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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710814501.7 (22)申请日 2017.09.11 (71)申请人 苏州大学 地址 215000 江苏省苏州市相城区济学路8 号 (72)发明人 管华孔周阳谈建中赵川乐 李秀秀沈成晨高乐李坚 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 陶海锋 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) A61L 2/18(2006.01) A61L 2/02(2006.01) A61L 10。
2、1/02(2006.01) (54)发明名称 对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材 料的抑菌处理方法 (57)摘要 本发明涉及对农杆菌介导转化法获得的红 掌转基因材料的抑菌处理方法。 以红掌愈伤组织 作为转基因受体材料， 对农杆菌介导转化法获得 的红掌转基因材料采用两种方法进行抑菌处理。 一是将用无菌水清洗后转基因材料置于为浓度 2550mg/L的复合纳米银抗菌溶液中， 振荡条 件下进行抑菌处理； 另一种方法是将转基因材料 直接接入含有2550mg/L复合纳米银抗菌剂的 固体分化培养基中进行抑菌培养。 与常规抗生素 抑菌方法相比， 按本发明技术方案进行复合纳米 银抗菌剂处理后， 能有效抑制红掌。
3、转基因材料的 农杆菌污染， 抑菌率最高可达100%， 并且不影响 红掌转基因受体材料的生长与分化， 遗传转化率 明显提高， 具有良好的应用价值和经济效益。 权利要求书1页 说明书3页 CN 107365796 A 2017.11.21 CN 107365796 A 1.一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处理方法， 其特征在于包括 如下步骤： （1） 按农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料被农杆菌污染后， 对红掌转基因材料 先用无菌水进行清洗， 洗去材料表面附着的部分农杆菌菌液； （2） 将红掌转基因材料置于抗菌剂溶液中进行振荡除菌处理； 所述的抗菌剂溶液为浓 度2550 mg/L。
4、的复合纳米银溶液； （3） 用无菌水对红掌转基因材料进行清洗， 再用无菌滤纸吸干材料表面的水分后， 得到 农杆菌污染被抑制的红掌转基因材料； 将获得红掌转基因材料接入固体培养基中进行培 养。 2. 根据权利要求1所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处 理方法， 其特征在于： 所述的复合纳米银的粒径为2030 nm。 3. 根据权利要求1所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处 理方法， 其特征在于： 所述振荡除菌处理的温度条件为 28。 4. 根据权利要求1所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处 理方法， 其特征在于： 所述振荡除菌处理的振荡。
5、条件为180200 r/min。 5. 根据权利要求1所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处 理方法， 其特征在于： 所述振荡除菌处理的时间为1224 h。 6. 一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处理方法， 其特征在于： 按 农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料被农杆菌污染后， 将转基因材料接入含有2550 mg/L复合纳米银的固体分化培养基中进行抑菌培养。 7. 根据权利要求6所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处 理方法， 其特征在于： 所述的固体分化培养基为： 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1 mg/ L。
