合格后，用1M NaOH正反方向清洗四个柱体积以上，以进行消毒和去除内毒素，最后用0.02MTris(pH7.5)缓冲液平衡层析柱至pH值和电导值稳定时为止0。
将所获得的病毒抗原峰用0.02M Tris (pH7.5)缓冲液适当稀释以调节其离子强度，然后缓慢加入层析柱内，上样量为层析柱总载量的50～70%左右。上样完毕后，用0.02M Tris (pH7.5)洗脱2个柱体积，再用0.02M Tris (pH7.5)和0.02M Tris 1M 氯化钠（pH7.5)连续洗脱，分部收集洗脱液。
根据对纯化前后进行蛋白质含量和抗原含量的测定，计算出杂蛋白去除率和抗原回收率。
纯化结果：
抗原回收率 72.3%
杂蛋白去除率 98.2%
最终获得的即为EV71病毒精纯液，可进行后续的无菌过滤、灭活和添加稳定剂等步骤以适用于不同用途。
实施例2
1）过滤澄清：优选的方法是先通过2.5μM孔径的表面过滤器进行预过滤；然后通过具有0.45μM孔径的过滤器进行再次过滤。滤过液即为EV71病毒澄清液。
2）超滤浓缩
将装上适宜数目（根据需要处理的样品数量而定）100KD～500KD膜包的超滤系统用0.5M氢氧化钠（NaOH）以适宜的压力（进口压20～30psi，回流压力8psi，透过口压力0psi）和流速（1～3LPM）冲洗60分钟，然后用5倍体积的注射用水清洗系统以去除残留的NaOH，再用PBS冲洗至pH值中性；将上述澄清后的病毒液用此超滤系统浓缩至原体积的1/30～1/50，洗滤2～3次，最后得到EV71病毒浓缩液。
3）凝胶过滤层析
将Sepharose 4 Fast Flow装入层析柱内，以1%丙酮测柱效合格后，用0.5M NaOH以20cm/h的流速清洗层析柱四个柱体积，保证作用时间2小时，以进行消毒和去除内毒素，最后用PBS缓冲液平衡层析柱至pH值和电导值稳定时为止。
将上述所获得的EV71病毒浓缩液缓慢加入层析柱内，上样量为层析柱总体积的
5～10%左右。上样完毕后，以100cm/小时流速用PBS连续洗脱，分部收集洗脱液。
4）阴离子交换层析
将Q Sepharose XL凝胶装入层析柱内，以1%丙酮测柱效合格后，用1M NaOH正反方向清洗四个柱体积以上，以进行消毒和去除内毒素，最后用0.02MTris(pH7.5)缓冲液平衡层析柱至pH值和电导值稳定时为止。
将所获得的病毒抗原峰用0.02M Tris (pH7.5)缓冲液适当稀释以调节其离
子强度，然后缓慢加入层析柱内，上样量为层析柱总载量的50～70%左右。上样完毕后，用0.02M Tris (pH7.5)洗脱2个柱体积，再用0.02M Tris (pH7.5)和0.02M Tris 1M NaCl(pH7.5)连续洗脱，分部收集洗脱液。
根据对纯化前后进行蛋白质含量和抗原含量的测定，计算出杂蛋白去除率和抗原回收率。
纯化结果：
抗原回收率 62.5%
杂蛋白去除率 96.3%
最终获得的即为EV71病毒精纯液，可进行后续的无菌过滤、灭活和添加稳定剂等步骤以适用于不同用途。
实施例3
EV71病毒纯化液的各项检定：
本发明的EV71病毒纯化液制备的灭活疫苗进行了以下指标的检定：游离甲醛残留、牛血清白蛋白残留、宿主细胞蛋白残留、宿主细胞DNA残留、纯度、抗原鉴别试验、细菌内毒素残留、抗生素残留、无菌试验、异常毒性检查灭活验证和pH值检查。检定方法参照《中国药典》（2010年版）附录的相关方法。检定结果见表一。
表一
检定项目 检定标准 检定结果 游离甲醛残留 ≤50ug/剂 6.5ug/剂 牛血清白蛋白残留 ≤50ng/剂 ≤30ng/剂 宿主细胞蛋白残留 ≤50ug/剂 ≤30ug/剂 宿主细胞DNA残留 ≤100pg/剂 ≤10pg/剂 纯度 ≥95% ≥95% 抗原鉴别试验 含有EV71病毒抗原 符合规定 细菌内毒素检查 ≤10ng/剂 ≤10ng/剂 抗生素残留检定 ≤50ug/剂 ≤10ug/剂 无菌检查 无细菌、真菌生长 符合规定 异常毒性检查 动物健存、体重增长 不得检出 灭活验证 阴性 阴性 pH值检查 7.2～8.0 7.5
以上结果表明，本发明在抗原回收率、杂蛋白去除率及各种残留物质的去除上都具有一定的优势，通过本发明所制备的EV71病毒液具有纯度高、残留低的优点。用其所制备的灭活疫苗的各项检定指标均达到或优于国家标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也做为本发明的保护范围。