技术领域
本发明涉及一种产生诱导性多能干(iPS)细胞的方法，其包含将一段或两段编码序列导入靶细胞的步骤，每段编码序列在转录时会产生有助于将所述靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的选自Oct3/4的因子或者属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，其中靶细胞内源性地表达至少不由待导入的编码序列所编码且选自Oct3/4的因子或属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，且其中因所述一段或两段编码序列的导入而产生的细胞表达因子Oct3/4与选自Myc、Klf和Sox的每个因子家族的至少一种因子的组合。此外，本发明还涉及通过本发明的方法所产生的诱导性多能干细胞，以及有助于将靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的化合物的鉴定方法。另外，还涉及产生转基因非人类动物的方法和包含由本发明的方法产生的诱导性多能干细胞的组合物，所述组合物用于基因疗法、再生医学、细胞疗法或药物筛选。
本说明书的正文中引用了一些文献。通过援引将本文所引用文献的公开内容(包括制造商的详细说明书、操作指导等)并入本文。
背景技术
多能干细胞，如胚胎干(ES)细胞，其特征是其自我更新并分化为多种细胞类型的能力。胚胎干细胞在物理诱导因子和生物诱导因子存在的情况下可体外分化为全部三种胚胎胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)的特化细胞系。到目前为止，很多前景乐观的研究已显示出由胚胎干细胞分化形成的衍生细胞在动物模型中改善许多疾病的治疗潜力。因此，多能干细胞在组织工程化和移植治疗的应用中有巨大的潜力。如果可诱导这些细胞使之分化为某种特定细胞类型，即可提供一种几乎无限的移植用细胞源，可用于治疗诸如糖尿病、帕金森症和阿尔茨海默病等多种具破坏性的退行性疾病(Biswas等，2007；Kim等，2007；Zimmermann等，2007)。
直到最近才发现，可对体细胞进行遗传修饰以使其再分化为在表型、基因型和多功能性(pluripotency)方面都与胚胎干细胞相似的状态(Takahashi和Yamanaka，2006；Okita等，2007；Wernig等，2007)。所谓的体细胞“重编程”是有价值的理解重获多功能性的机制的工具，并进一步开拓了产生患者特异性的多能干细胞的可能性。通过转录因子四重组Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的表达，将小鼠和人类体细胞重编程为多能干细胞(命名为诱导性多能干细胞(iPS))已成为可能。
目前，虽然iPS细胞在医学应用(如患者特异性再生细胞疗法)中的巨大潜力已被广泛承认，目前采用的产生诱导性多能干细胞的方法却阻碍了它们在医学领域中应用。具体而言，用于导入和表达几种重编程因子组合的逆转录病毒载体会以多拷贝的形式随机地整合入基因组中，优选整合入活性内源基因内部或附近，因此可能分别引起癌症或肿瘤抑制基因的激活性或失活性变异。因此，使用可使靶细胞基因组的修饰程度最小化的方法来产生诱导性多能干细胞，可以推进该方法的安全临床应用。
发明内容
因此，在第一实施方式中，本发明涉及一种产生诱导性多能干(iPS)细胞的方法，其包括将一段或两段编码序列导入靶细胞的步骤，每段编码序列在转录时会产生有助于将所述靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的选自Oct3/4的因子或属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，其中，所述靶细胞内源性地表达至少不由待导入编码序列所编码的选自Oct3/4的因子或属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，且其中因所述一段或两段编码序列的导入而产生的细胞表达因子Oct3/4与选自Myc、Klf和Sox的每个因子家族的至少一种因子的组合。
“诱导性多能干细胞(iPS cell)”是指表现出与胚胎干细胞(ESC)相似的特征的细胞。所述特征包括例如：体外无限自我更新、正常的染色体组型、包括如Oct3/4、Sox2、Nanog、碱性磷酸酶(ALP)和干细胞特异性抗原3和4(SSEA3/4)等干细胞标志基因的特征性基因表达图谱，以及分化为特化细胞类型的能力(Hanna，J.等，(2007).Science 318(5858)：1920-3；Meissner，A.等，(2007).Nat Biotechnol 25(10)：1177-81；Nakagawa，M.等，(2007).Nat Biotechnol.；Okita，K.等，(2007).Nature 448(7151)：313-7；Takahashi，K.等，(2007).Cell 131(5)：861-72；Wernig，M.等，(2007).Nature448(7151)：318-24；Yu，J.等，(2007).Science 318(5858)：1917-20；Park，I.H.等，(2008).Nature 451(7175)：141-6)。Takahashi，Okita，Nakagawa，Yamanaka(2007)Nature Protocols 2(12)中描述了从成纤维细胞培养物中产生诱导性多能干细胞的技术现状。小鼠iPS细胞的多功能性可例如通过体外分化为神经细胞、神经胶质细胞和心肌细胞以及通过囊胚注射产生种系嵌合体小鼠来测试。人类诱导性多能干细胞系可通过体外分化为神经细胞、神经胶质细胞和心肌细胞来分析，而其体内分化能力可通过注入免疫缺陷SCID小鼠和所产生的作为畸胎瘤的肿瘤的表征来测试。
iPS细胞可通常依据如下细胞生物学性质来评估和分类：
形态学：iPS细胞在形态上类似于胚胎干细胞(ESC)。每个细胞呈圆形，具大核仁和少量细胞浆。iPS细胞的集群也与ESC集群的类似。与hESC类似，人类iPS细胞形成边缘清晰、扁平且堆积紧密的集群，而小鼠iPS细胞形成与mESC相似的集群，不如hESC集群扁平但比之更密集。
生长性质：倍增时间和有丝分裂活性是ESC的基础特性，因为干细胞必须如其部分定义所述进行自我更新。iPS细胞具有丝分裂活性，以与ESC相同的速度进行积极的自我更新、增殖与分裂。
干细胞标记物：iPS细胞表达了在ESC上表达的细胞表面抗原标记物。人类iPSC表达对hESC特异的标记物，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E和Nanog。小鼠iPS细胞与mESC类似，表达SSEA-1但不表达SSEA3或SSEA-4。
干细胞基因：iPS细胞表达在尚未分化的ESC中表达的基因，包括例如Oct3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。
端粒酶活性：端粒酶在维持不受Hayflick极限(即约50次的细胞分裂)限制的细胞分裂中必不可少。hESC表达高端粒酶活性以维持自我更新和增殖，而iPS细胞亦显示出高端粒酶活性且表达端粒酶蛋白复合体中的必要组分hTERT(人端粒酶逆转录酶)。
多功能性：iPS细胞能以与ESC相似的方式分化为完全分化的组织。例如，iPS细胞在被注入免疫缺陷型小鼠体内9周后自发地形成畸胎瘤。畸胎瘤是一种由多种细胞系组成的肿瘤，含有源自三种胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的组织；这与其他通常只由一种细胞类型构成的肿瘤不同。畸胎瘤的形成是检验多功能性的界标。此外，培养物中的hESC可自发形成称为“拟胚体(embryoid body)”的球状类胚胎结构，其由具有丝分裂活性且正在分化的hESC核心和来自全部三种胚层的完全分化的细胞的外周所构成。iPS细胞也能形成拟胚体且具有外周分化细胞。
囊胚注射：hESC天然存在于囊胚内层细胞群(成胚细胞)中；当囊胚壳(滋养层)分化为胚外组织的同时，hESC在成胚细胞中分化为胚胎。中空的滋养层并不能形成活胚胎，因此位于成胚细胞中的胚胎干细胞分化并形成胚胎是必要的。可用微量加样器将iPS细胞注入滋养层内，进而将囊胚转移至雌性接受体中。如此可产生嵌合体活小鼠幼崽，即全身上下以不同嵌合程度并入了iPS细胞衍生物的小鼠。
启动子去甲基化：甲基化是指甲基转移至DNA碱基，通常是甲基转移至CpG位点(相邻的胞嘧啶/鸟嘌呤序列)的胞嘧啶分子。大范围的基因甲基化会通过阻碍表达蛋白的激活或通过募集干扰表达的酶来干扰表达。因此，基因甲基化会通过阻碍转录而有效地沉默该基因。多功能性相关的基因(包括例如Oct3/4、Rex1和Nanog)的启动子在iPS细胞中被去甲基化，表现出它们的启动子活性，并且表现出多功能性相关基因在iPSC中的积极启动和表达。
组蛋白去甲基化：组蛋白是一类在结构上定位于DNA序列的致密蛋白(compacting protein)，可通过各种染色质相关修饰发挥它们的活性。与例如Oct3/4、Sox2和Nanog等结合的H3组蛋白被去甲基化，表明Oct3/4、Sox2和Nanog的表达。