6、。 8.根据权利要求6所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处理 方法， 其特征在于： 抑菌培养时间为8d及以上。 9. 根据权利要求6所述的一种对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处 理方法， 其特征在于： 所述的复合纳米银的粒径为2030 nm。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107365796 A 2 对农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料的抑菌处理方法 技术领域 0001 本发明涉及一种对采用农杆菌介导转化法获得的转基因材料， 在受农杆菌污染后 的抑菌除菌处理方法， 具体涉及红掌生物育种中的遗传转化技术， 属于观赏园艺学领域。 背景技术 0002 红掌(An。
7、thurium andraeaum） 为天南星科花烛属多年生草本花卉， 原产于热带美 洲， 因其独特的花叶形态， 深受广大消费者喜爱。 随着红掌花卉产业的快速发展， 红掌生产 中存在的问题也逐渐受到人们的关注， 其中细菌性病害已成为红掌产业稳定发展的生物胁 迫因子， 而利用转基因技术培育抗病品种是解决这一问题的新途径。 0003 迄今为止， 在红掌转基因工作中， 农杆菌介导法是应用最为广泛、 最为有效的遗传 转化方法， 具有操作简单、 成本低、 重复性好、 转化率高、 基因沉默现象少、 转育周期短、 可插 入大片段 DNA、 毋需原生质体培养再生植株等诸多优点。 然而， 在农杆菌介导的红掌遗传。
8、转 化中， 大多采用愈伤组织作为初始受体材料， 滋生于组织内部的农杆菌不易清洗干净， 容易 造成农杆菌污染问题。 另一方面， 在筛选培养阶段， 一般都是采用头孢霉素 （Cef） 、 羧苄青霉 素 （Cab） 等抗生素来抑制农杆菌生长， 而在长时间培养的情况下又容易产生抗药性， 使得抗 生素筛选失效， 农杆菌生长难以得到有效抑制， 导致红掌转基材料褐化死亡， 遗传转化率大 大下降。 0004 纳米金属材料是一类新型的抗菌试剂， 纳米颗粒利用其特殊结构和表面大量的特 殊基团来破坏细胞膜的完整性， 使其失去细胞膜的功能和结构， 改变膜的通透性， 从而起到 抑菌杀菌的效果， 且不易产生抗药性， 因而目。
9、前已大量应用于体外杀菌、 医用材料表面消 毒、 水净化处理、 日用品表面消毒等方面， 其中复合纳米银抗菌试剂已有商业化的产品， 应 用较广泛。 但将纳米银材料应用于农杆菌介导的植物遗传转化实际工作中， 解决抑制农杆 菌污染的问题， 还未见报道。 0005 发明内容 0006 本发明针对目前红掌遗传转化中， 对农杆菌污染的抑菌存在的抗生素筛选失效， 农杆菌生长难以得到有效抑制的问题， 提供两种不影响红掌转基因受体材料的生长与分 化， 能有效抑制农杆菌污染， 具有抗菌谱广、 抗菌效能强、 抗菌持久特点的红掌转基因材料 的抑菌处理方法。 0007 实现本发明目的的技术方案是提供两种对农杆菌介导转化法。
10、获得的红掌转基因 材料的抑菌处理方法， 其中的第一种方法包括如下步骤： （1） 按农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料被农杆菌污染后， 对红掌转基因材料 先用无菌水进行清洗， 洗去材料表面附着的部分农杆菌菌液； （2） 将红掌转基因材料置于抗菌剂溶液中进行振荡除菌处理； 所述的抗菌剂溶液为浓 度2550 mg/L的复合纳米银溶液； 说明书 1/3 页 3 CN 107365796 A 3 （3） 用无菌水对红掌转基因材料进行清洗， 再用无菌滤纸吸干材料表面的水分后， 得到 农杆菌污染被抑制的红掌转基因材料； 将获得红掌转基因材料接入固体培养基中进行培 养。 0008 上述第一种技术方案的一个优。
11、选方案是： 振荡除菌处理温度条件为 28； 振荡除 菌处理的振荡条件为180200 r/min； 振荡除菌处理的时间为1224 h。 0009 将按上述第一种技术方案处理后的红掌转基因材料接入分化培养基组成为1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L， 在2426 、 光照12 h/d、 15002000 lx条件下 培养， 红掌转基因材料的农杆菌污染可以被完全抑制， 达到抑菌除菌的目的， 且不影响其正 常生长与分化。 0010 实现本发明目的的第二种方法是： 按农杆菌介导转化法获得的红掌转基因材料被 农杆菌污染后， 将转基因材料接入含有2550 mg/L复合纳。
12、米银的固体分化培养基中进行 抑菌培养。 0011 上述第二种技术方案中， 所述的固体分化培养基为： 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L + 2, 4-D 0.1 mg/L； 抑菌培养时间为8d及以上。 按该技术方案， 红掌转基因材料的农杆菌污染可 以被抑制， 达到抑菌除菌的目的， 且不影响其正常生长与分化。 0012 本发明技术方案所述的复合纳米银的粒径为2030 nm。 0013 本发明将复合纳米银抗菌剂应用于遗传转化中的抑菌培养， 借助纳米抗菌材料具 有抗菌谱广、 抗菌效能强、 抗菌持久的优点， 在红掌转基因受体材料的筛选培养及抑菌培养 阶段， 采用纳米银抗菌剂进行特殊技术处理， 可。