本发明中所使用的术语“导入”是指将编码序列引入靶细胞内和随后将所述编码序列并入靶细胞的基因组DNA中的过程。该过程通常被称为稳定转染，稳定转染的方法已为本领域技术人员所公知并在例如Bonetta，L.，(2005)，Nature Methods 2，875-883的文献中有所描述。由于在被转染的细胞中重编程事件的发生率低，采用高效的稳定转染方法将十分有益。因此，优选通过实现高转染/感染效率的方法将编码序列导入靶细胞。例如，转染/感染效率优选为至少30％、至少50％或至少80％。适合的方法包括例如，脂质转染、电穿孔、核转染(nucleofection)、磁转染或病毒载体感染。优选使用逆转录病毒载体来实现靶细胞的稳定转染，这是因为所述载体不仅可介导编码序列高效地进入靶细胞，而且还可介导这些编码序列整合至靶细胞的基因组DNA中。据显示，逆转录病毒载体可对来自不同动物物种的很多细胞类型进行转导、可将该载体携带的遗传物质整合至靶细胞中、可高水平表达所转导的编码序列，此外，有利的是逆转录病毒载体在感染后不会传播或产生病毒蛋白。适用的逆转录病毒载体系统已为本领域技术人员所公知，例如带有MoMuLV LTR、MESV LTR的逆转录病毒载体，带有不同内部启动子(如CMV启动子)的慢病毒载体，优选带有在胚胎/多功能细胞中表现出对转基因表达的沉默的增强子/启动子组合。亦可采用附加体载体系统，如腺病毒载体、其他非整合性载体、附加体复制质粒。本发明的方法中优选使用逆转录病毒MX载体系统(Kitamura等，(2003)，Exp Hematol.，31(11)：1007-1014)。
本发明的方法所用的靶细胞可源自现有细胞系，或通过包括例如获取组织样本来建立原代细胞系在内的多种方法来获得。从不同组织中获取样本及建立原代细胞系的方法是本领域内所公知的(参见例如，Jones和Wise，Methods Mol Biol.1997)。适用的体细胞系也可从很多供应商那里购得，例如美国组织培养物保藏库(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏库(DSMZ)或PromoCell GmbH，Sickingenstr.63/65，D-69126Heidelberg。根据本发明中的方法，合适的靶细胞内源性地表达选自Oct3/4的因子或属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，其中所述因子与外源性导入的因子的组合可将非多功能性的靶细胞重编程为iPS细胞，所述外源性导入因子选自互补性因子组，即Oct3/4或属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子。因一段或两段编码序列的导入而产生的细胞表达因子Oct3/4与选自Myc、Klf和Sox的每个因子家族的至少一种因子的组合。本领域技术人员熟知确定靶细胞中是否会内源性地表达至少两种上述因子的方法。这些方法包括例如，蛋白质印迹、实时PCR或细胞间染色。技术人员还能够立即意识到需要将何种外源因子补充到内源性表达的因子组中，以便产生会表达因子Oct3/4与选自Myc、Klf和Sox的每个因子家族的至少一种因子的组合的细胞，从而引发靶细胞重编程为iPS细胞。因此，其中导入有可表达形式的编码序列的细胞可以表达一组因子，该组因子由因子Oct3/4和选自Myc、Klf和Sox的每个因子家族的至少一种因子组成。
本发明还涵盖了其中导入的编码序列已经内源性地存在于靶细胞中的实施方式。在例如内源性编码序列仅低水平表达以致对应的因子不会或不足以促进靶细胞的重编程的情形中，该实施方式可能有效。
术语“编码序列”是指在转录时产生经其编码的产物的核苷酸序列。在与适合的启动子连接后，本发明的编码序列可以非常容易地发生转录。优选地，编码序列对应于下述基因的cDNA序列，所述基因在转录时产生有助于将靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的因子，其中本发明的方法中的重编程因子选自Oct3/4或属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子。
“有助于将靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的因子”是指能够帮助诱导靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的因子，其中所述因子选自Oct3/4和属于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，这类重编程因子包括例如，Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、c-Myc、n-Myc、l-Myc、Klf1、Klf2、Klf4和Klf5等因子，或这些因子的具有保留的重编程能力的突变体。所述对重编程的帮助可为如下形式：例如将细胞的甲基化模式变为与胚胎干细胞类似的甲基化模式，将细胞的表达模式转换为胚胎干细胞的表达模式，或者通过将组蛋白的结合调节为与胚胎干细胞中所观察到的相类似来影响聚合核DNA的构象，其中，通过适合的重编程因子，上述的每种形式都可单独或以组合的方式得以实现。除上述的因子之外，技术人员还了解鉴定其他适合的重编程因子的方法，诸如亚硫酸氢盐基因组测序、RT-PCR、实时PCR、微列阵分析、染色体组型分析、畸胎瘤形成、碱性磷酸酶染色等方法，所有这些方法都为本领域技术人员所公知并例如描述于如下文献中：Okita，K.等，(2007)，Nature 448(7151)：313-7；Park，I.H.等，(2008)，Nature 451(7175)：141-6；Takahashi，K.等，(2007)，Cell 131(5)：861-72；Wernig，M.等，(2007)，Nature 448(7151)：318-24；Takahashi，K.等，(2007)，Nat Protoc 2(12)：3081-9；或Hogan，B.等，(1994)，“Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbour Press。
Oct3/4属于八聚体(“Oct”)转录因子家族，并在维持多功能性中起作用。在正常表达Oct3/4的细胞(诸如卵裂球细胞和胚胎干细胞)中Oct3/4的缺失会导致自发的滋养细胞分化。因此，Oct3/4的存在有助于胚胎干细胞维持多功能性和分化潜能。Oct家族中包括Oct1和Oct6的诸多其他基因不能引发诱导，由此说明Oct3/4在诱导过程中的排他性。术语“Oct4”在此可以和术语“Oct3/4”互换使用。
Sox基因家族和Oct3/4类似，与维持多功能性有关，虽然与Oct3/4相反，该基因家族是和专能干细胞(multipotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)有关，而Oct3/4只在多能干细胞中表达。
Klf基因家族的Klf4最初被鉴定为产生小鼠iPS细胞的因子，亦被表明是产生人类诱导性多能干细胞的因子。
Myc家族中的基因是在癌症中所涉及的原癌基因。已表明c-Myc是与小鼠iPS细胞的产生相关的因子，也是与人iPS细胞的产生相关的因子。对作为临床治疗的iPS细胞的不测事件而言，将“Myc”基因家族导入靶细胞来产生iPS细胞会带来麻烦，因为25％的小鼠在移植了由c-Myc诱导的iPS细胞后长出了致死性的畸胎瘤。已鉴定N-Myc和I-Myc可以以相似的效率替换c-myc。
本发明中所用的术语“重编程”是指改变细胞的基因型和表型特征而产生在基因型和/或表型上与胚胎干细胞类似的细胞的过程。所述改变包括例如上文所述的甲基化模式的改变、表达模式的转换或聚合核DNA的构象的改变。
以上内容在作必要修正后适用于本文中下述其他实施方式。
本发明中的方法是基于可以通过导入仅两种重编程因子而获得iPS细胞的惊人发现。在此发现之前，现有技术的信条是：在体内实验中具功能性的(即能够有助于形成三种胚层)有存活能力的iPS细胞只能通过导入至少三种重编程因子来产生，且通过导入四种重编程因子的组合更加有效。
已举例表明，通过利用逆转录病毒MX载体系统导入由四种(4F)、三种(3F)和仅两种(2F)重编程因子组成的组合以及导入仅一种重编程因子可以使小鼠神经干细胞(NSC)重编程。所述NSC是从成年OG2/Rosa26杂合转基因小鼠的大脑建立的(Ryan，A.K.和Rosenfeld，M.G.，Genes Dev11，1207-25(1997)；Do，J.T.和Scholer，H.R.，Stem Cells 22，941-9(2004)；Pollard，S.M.，Conti，L.，Sun，Y.，Goffredo，D.和Smith，A.，Cereb Cortex 16Suppl 1，i112-20(2006))，其在Oct4启动子(Oct4-GFP)和来自组成型Rosa26位点的lacZ转基因的控制下表达GFP。
首先观察到的是在用Oct4和Klf4感染(2F OK)的NSC培养物中出现了GFP+集群，1～2周后在用Oct4和c-Myc感染(2F OM)的细胞培养物中也观察到了同样集群(表1)。
表1：所用的重编程因子组合、GFP集群形成时机及iPS细胞系的建立总览
进一步分析2F OM诱导性多能干细胞，其显示出具有ESC样表达图谱并且有助于畸胎瘤中三种胚层的形成。
将2F OK iPS细胞与4F iPS细胞(使用导入4种重编程因子来产生iPS细胞的标准方法而产生)和ESC进行比较。在感染后第14天，分离出5个GFP+集群，并使其在ESC培养条件下进行增殖(图1c、1f)，产生了3个(即60％)2F OK iPS细胞克隆体(B-2、D-7和F-4)，其在形态上与ESC无法区分(图1d、1g)。在用对照病毒(MX)感染的NSC中无集群形成(图1e、1h)。从Oct4-GFP+集群的数量和MX-GFP对照病毒对NSC的转导率，按时间进程估算了2F OK iPS细胞和4F iPS细胞的重编程效率(图1i、j)。由此，计算出NSC的4F重编程的重编程效率为3.6％，而双因子法的重编程效率为0.11％，这与进行选择(低于0.08％；Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell 126，663-76(2006)；Okita，K.，Ichisaka，T.和Yamanaka，S.，Nature 448，313-7(2007)；Wernig，M.等，Nature 448，318-24(2007))和未进行选择(0.5％；Meissner，A.，Wernig，M.和Jaenisch，R.，Nat Biotechnol 25，1177-81(2007))(图1j)的成纤维细胞的重编程效率相当。用全部四种因子进行转导对GFP+集群的出现时机和数量都具正面效果。用基因分型PCR可确认病毒转基因的整合。在4F iPS细胞中可检测到所有四种因子的病毒转基因，而2F OK iPS细胞只含有Oct4和Klf4转基因。
2F OK iPS细胞在SSEA-1和碱性磷酸酶染色中显示阳性，并且显示出与4F iPS细胞和ESC相似的ES细胞标志基因的表达图谱(图2a)。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果显示，2F OK iPS细胞中内源性Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的表达与ESC相当，并且在2F OK iPS细胞中病毒转录物随着在30天后减少1000倍而沉默。2F iPS的总体基因表达也簇集而接近于ESC和4F iPS(图2b)。DNA微列阵分析的散点图显示：和2F iPS细胞与NSC之间的相似度相比，2F iPS细胞与ESC之间的相似度更高(图2c、2d)。因此，2F iPS细胞(集群F-4)似乎在总体转录水平上与小鼠ESC非常相似。
通过在体外分化为拟胚体(EB)可确认2F OK iPS细胞的分化能力。这些细胞表达外胚层标记物(Tuj1)、内胚层标记物(甲胎蛋白)和中胚层标记物Flk1(由模拟心肌细胞来使细胞搏动而表达)(图3a)。畸胎瘤则包含全部三个胚层的衍生细胞(图3b)且表达三种胚层的标记物。供体细胞(NSC)中并未形成畸胎瘤。这些数据表明，2F OK iPS细胞在体内和体外都显示多功能性表型。
为了研究其发育潜力，将2F OK iPS细胞与8细胞期胚胎聚集。iPS细胞在囊胚发育过程中有助于形成内层细胞群(图4a)。将聚集的囊胚导入假孕的雌性体中之后，在胚龄13.5天时获得16个活胚胎，由Oct4-GFP的表达判断，其中有2个胚胎显出胎生殖腺中的生殖细胞的贡献(图4b)。用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)对来自全胚胎的胚胎组织的染色(使携带Rosa β-geo26(lacZ)转基因的NSC供体细胞可视化)揭示，在所产生的嵌合体中，2F OK iPS细胞有助于全部三个胚层的发育(图4c、4e)。对四倍体(4N)胚胎聚集体(n＝122)发育能力的最严格测试导致在胚龄13.5天时产生2个死亡(停滞)胚胎(图4d)。对4N胚胎聚集体而言这处于正常范围内，与所导入细胞的多功能性缺失并无关联。这些数据表明iPS细胞可以产生后期胚胎的所有组织。在二倍体(2N)聚集体中，PCR基因分型显示在13个嵌合体中有2个对供体细胞的Oct4-GFP等位基因呈阳性(图4f和4g(上图))。将嵌合体与CD-1雌性体交配，以评估2F OK iPS细胞是否有助于形成种系。在12个幼崽中，有2个有Oct4-GFP等位基因，而12只小鼠中有1只具有lacZ等位基因。由于供体细胞源自异源小鼠(Oct4/-Rosa26+/-)，它们同样有Oct4和Klf4转基因(图4g(下图))。在成年嵌合体17周龄时和F1小鼠3周龄时均未观察到肿瘤的形成。该发现说明，2F OK iPS细胞可以参与嵌合体的全程发育，产生下一代(F1)可存活幼崽，因此表明iPS细胞具有与ESC相似的发育性质。
如下文实施例9中所详细描述，本发明人还能够展示通过导入两种或仅一种重编程因子将人类细胞转变为多能干细胞。所述重编程因子为Oct4，或者Oct4与Klf4。
综上所述，上述发现展示了用两种重编程因子或仅一种重编程因子成功产生了诱导性多能干细胞。本发明的方法的优越性在于使用仅两种甚至仅一种逆转录病毒载体来进行一种或两种重编程因子的稳定转染。使用比现有技术方法数目更少的逆转录病毒载体来诱导iPS细胞的可能性，是实现使得对于待重编程的起始细胞群的遗传调节最小化的重要一步。因此，形成异常细胞和肿瘤发生细胞的风险显著降低，因而允许产生适于尤其是治疗目的的iPS细胞。
在本发明的方法的一个优选实施方式中，属于Myc、Klf和Sox因子家族的、且被内源性表达或由待导入靶细胞的编码序列所编码的因子，选自由l-Myc、n-Myc、c-Myc、Klf1、Klf2、Klf4、Klf15、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox18组成的组。
例如小鼠Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的编码序列分别可见于SEQID NO：1、5、9和13。小鼠Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的蛋白序列分别可见于SEQ ID NO：2、6、10和14。人类Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的编码序列分别可见于SEQ ID NO：3、7、11和15。人类Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的蛋白序列分别可见于SEQ ID NO：4、8、12和16。技术人员能够使用本领域中公知的方法，为任何靶物种确定其重编程因子的编码序列。例如，技术人员可以从数据库(诸如由美国国家生物技术信息中心(NCBI)维护的且可通过万维网地址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/访问的数据库)获取有关于序列和功能的数据。此外，用于比较基因组学的数据库包括但不限于：网址为http://www.dcode.org/的同样由NCBI维护的数据库，访问地址为http://supfam.org/SUPERFAMILY/的所有完全测序的生物体的蛋白质注释数据库，访问地址为http://www.cbs.dtu.dk/services/GenomeAtlas/的包括诸多物种的基因组信息的数据库，或访问地址为http://phigs.jgi-psf.org/的包含基因簇的数据库。所述数据库使得技术人员能够从小鼠和人类的已知序列开始，通过例如进行跨物种序列比对而鉴定同源基因，从而鉴定其他物种的重编程因子的编码序列。
几篇最近刚刚发表的科学论文(Hanna，J.等，(2007).Science318(5858)：1920-3；Meissner，A.等，(2007).Nat Biotechnol 25(10)：1177-81；Nakagawa，M.等，(2007).Nat Biotechnol.；Okita，K.等，(2007)，Nature448(7151)：313-7；Takahashi，K.等，(2007)，Cell 131(5)：861-72；Wernig，M.等，(2007).Nature 448(7151)：318-24；Yu，J.等，(2007).Science 318(5858)：1917-20；Park，I.H.等，(2008).Nature 451(7175)：141-6)已显示，属于Oct、Sox、Klf和Myc家族的转录因子能参与诱导小鼠和人类体细胞的重编程。
在另一个优选实施方式中，靶细胞不会内源性地表达由一段或两段待导入所述靶细胞的编码序列所编码的因子中的一个。
评估因子内源表达的方法已为技术人员所公知，并在本说明书的其他部分有所描述。为了依据本发明的方法来产生iPS细胞，靶细胞可以不内源性地表达由一段或两段待导入所述靶细胞的编码序列所编码的因子中的一个。例如，能够表明，在作为靶细胞的小鼠神经干细胞中不表达Oct3/4，而Sox2、Klf4和c-Myc被内源性表达。外源性导入Oct3/4及随后的表达足以补充重编程因子四重组并诱导产生iPS细胞。
在又一个优选实施方式中，靶细胞是专能干细胞。专能干细胞可产生几种其他的细胞类型，但这些类型的数量有限制。这与能够分化为任何细胞类型的多能干细胞迥然不同。专能干细胞的一个实例是见于例如骨髓、脐带血或循环系统中的造血细胞，造血细胞可发展为几种类型的血细胞，但不能发展为其他类型的细胞。专能干细胞的另一个实例是神经干细胞。由于专能干细胞已经含有未经调节的重编程因子，因而专能干细胞特别适于作为重编程靶细胞。
在更优选的实施方式中，专能干细胞是外胚层细胞。
外胚层是构成极早期胚胎的三种主要胚细胞层的最外层(其他两层是中胚层和内胚层)。外胚层分化而产生多种重要组织和结构，包括皮肤的外层及其附属部分(汗腺、毛发和指甲)、牙齿、眼球的晶状体、内耳的部件、神经组织、大脑和脊髓。由于外胚层细胞和神经干细胞一样已经内源性地表达重编程因子，作为专能干细胞的外胚层细胞特别适于用作靶细胞。
在另一个优选实施方式中，靶细胞是神经干细胞(NSC)。
神经干细胞不仅存在于正在发育的哺乳动物神经系统中，还存在于所有哺乳动物生物体(包括人类)的成熟神经系统中。神经干细胞还可源于更早期的胚胎干细胞。成体干细胞的位置以及它们的后代为了进行分化而迁移至的大脑区域尚未确定，虽然可行的位置的数目在成体中非常有限(综述参见Gage，2000)。神经干细胞由于已经内源性地表达重编程因子而特别适于作为靶细胞。
在一个更加优选的实施方式中，待导入的编码序列编码因子Oct3/4。
如上文所概述和下文实施例中所展示，将Oct3/4单独导入神经干细胞中足以产生iPS细胞。由于c-Myc提高了嵌合体幼崽的致肿瘤性(Okita，K.，Ichisaka，T.和Yamanaka，S.，Nature 448，313-7(2007))，最近的研究表明，在没有c-Myc逆转录病毒性整合的情况下可产生iPS细胞(Nakagawa，M.等，Nat Biotechnol 26，101-106(2008)；Wernig，M.，Meissner，A.，Cassady，J.P.和Jaenisch，R.，Cell Stem Cells 2，11-12(2008))，这是一项重大改良。然而，如本实施方式所示不使用c-Myc来诱导iPS细胞并结合逆转录病毒载体数目的减少的可行性，是实现使得对于待重编程的起始细胞群的遗传调节最小化的一个重要步骤。
通过导入仅两种因子，也可将相同靶细胞重编程。因此，在另一个更优选的实施方式中，待导入的两段编码序列编码因子Oct3/4和c-Myc，或者Oct3/4和Klf4。
在一个更加优选的实施方式中，靶细胞内源性地表达因子c-Myc、Klf4和Sox2。
可表明靶细胞在内源性地表达上述重编程因子的组合时，其可在导入一种或两种外源重编程因子(诸如仅Oct3/4，或者Oct3/4和c-Myc，或者Oct3/4和Klf4)后被修正为重编程。
在一个更加优选的实施方式中，靶细胞内源性地表达因子c-Myc、Klf4和Sox2，其表达水平最低10倍低于或最高10倍高于与该靶细胞同属的胚胎干细胞中相应的表达水平。
根据本发明的方法，相对于与靶细胞同属的ESC中的表达水平，内源性重编程因子的表达水平处于一定范围内时是有利的。优选的是，靶细胞内源性地表达重编程因子c-Myc、Klf4和Sox2，其表达水平最低10倍低于或最高10倍高于ESC中所述因子的相应表达水平。更优选的是，Sox的表达水平大约2倍高于、c-Myc表达水平大约10倍高于、和/或Klf4表达水平大约8倍低于与该靶细胞属于同属的ESC中的对应水平。本发明的上下文中所用的术语“大约”是指平均最大偏差为+/-20％，优选为+/-10％。此外还考虑到基因表达水平最低8、6、5、4、3或2倍(或其间的任意数)低于或最高8、6、5、4、3或2倍(或其间的任意数)高于所述ESC中的对应水平。
在一个更优选的实施方式中，靶细胞为小鼠或人类神经干细胞。
此外，本发明涉及通过本发明的方法产生的诱导性多能干细胞。
通过本发明的方法产生的多能干细胞可用于很多实验或治疗场合。例如，考虑到在基因或细胞移植治疗中使用iPS细胞、由其分化衍生的细胞或从所述iPS细胞产生的组织、或者由所述iPS细胞衍生的作为治疗剂或诊断剂的细胞，来鉴定和验证基因组靶标和药物筛选方法。
iPS细胞的培养条件同建立相应物种的胚胎干细胞的培养条件相同，并且为本领域技术人员所公知。通常，细胞培养方法(诸如培养基的组分、标记物的选择和选取、细胞定量和分离)是本领域的公知方法，并在例如如下文献中有所描述：“Practical Cell Culture Techniques”，Boulton et Baker(编)，Humana Press(1992)，ISBN 0896032140；“Human Cell Culture Protocols”，Gareth E.Jones，Humana Press(1996)，ISBN 089603335X；而且在实施例部分中也有示例性描述。在培养基中培养和维持细胞的方法在本领域中是公知的；生长培养基和其他细胞培养相关原料以及成功培养细胞的操作说明和方法可例如从Sigma-Aldrich或Invitrogen获得。
此外，本发明还涉及一种有助于将靶细胞重编程为诱导性多能干细胞的化合物的鉴定方法，其包括如下步骤：(a)根据本发明的方法重编程靶细胞，其中用待测化合物代替一段待导入的编码序列；(b)评估在待测化合物存在和不存在的情况下是否形成iPS细胞，用其中已导入待测化合物的靶细胞形成iPS细胞表明所述化合物有助于将靶细胞重编程为诱导性多能干细胞。
根据本发明，待测化合物可以是一种或多种核酸(如DNA、cDNA、RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA)、蛋白质、肽、小分子(有机或无机)、化学物质或其任意组合。
根据本发明的方法的靶细胞重编程已在前文描述。根据待测化合物的性质，本发明的方法可能需要就将所述化合物导入靶细胞的步骤进行修正。例如，如果要评估其他转录因子，可以不经修饰如上所述导入对应的编码序列。相反，通过将对应化合物外源性地加入细胞培养基并利用被动或主动细胞摄入机制，可以导入化学物质或小分子。技术人员熟知允许将任何待测化合物导入细胞(优选导入细胞核)的方法，从而测定该化合物是否可以真正取代被其替换的因子来诱导靶细胞的重编程。诸如DNA、cDNA、RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA等核酸可通过转染或感染而导入，而小分子(无机或有机)和化学物质则直接穿透细胞膜而导入。
技术人员熟知评估在待测化合物存在和不存在的情况下是否形成iPS细胞的方法。iPS细胞的分类标准已为技术人员所知并在前文中有所描述。根据待评估的标准，方法有所不同且可包括：例如，通过显微镜直观控制、标记物的表达分析、畸胎瘤的形成等单独方法或其组合。
在本发明中发现，内源性表达有助于所述细胞重编程的因子组的细胞可通过外源性添加其它因子而得到补充，所述因子的外源性添加产生表达重编程因子四重组(即Oct3/4和来自Myc、Klf和Sox每个因子家族的一种因子)的细胞，从而导致对该靶细胞的重编程的诱导；上述发现极大简化了对可替代重编程过程中的因子的化合物的鉴定。因为仅需导入一种或两种因子来产生适于筛选的细胞，替代了所属领域中所知的三种因子或全部四种因子的组，从而实现了时间、花费和实验困难的大幅度减少。此外，通过减少需导入的因子组，在时间和效率方面将会明显改进大量筛选新颖重编程因子的方法。
另外，本发明还涉及一种产生转基因非人类动物的方法，其包括如下步骤：(a)将本发明中的诱导性多能干细胞或通过本发明的方法所产生的诱导性多能干细胞导入非人类的植入前胚胎；(b)将步骤(a)中的胚胎转移至雌性非人类动物子宫中；(c)让该胚胎发育并出生。
本发明中所用的术语“转基因非人类动物”是指其基因组已通过本文所述的方法进行慎重修饰的动物。
本发明的产生转基因非人类动物的方法优选根据通过使用胚胎干细胞来产生转基因非人类动物的已确立方法来实施，但是将胚胎干细胞替换为本发明的iPS细胞。所述方法在本领域中是公知的(Hogan，B.，R.Beddington等，(1994)，“Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbour Press；Hanna，J.等，(2007)，Science 318(5858)：1920-3；Meissner，A.等，(2007)，Nat Biotechnol 25(10)：1177-81；Nakagawa，M.等，(2007)，Nat Biotechnol.；Okita，K.等，(2007)，Nature 448(7151)：313-7；Takahashi，K.等，(2007)，Cell 131(5)：861-72；Wernig，M.等，(2007)，Nature448(7151)：318-24；Yu，J.等，(2007)，Science 318(5858)：1917-20；Park，I.H.等，(2008)，Nature 451(7175)：141-6)。简言之，优选通过显微注射至桑椹胚或囊胚中或者通过将iPS细胞与8细胞期胚胎或桑椹胚聚集，来实现将iPS细胞导入非人类的植入前胚胎(如桑椹胚或囊胚)。而后将所述嵌合体胚胎转移至假孕的非人类雌性体的子宫中，在此处让其发育为胚胎并最终出生(参见实施例8)。
由iPS细胞产生转基因非人类动物系基于所述iPS细胞的多功能性(即在注射至诸如囊胚或桑椹胚等正在发育胚胎的宿主内后，iPS细胞参与胚胎发育以及有助于所产生动物的生殖细胞的形成)。如前文所概述，可以使得含有注入的iPS细胞的囊胚在假孕的非人类雌性体子宫中发育并作为嵌合体出生。所产生的转基因动物嵌合有源自iPS细胞的细胞，将其与野生型非人类动物进行回交并筛选出仅携带iPS细胞的遗传物质的动物，由此可以鉴定出DNA片段组合的纯合子转基因动物。
转基因非人类动物可以是例如转基因的小鼠、大鼠、仓鼠、狗、猴、兔、猪或牛。所述转基因非人类动物优选为小鼠。
因此本发明亦涉及通过本发明的方法产生的转基因非人类动物。
最后，本发明涉及一种含有通过本发明的方法产生的iPS细胞的组合物，所述组合物用于基因疗法、再生医学、细胞疗法或药物筛选。
本文所用的组合物涉及含有iPS细胞且优选包含维持所述细胞的细胞活力的其他组分的组合物。此类组分为本领域技术人员所公知，且包括例如细胞培养基组分。另外，根据预期的应用，该组合物可包含额外的组分，例如有助于对患者施用的组分。
含有本发明的iPS细胞的组合物(以及本发明的iPS细胞本身)可用于很多实验和治疗场合。本发明中的iPS细胞具有相对较低数量的转基因表达要素和整体降低的发展为癌细胞的风险，据预期其可在基因疗法、再生医学、细胞疗法或药物筛选中产生有益作用。
基因疗法是基因转移的最重要的应用之一，其基于利用离体(ex vivo)或体内技术手段将用于修正遗传缺陷的治疗性DNA构建体导入种系细胞中。适合于体外或体内基因疗法的载体和方法在文献中有所描述并且是本领域技术人员所已知的(Davis PB，Cooper MJ.，AAPS J.(2007)，19；9(1)：E11-7；Li S，Ma Z.，Curr Gene Ther.(2001)，1(2)：201-26)。依据本发明，获自患者的细胞可例如通过本领域已知方法进行遗传校正，并随后用本发明的方法将其重编程为具有ES细胞的表型和基因型的iPS细胞。这证实了iPS细胞在基因疗法和/或细胞疗法中的适用性。通过在体内使受损组织再生或者在体外培养组织和器官并随后将其植入患者体内，可以将再生医学潜在地用于治疗任何由机能障碍、损伤或衰竭的组织所导致的疾病。本发明的iPS细胞能够分化为几乎任何组织(外胚层、中胚层、内胚层细胞)，可以用于再生医学的任何方面，因而大大减少了对ES细胞的需求。
本发明的iPS细胞也可用于鉴定药物靶标和测试潜在的治疗剂，因而减少对ES细胞和体内研究的需求。用于鉴定和/或评估潜在药物的效果(包括例如靶位点和靶专一性、毒性、生物利用率)的实验设定和方法是本领域技术人员所公知的。
另外，iPS细胞可用于研究出生缺陷的预防和治疗，或用于研究细胞分化。
此外除治疗性应用以外，本发明的iPS细胞还可用于实验设定中，来研究涉及到在诱导靶细胞重编程时的细胞去分化的多个方面，例如基因表达图谱或甲基化图谱在空间时间上的转变，或导致聚集行为变化的形态学变化。iPS细胞可进一步用于相关研究，例如基因疗法、基因靶向、分化研究、药物安全性和效力检测、自体同源或同种异源的再生组织移植、组织修复(如神经系统、心肌)、疾病(例如帕金森症、心脏病、糖尿病、癌症、白血病或脊髓损伤)、胚胎基因表达、胚胎基因的遗传操纵、早期胚胎学和胎儿发育、胚胎细胞标记物的鉴定、细胞迁移或细胞凋亡。
附图说明
图1：由OG2/Rosa26转基因小鼠的成体NSC产生2F Oct/Klf4(OK)iPS细胞。
a.对ESC和NSC中的Oct4、Nanog、Klf4、Sox2和c-Myc的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。β-肌动蛋白用作内参对照。b.对ESC和NSC中四种因子的蛋白质印迹分析。抗肌动蛋白抗体用作内参对照。c.感染后第14天的2F OK iPS细胞集群的形态。表达Oct4-GFP的ESC样集群(f)。d.感染后第30天，在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上生长的已建立的2F OK iPS细胞(克隆体F-4)的形态。显示出相衬和Oct4-GFP(g)。e.感染后第30天，NSC和模拟物感染的形态(h)。i.在2F OK和4F感染后第7、14和21天GFP阳性集群的产生(n＝3；误差条表示标准偏差)。j.产生2F和4F iPS细胞的重编程效率(n＝3)，所示为感染后第7、14和21天在每50,000个平板接种的NSC中GFP+集群的总数。
图2：iPS细胞的基因表达谱。
a.对ESC、4F iPS细胞(克隆体A-2c)、2F OK iPS细胞(克隆体B-2、D-7和F-4)和NSC中的ES细胞标志基因的表达的RT-PCR分析。引物对来自各个内源性位点的转录物具特异性。β-肌动蛋白用作内参对照。b.NSC、2F(OK)iPS、4F iPS和ESC中的不同表达的基因的热力型数据图(heatmap)。基因层次聚类用绝对值距离(cityblock distance)和平均连锁(average linkage)进行。c.采用DNA微列阵，在2F iPS细胞(克隆体F-4)和ESC之间、以及在2F iPS细胞(克隆体F-4)和NSC之间的总体基因表达图谱进行比较。d.黑线表示在配对细胞类型之间的基因表达水平的2倍变化。与NSC或ESC相比，在2F iPS细胞(克隆体F-4)中过表达的基因以蓝色显示，而次表达(underexpress)的基因则以红色显示。多功能性基因Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28在散点图中的位置已示出。基因表达水平以log2来度量。
图3：2F Oct/Klf4(OK)iPS细胞(克隆体F-4)具多功能性且在体外和体内分化。
a.体外分化为全部三种胚层。在拟胚体形成后，将聚集体转移至经明胶涂布的培养板上，让其再分化10天。细胞用抗Tuj1、抗甲胎蛋白(AFP)或抗Flk1染色。细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。b.包含全部三种胚层的F-4iPS细胞的畸胎瘤。将F-4iPS细胞(1.5×106个细胞)皮下接种到裸鼠内。四周后将畸胎瘤用苏木精和曙红染料染色。所示为含有神经花环(neural rosette)(外胚层)、肌肉(中胚层)和柱状上皮(内胚层)的畸胎瘤。
图4：2F Oct/Klf4(OK)iPS细胞(集群F-4)的体内发育潜力。
a.经24小时聚集后，F-4iPS细胞形成的嵌合体胚胎发育为了囊胚。荧光光学显示出位于囊胚的内细胞群的Oct4-GFP细胞。b.F-4iPS细胞对小鼠胚胎发育的种系贡献如Oct4-GFP的表达所示。在胚龄13.5天(E13.5)用荧光显微镜分析胚胎。c，d.配种后13.5天(13.5dpc)的嵌合体胚胎(对照、2N和4N)用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色。e.对经lacZ染色的13.5dpc嵌合体胚胎(2N)的组织学分析。f.由F-4iPS细胞产生的嵌合体小鼠(8周龄)。其野灰色外皮的颜色源自F-4iPS细胞。g.源自F-4iPS细胞的嵌合体的PCR基因分型。对Oct4-GFP进行PCR分析(上图)。F-4iPS细胞的种系传递。嵌合体雄性与CD-1雌性交配产生的子代的基因分型说明了Oct4-GFP基因和lacZ等位基因的存在，以及Oct4和Klf4病毒整合(下图)。缩写：Gastroint.tract.：胃肠道。
图5：源自单因子hNSC的iPS(1F hNiPS)细胞的集群形成和细胞系特征。
(A)在NSC培养基中生长的hNSC的形态。(B)感染后10周经hOCT4感染的细胞的集群形成。(C)集群生长为hESC样形态，但集群中央仍保留未经重编程的神经花环。(D)典型的hESC iPS集群，其在机械分离后生长于通道1的饲养层上(1F hNiPS克隆体C)。(E)位于通道10的iPS集群的高倍放大图。(F)对1F hNiPS集群进行AP染色。比例尺为250μm。(G)2F hNiPS(克隆体A)和1F hNiPS(克隆体C)细胞中多功能性标记物(OCT4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的免疫细胞化学分析。细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色(蓝色)。比例尺为250μm。
图6：源自hNSC的iPS(hNiPS)细胞中的多功能性标记物的表达水平和DNA甲基化分析。
(A)对H1hESC、hNSC、2F hNiPS克隆体(A、B和C)以及1F hNiPS克隆体(A和C)中的多功能性标记物的定量PCR分析。数据所示为使用对内源性转录产物有特异性的引物时相对于H9hESC的表达水平。RNA表达水平以对数标尺显示。将转录产物水平参照β-肌动蛋白水平进行标准化。误差条表示来自三等分试样的标准偏差。(B)对H9hESC、hNSC、2F hNiPS克隆体(A、B和C)以及1F hNiPS克隆体(A和C)中的OCT4和NANOG启动子区域的亚硫酸氢盐测序分析。对于给定扩增子，每行圆圈表示所在区域内一个细菌克隆体的每个CpG位点的甲基化状态。空心圆圈代表未甲基化的CpG，而实心圆圈代表甲基化的CpG。每列底部的数字表示CpG二核苷酸相对于转录起始位点的位置(TSS；+1)。
图7：源自hNSC的iPS(hNiPS)细胞在体外分化为全部三种胚层。
(A)免疫荧光分析显示2F和1F hNiPS细胞分化为全部三种胚层：内胚层(甲胎蛋白；AFP)、中胚层(α-平滑肌肌动蛋白；α-SMA)和外胚层(β-微管蛋白IIIb；Tuj1)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。比例尺为100μm。(B)对源自2F hNiPS(克隆体A)和1F hNiPS(克隆体C)细胞的1月龄的拟胚体(EB)分化的定量PCR分析。内胚层(AFP、GATA6和Sox17)，中胚层(FOXF1和HAND1)和外胚层(NCAM1、PAX6和Sox1)。数据所示为相对于每个未分化的亲代hNiPS细胞的表达水平。RNA表达水平以对数标尺显示。转录产物水平参照β-肌动蛋白水平进行标准化。
图8：源自hNSC的iPS(hNiPS)细胞的体内多功能性和总基因表达谱。
(A)将2F hNiPS(克隆体A)和1F hNiPS(克隆体C)细胞移植入SCID小鼠体内后畸胎瘤的形成，并且在6～8周时将畸胎瘤截面切片并用苏木精和曙红染色。经鉴定的细胞的组织学截面切片代表了全部三种胚层：内胚层(呼吸上皮：r)、中胚层(骨骼肌：m，软骨：c)和外胚层(神经上皮：n)。截面切片的放大图显示了以箭头指示的呼吸上皮、肌肉和神经上皮。比例尺为100μm。(B)hESC、1F hNiPS(克隆体C)、2F hNiPS(克隆体A)、H9hESC和H1hESC(左)的总基因表达的热力型数据图(左图)和系统聚类分析(右图)。(C)比较总基因表达谱的散点图，所对比的组合分别为1F hNiPS(克隆体C)和H9hESC(左图)、2F hNiPS(克隆体A)和H9hESC(中图)、以及hNSC和1F hNiPS(克隆体C)(右图)。黑线表示在所配对的细胞群之间的基因表达水平的2倍差距。转录物的表达水平以log2来度量。
具体实施方式
实施例
本发明由如下实施例阐明：
实施例1：OG2小鼠的生成
将OG2品种与ROSA26转基因品种杂交(Do，J.T.和Scholer，H.R.，Stem Cells 22，941-9(2004)；Szabo，P.E.，Hubner，K.，Scholer，H.和Mann，J.R.，Mech Dev 115，157-60(2002))，几代之后产生neo/lacZ和Oct4-GFP转基因的混合纯合子小鼠。将纯合子OG2×ROSA26雄性小鼠与ICR雌性小鼠杂交产生杂合子幼崽，从而衍生出NSC。从5日龄OG2×ROSA26杂合子小鼠中收集脑组织。
实施例2：诱导性多能干细胞的产生
诱导性多能干(iPS)细胞和ESC生长于在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上和ESC培养基(即补充有15％FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、β-巯基乙醇和1000U/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM)中。使用Fugene 6转染试剂(Roche)将编码小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的pMX基逆转录病毒载体分别与包装缺陷(packaging defective)辅助质粒共同转染至293个细胞中。48小时后如此前所述收集病毒上清液(Zaehres，H.和Daley，G.Q.，(2006)，Methods Enzymol 420，49-64)。将源自OG2/Rosa26转基因小鼠的NSC以每个6孔细胞培养板5×104个细胞的密度进行接种，并与含有病毒的上清液(补充有6μg/ml的硫酸鱼精蛋白(Sigma))共温育24小时以获取四种因子(1∶1∶1∶1)或获取Oct4和Klf4(1∶1)。利用pMX-GFP对照病毒计算出转染效率。将细胞重新平板接种至新鲜的神经扩增培养基中。感染2天后，将细胞在不进行进一步的筛选的情况下在经辐照的MEF上且在含有LIF的ESC培养基中进一步次培养。将Oct4-GFP阳性的集群机械分离，而后将单个细胞分散并重新平板接种至MEF上。挑选集群以进行扩增。
实施例3：qRT-PCR分析
依照制造商的操作说明，用MiniRNeasy试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国，http://www.qiagen.com)从细胞中提取出总RNA。依照制造商的操作说明，用High Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems GmbH，Darmstadt，德国，http://www.appliedbiosystems.com)以按比例缩减的反应体积(20μl)进行互补DNA合成。使用ABI PRISM Sequence Detection System 7900(Applied BioSystems)和即用型5’-核酸酶Assay-on-Demand测定转录产物水平。对每个实时的扩增过程，模板等价于5ng总RNA。测量以三等分试样进行；使用无模板空白和每个样品的RT-空白作为阴性对照。扩增曲线和基因表达用管家基因Hprt作为内参标准物进行标准化。
使用Taqman Assay-on-Demand设计寡聚核苷酸，用于检测如下基因：Pou5f1(Oct3/4)(Mm00658129_gH)、Sox2(Mm00488369_s1)、c-Myc(Mm00487803_m1)、Klf4(Mm00516104_m1)、B-Act(Mm00607939_s1)和Hprt1(Mm00446968_m1)。用于检测Nanog和病毒序列的寡聚核苷酸是特别定制的。使用ΔΔCt法(ABI PRISM 7700Sequence Detection System，user bulletin#2)在针对每个探针/引物组所获得的扩增曲线的对数线性(log-linear)期在内源性Hprt基因上对定量进行标准化。
病毒特异性qRT-PCR用引物序列
pMXs-Oct4正向引物(PF)：5’-TGGTACGGGAAATCACAAGTTTG(SEQ ID NO：17)；反向引物(PR)：5’-GTCATAGTTCCTGTTGGTGAAGTTCA(SEQ ID NO：18)；探针：5’-6FAM-CTTCACCATGCCCCTCA-MGB(SEQ ID NO：19)
pMXs-Sox2PF：5’-GTGTGGTGGTACGGGAAATCAC(SEQ ID NO：20)；PR：5’-TTCAGCTCCGTCTCCATCATG(SEQ ID NO：21)；探针：5’-6FAM-TGTACAAAAAAGCAGGCTTGT-MGB(SEQ ID NO：22)
pMXs-Klf4 PF：5’-GTGTGGTGGTACGGGAAATCA(SEQ ID NO：23)；PR：5’-CGCGAACGTGGAGAAGGA(SEQ ID NO：24)；探针：5’-6FAM-CTTCACCATGGCTGTCAG-MGB(SEQ ID NO：25)
pMXs-cMyc PF：5’-TGGTACGGGAAATCACAAGTTTG(SEQ ID NO：26)；PR：5’-GTCATAGTTCCTGTTGGTGAAGTTCA(SEQ ID NO：27)；探针：5’-6FAM-CTTCACCATGCCCCTCA-MGB(SEQ ID NO：28)
Nanog PF：5’-AACCAGTGGTTGAATACTAGCAATG(SEQ ID NO：29)；PR：5’-CTGCAATGGAT GCTG GGATACT(SEQ ID NO：30)；探针：5’-6FAM-TTCAGAA GGGCTCAGCAC-MGB(SEQ ID NO：31)
实施例4：微列阵分析
基本上如前所述(Ruau，D.等，(2008)，Stem Cells)，使用Affymetrix Mouse Genome 4302.0GeneChip阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行微列阵研究。简言之，使用含脱氧核糖核酸酶酶切作用的RNAeasy kit(Qiagen，Hilden，德国)从细胞中提取总RNA。利用GeneChip One-Cycle标记试剂盒(Affymetrix)从3μg总RNA中取得用生物素标记的cRNA。将15微克cRNA切段并于45℃与Affymetrix 4302.0GeneChip arrays杂交16小时。使用Affymetrix Fluidics装置和GCS3000扫描仪将DNA芯片冲洗、染色并进行扫描，并使用GCOS软件分析所得图像。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的实验进行三次平行测量，而神经干细胞的实验则进行两次平行测量。利用在BioConductor软件中施行的RMA算法(Irizarry，R.A.等，(2003)，Nucleic Acids Res 31，e15)计算进行标准化。
实施例5：iPS细胞的体外分化
通过FACS分析法收集Oct4-GFP细胞并用于体外分化为拟胚体(EB)，所述分化利用悬滴在不含LIF的ESC培养基中进行。3天后将拟胚体平板接种至经明胶涂布的4孔皿中并再持续10天。使用抗Tuj1抗体(1∶100；Chemicon)、抗甲胎蛋白(AFP)抗体(1∶100；R&D Systems)或抗Flk1抗体(1∶100；R&D Systems)对细胞染色。
实施例6：蛋白质印迹分析、SSEA-1和AP染色
对从ESC和NSC制备的全细胞裂解物(2×106)进行蛋白质印迹分析，以分析Oct4(Santa Cruz)、Sox2(Santa Cruz)、Klf4(Abcam)和c-Myc(Abcam)的表达。在所有样品中使用β-肌动蛋白表达水平作为内参对照(Abcam)。
依照制造商的操作规程使用ES细胞表征试剂盒(Chemicon)进行SSEA-1和碱性磷酸酶(AP)染色。
实施例7：畸胎瘤的形成
将iPS细胞和NSC细胞(1.5×106个细胞/小鼠)皮下注射至裸鼠背部侧肋。在注射4周后，用4％的多聚甲醛(PFA)过夜固定已形成的畸胎瘤，随后将其包埋于石蜡中。截面切片用苏木精和曙红染料染色。
实施例8：嵌合体的形成
将iPS细胞与裸露的致密化后的8细胞期小鼠胚胎聚集并培养。简言之，在配种后1.5天将2细胞期的胚胎从鼠体[(C57BL/6×C3H)F1雌性×CD1雄性]中冲洗出并置于M2培养基中，并在含0.1％BSA的KSOM培养基中过夜培养至8细胞期。从用胰蛋白酶短期处理的第2天培养物中选取松散连接的iPS细胞团(10～20个细胞)，并将其转移至在矿物油下的含10％FCS的KSOM培养基微滴中；将每个细胞团置于微滴的一个凹陷中。与此同时，将每批含30～40个胚胎的若干批胚胎与酸化Tyrode溶液短期温育，直至透明带被分解。将单个胚胎置于上述细胞团上。所有的聚集体都以此方式组装，并于37℃在含5％CO2的空气气氛中进行培养。培养24小时后大部分聚集体都已形成囊胚。将总共64个聚集的囊胚(配种2.5天后)转移至5只假孕小鼠(CD-1背景)的子宫角中。
实施例9：通过Oct4重编程人类神经干细胞
如前所述，将源自人类胎儿脑组织的hNSC在无血清NSC培养基中扩增(参看图5A)(Kim等.，Exp Neurol 199，222(2006)；Park等，Nat Biotechnol 20，1111(2002))。首先用编码人类OCT4和KLF4(2F)或者OCT4(1F)的pMX感染hNSC。然后，将已被感染的hNSC置于NSC培养基中(Kim等.，Exp Neurol 199，222(2006))保养至多7天。感染后第8天，将细胞重新平板接种至hESC培养基中的细胞饲养层上，该hESC培养基中含有10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和MEF条件培养基(CM)，且二者比例为1∶1；上述培养物继续生长，直至hESC样集群出现。在感染后10～11周内，鉴定出hESC样iPS集群，但集群中央看上去仍像是神经花环(参看图5B)。在之后的5～6天内，上述集群继续长大并显示典型的hESC样形态，但在集群中央仍留有神经花环(参看图5C)。将神经花环从上述集群中移除。然后，通过机械分离将一片集群转移至细胞饲养层上(参看图5D)。通过从被OCT4感染的hNSC中进行挑拣，在三个hESC样集群中，成功地建立了其中两个的克隆体(1F hNiPS克隆体A和C，重编程效率为0.02％)。此外，在感染后7～8周内，在经双因子(2F)感染的hNSC中的5个hESC样集群中，成功建立了其中3个的克隆体(2F hNiPS A、B和C，重编程效率为0.15％)。所有上述克隆体可在hESC培养条件下进行扩增。1F hNiPS细胞在形态上与hESC类似，并在碱性磷酸酶染色中呈阳性(参看图5E和F)。免疫荧光染色证实，2F和1F hNiPS细胞一致表达包括OCT4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81的多功能性标记物(参看图5G)。这些结果表明，可通过OCT4和KLF4以及仅OCT4从hNSC产生人类iPS细胞。
接下来，通过定量RT-PCR分析在分子水平上测试这些iPS细胞中多功能性标记物基因的表达水平。2F和1F hNiPS细胞内源性地表达hESC特异性标记物、与H9和H1hESC类似、并且与亲代hNSC相比被上调(参看图6A)。基因型分型PCR显示1F hNiPS克隆体在其基因组中仅含有OCT4转基因，而2F nNiPS克隆体含有OCT4和KLF4转基因。此外已确认，除了2F hNiPS克隆体B中的OCT4的表达，转基因OCT4或KLF4的表达水平在2F和1F hNiPS克隆体中被显著沉默。DNA印迹分析确认了在2F和1F hNiPS克隆体中的OCT4转基因的整合。为了排除在实验室中iPS细胞克隆体经来自hESC的污染物产生的可能性，进行了DNA指纹识别分析并确认hNiPS细胞与供体hNSC精确相关(参看表2)。
为了确认来自重编程细胞的OCT4和NANOG启动子的核外遗传性重建，进行了亚硫酸氢盐测序以确定上述两个启动子的去甲基化。相对于供体hNSC，2F和1F hNiPS细胞中的OCT4和NANOG的启动子区域被去甲基化，这与hESC类似。综上，能够通过仅转导OCT4在分子水平上将hNSC重编程为类似于hESC的iPS细胞。
接下来，通过拟胚体(EB)分化和直接分化，测试了2F和1F hNiPS细胞的体外多功能性。通过EB分化，hNiPS细胞很容易地分化为内胚层(AFP)、中胚层(α-SMA)和外胚层(Tuj1)(参看图5A)，并且通过定量RT-PCR分析，确认了来自直接分化的全部三种胚层的标记物的表达(参看图7B)。为了确认这些人类iPS细胞的体内多功能性，将这些细胞皮下移植至重症联合免疫缺陷(SCID)的小鼠体内。在注射6～8周后，2F和1F hNiPS细胞形成了含有全部三种胚层的畸胎瘤，包括呼吸道、骨骼肌、软骨和神经上皮(参看图8A)。这些结果说明2F和1F hNiPS细胞在体内和体外均具有和hESC类似的多功能性。
最后，通过cDNA微列阵，对hNSC、源自hNSC的2F和1F hNiPS细胞、H9和H1hESC进行了总体基因表达分析。热力型数据图显示，2F和1F hNiPS细胞与hESC类似，而亲代hNSC被从多能细胞群孤立(参看图8B，左图)；系统聚类分析显示，hNiPS细胞与hESC簇集，同时却明显区别于亲代hNSC(参看图8B，右图)。散点图分析显示，与亲代hNSC相比，hNiPS细胞明显与hESC更加相似(参看图8C)，其相似程度类似于不同hESC之间的相似性。1F和2F hNiPS细胞还显示出与H1hESC的相似性。这些数据表明，hNiPS细胞在总基因表达谱上与hESC类似。所述结果表明，1F和2F hNiPS细胞在分子水平和多功能性上与hESC非常类似。
表2：对hNSC和hNiPS的STR分析
材料与方法：
细胞培养
人类NSC源自端脑(HFT13)，并如前所述建立(Kim等，Exp Neurol199，222(2006))。简言之，将端脑组织新鲜解剖并用0.1％的胰蛋白酶分解30分钟，并以在NSC培养基中200,000细胞/ml的密度接种于10cm培养板中。如前所述将这些细胞在NSC培养基中培养(Kim等，Exp Neurol199，222(2006)；Park等，Nat Biotechnol 20，1111(2002))。将人类ES细胞和iPS细胞在人类ESC培养基中的经丝裂霉素C处理的CF1小鼠饲养层(Millipore)上保养，如前所述(Takahashi等，Cell 131，861(2007))该培养基含有KnockOut DMEM(Invitrogen)，所述DMEM中补充有20％的敲除血清替代物(knockout serum replacement)(Invitrogen)、1mM的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇、青霉素/链霉素和10ng/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Invitrogen)。
1F hNiPS和2F hNiPs细胞的诱导
基于pMX的逆转录病毒载体编码人类OCT4和KLF4的cDNA(Takahashi et Yamanaka，Cell 126，663(2006))，如前所述(Zaehres et Daley，Methods Enzymol 420，49(2006))，使用Fugene转染试剂(Roche)将该载体与包装缺陷辅助质粒共同转染至293个细胞中，以产生水疱性口炎病毒(VSV)G蛋白假型病毒。转染后48小时，收集病毒上清液并通过超速离心将其浓缩，以感染人类NSC。为产生iPS细胞，将人类NSC以5×104个细胞/6孔板的密度进行接种，并与含有病毒的上清液(补充有6μg/ml的硫酸鱼精蛋白(Sigma))共温育24小时以获取OCT4或者OCT4和KLF4。次日，用新鲜的NSC培养基于感染后1日替换原有培养基，并保养到至多感染后7日。从感染后第8天起，将细胞在人类ESC培养基中进一步培养。在感染2个月或2.5个月后，将iPS集群机械分离，并随后重新平板接种并保养在人类ESC培养基中的CF1小鼠饲养层(Millipore)上。
定量RT-PCR
使用带有柱上DNA消化功能的RNeasy柱(Qiagen)从本体细胞培养物样本或人工拣选的未分化集群中分离出总RNA。按制造商的操作说明，用oligo-dT15引物和M-MLV逆转录酶(USB)在42℃进行1小时cDNA制备。在20μl SYBR Green PCR反应物(在Applied Biosystems 7300仪器上进行40个15秒95℃/60秒60℃的循环)中，通常使用大约50ng总RNA等价序列作为模板，所述PCR反应物中另外含有0.375μM的每种引物和10μl SYBR Green PCR混合物(ABI)。已确认所有所用引物都以准最佳效率扩增预期产物，并且没有副产品。引物序列在表3中给出。基于生物对照样本和两种管家基因，使用比较Ct法(comparative Ct method)计算出相对表达水平，以进行标准化。误差条反映了来自生物学重复实验(标记物基因表达数据)或来自使用独立管家基因(转基因沉默数据)进行标准化的标准误差。
总体基因表达分析
依照制造商的操作说明(IVT：10小时)，用400ng不含DNA的总RNA作为经标记的cRNA合成的输入序列(Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒-Ambion)来进行转录分析。遵循制造商指引并使用其提供/建议的原料/仪器，将经过质量检验的cRNA样品作为生物学复制样品或技术性复制样品在HumanRef-8 v3 Expression BeadChips芯片(Illumina)杂交18小时，而后将其冲洗、染色并进行扫描。微列阵数据可从基因表达综合数据库(GEO)网站获得，登陆编号为GSE GSE15355。
亚硫酸氢盐测序
使用DNeasy柱(Qiagen)从本体细胞培养物样本或人工拣选的未分化细胞集群中分离出基因组DNA。将300ng用作亚硫酸氢盐转化的输入序列(EpiTect Bisulfite Kit-Qiagen)。将50ng经转化的DNA用作常规巢式PCR的模板，以分别扩增OCT4启动子的467bp区和NANOG启动子的336bp区。引物对于DNA正义链的转化具特异性，并在表3中给出。将纯化的PCR产物经TA-克隆接入pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。在遵循BiQAnalyzer程序的基于质量检验的建议适当去掉个别克隆体后，使用该程序对随机拣选的克隆体的插入序列进行分析。来自相对于OCT4翻译起始密码子的+20位置处的一个CpG位点的数据因其不提供信息而未显示。
短串联重复序列(STR)分析
使用DNeasy柱(Qiagen)从培养的细胞样本中分离出基因组DNA。将所述基因组DNA用作短串联重复序列分析中的模板，该分析使用PowerPlex 16System(Promega)和ABI PRISM仪器。所示数字表示15个常染色体片段的碱基对长度。此分析在Eurofins Medigenomix(Martinsried，德国)进行。
畸胎瘤的形成
将hNiPS细胞和hNSC(3×106细胞/小鼠～5×106细胞/小鼠)皮下注射至SCID小鼠背部侧肋。在注射6～8周后，用4％PFA过夜固定畸胎瘤，随后将其包埋于石蜡中。截面切片用苏木精和曙红染料染色。
碱性磷酸酶(AP)和免疫荧光染色
依照制造商提供的方案使用ES细胞表征试剂盒(Chemicon)进行碱性磷酸酶(AP)染色。免疫荧光染色使用如下原发性抗体进行：AFP(Sigma，1∶100)、a-SMA(Sigma，1∶50)、TuJ1(Chemicon，1∶500)、OCT4(Santa Cruz，1∶200)、SSEA4(Chemicon，1∶200)、TRA-1-60(Chemicon，1∶200)、TRA-1-81(Chemicon，1∶200)。
表3：实时PCR和亚硫酸氢盐测序的引物
实时聚合酶链式反应引物
基因 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) ACTB TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG ACATCTGCTGGAAGGTGGACA AFP AGCAGCTTGGTGGTGGATGA CCTGAGCTTGGCACAGATCCT CDH1(E-CAD) TTGAGGCCAAGCAGCAGTACA ATCCAGCACATCCACGGTGA CDX2 TCACTACAGTCGCTACATCACCATC TTAACCTGCCTCTCAGAGAGCC DNMT3B GCTCACAGGGCCCGATACTT GCAGTCCTGCAGCTCGAGTTTA DPPA4 TGGTGTCAGGTGGTGTGTGG CCAGGCTTGACCAGCATGAA FGF2 GGCAAGATGCAGGAGAGAGGA GCCACGTGAGAGCAGAGCAT FOXF1 AAAGGAGCCACGAAGCAAGC AGGCTGAAGCGAAGGAAGAGG GAPDH CTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCAT TGGAATCATATTGGAACATGTAAACC GATA6 TGTGCGTTCATGGAGAAGATCA TTTGATAAGAGACCTCATGAACCGACT GDF3 TTGGCACAAGTGGATCATTGC TTGGCACAAGTGGATCATTGC HAND1 TCCCTTTTCCGCTTGCTCTC CATCGCCTACCTGATGGACG KLF4endo ACAGTCTGTTATGCACTGTGGTTTCA CATTTGTTCTGCTTAAGGCATACTTGG KLF4viral GTCGGACCACCTCGCCTTAC TTTATCGTCGACCACTGTGCTG LIN28 GGAGGCCAAGAAAGGGAATATGA AACAATCTTGTGGCCACTTTGACA MYC CCAGCAGCGACTCTGAGGA GAGCCTGCCTCTTTTCCACAG
NANOG CCTGTGATTTGTGGGCCTG GACAGTCTCCGTGTGAGGCAT NCAM1 TCATGTGCATTGCGGTCAAC ACGATGGGCTCCTTGGACTC OCT4endo GGAAGGAATTGGGAACACAAAGG AACTTCACCTTCCCTCCAACCA OCT4viral GGCTCTCCCATGCATTCAAAC TTTATCGTCGACCACTGTGCTG SOX17 TTCGTGTGCAAGCCTGAGATG GTCGGACACCACCGAGGAA SOX2 TGGCGAACCATCTCTGTGGT CCAACGGTGTCAACCTGCAT TDGF1(Cripto) GGGATACAGCACAGTAAGGAGCTAA CACAAAAGGACCCCAGCATG ZNF206 TCACCATGGCCAGAGGAGAG GCAGGCCACGCCTTATTCTC ZNF589 TCGGGTGGCTAAATTACATCCAG CCCAAGGGAGTAAGGCAAACTG
亚硫酸氢盐测序引物
基因 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) OCT4outer GAGGATAGGAATTTAAGATTAGTTTGGGTA AAATCCCCCACACCTCAAAACCTAACCCAA OCT4inner GAGGTTGGAGTAGAAGGATTGTTTTGGTTT CCCCCCTAACCCATCACCTCCACCACCTAA OCT4inner unconverted GAGGCTGGAGCAGAAGGATTGCTTTGGCCC CCCCCCTGGCCCATCACCTCCACCACCTGG NANOG outer TTAGTTTTTAGAGTAGTTGGGATTATAGA ATAATAACATAAAACAACCAACTCAATCCA NANOGinner TGGTTAGGTTGGTTTTAAATTTTTG AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA NANOG innerunconverted TGGCCAGGCTGGTTTCAAACTCCTG GACCCACCCTTGTGAATTCTCAGTTA
DNA印迹分析
将经BamHI消化的1F hNiPS细胞、hNSC和2F hNiPS细胞的基因组DNA在0.8％的琼脂糖凝胶上分离并转移至Biodyne B尼龙膜(PALLLife Sciences)。使用DecaLabelTM DNA标记试剂盒(Fermentas)将DNA与用32P标记的OCT4片段(Eco81I(SauI)人类OCT4cDNA片段)杂交。将标记的经λ-HindIII消化的DNA用作标记物。
人类iPS细胞的体外分化
对于免疫细胞化学而言，用悬滴法在MEF条件培养基中由iPS细胞生成拟胚体(EB)。5天后，将拟胚体转移至经明胶涂布的培养板上，随后在补充有20％FBS、1mM的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇和青霉素/链霉素的KnockOut DMEM(Invitrogen)中再培养14天。对于qRT-PCR而言，将iPS集群机械分离并重新平板接种至MEF条件培养基中的经基质胶(Matrigel)涂布的培养板上。2天后，将培养基替换为三种胚层的分化培养基。就内胚层分化而言，将细胞在补充有2％FBS、100ng/ml的活化素A(R&D Systems)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中保养3周(Huangfu等，Nat Biotechnol 26，1269(2008))。就中胚层分化而言，将细胞在补充有100μM的抗坏血酸(Sigma)、20％FBS、1mM的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇和青霉素/链霉素的KnockOut DMEM中保养3周(Aasen等，Nat Biotechnol 26，1276(2008))。就外胚层分化而言，将细胞在N2B27培养基中保养7天，而后将培养基替换为补充有10ng/ml的bFGF2(Peprotech)、100ng/ml的Sonic Hedgehog(R&D Systems)、10ng/ml的PDFG(R&DSystem)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的N2培养基并保养2周。培养基每隔一天更换一次。引物序列于表3给出。
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