13、以有效抑制农杆菌污染， 减少转基因受体材 料的农杆菌污染及损失， 并且不影响红掌转基因受体材料的生长与分化， 从而优化了农杆 菌介导的红掌遗传转化技术体系， 对高效开展红掌分子育种研究具有积极意义。 0014 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 由于采用了复合纳米银抗菌材料的适当 处理， 可以有效抑制红掌转基因材料的农杆菌污染， 提高红掌转基因的遗传转化效率。 本发 明具有抑菌效果可靠、 无耐药性、 操作简单、 效率高、 性价比高的特点， 红掌的遗传转化率明 显提高， 具有良好的应用价值和经济效益。 具体实施方式 0015 下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的阐述。 0016 实施例1。
14、： 选取红掌愈伤组织在1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1mg/L培养基上进行继代培养， 切成各边大小约为1的小块。 将愈伤组织块在农杆菌菌液中浸染20 min， 接入对照培养基 （常规培养基） 及含有复合纳米银浓度分别为25 mg/L、 30 mg/L、 45 mg/L和50 mg/L的固体 分化培养基 （1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1 mg/L） 上， 培养10 d后调查农杆菌的生 长情况。 0017 结果显示： 在对照培养基中， 农杆菌生长未受抑制， 菌液在培养基中蔓延； 在含有 复合纳米银抗菌剂25 mg/L的培养基中， 愈伤组。
15、织块表面虽有农杆菌菌液， 但农杆菌无法在 培养基中生长蔓延； 在添加复合纳米银浓度为30 mg/L、 45 mg/L、 50 mg/L的培养基中， 农杆 菌都不能正常生长。 说明在固体培养基中添加25 mg/L复合纳米银抗菌剂对农杆菌生长即 起到显著的抑制作用。 说明书 2/3 页 4 CN 107365796 A 4 0018 在本实施例中， 复合纳米银为市售的商品化抗菌剂产品， 粒径为2030 nm。 0019 实施例2： 选取绿色致密的红掌愈伤组织， 切去表面突起和已分化的不定芽， 切成各边大小约为1 的小块作为转基因受体材料， 按常规方法进行农杆菌侵染处理后， 转移至1/2 MS+6-。
16、BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L +Cef 500 mg/L的抑菌培养基上培养12代， 转接到1/2 MS+6- BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L +Hyg 2030 mg/L +Cef 500 mg/L的筛选培养基上进行培 养。 0020 从筛选培养的转基因材料中， 取出未能抑制农杆菌生长而被严重污染的愈伤组织 块， 用无菌水清洗34遍， 洗去材料表面粘附的大部分农杆菌菌液。 将清洗后的红掌愈伤组 织块转移至复合纳米银浓度为25 mg/L的抗菌剂溶液中， 复合纳米银溶液为市售的商品化 抗菌剂产品， 复合纳米银的粒径为2030 nm； 在温度为28、 1。
17、80200 r/min的振荡条件 下， 培养24 h； 再用无菌水清洗34遍， 用无菌滤纸吸除表面多余水分， 接种到未添加任何 抗生素的固体培养基上。 0021 观察结果显示， 在培养10 d后， 经复合纳米银抗菌剂处理的愈伤组织块中未见农 杆菌生长， 抑菌率达到了100%； 而用常规抑菌剂羧苄青霉素600 mg/L的愈伤组织块， 农杆菌 污染率为33.3%， 抑菌率为66.7%； 未经抑菌剂处理的愈伤组织块， 农杆菌污染率为80.0%。 说 明复合纳米银在低浓度 （25 mg/L） 处理24 h即可取得良好的抑菌效果。 0022 实施例3： 选取绿色致密的红掌愈伤组织， 切去表面突起和已分化。
18、的不定芽， 切成各边大小约为1 的小块作为转基因受体材料， 按常规方法进行农杆菌侵染处理后， 转移至1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L +Cef 500 mg/L的抑菌培养基上培养12代， 再转接到1/2 MS+ 6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L +Hyg 2030 mg/L +Cef 500 mg/L的筛选培养基上进行 培养。 0023 从筛选培养的转基因材料中， 取出未能抑制农杆菌生长而被污染的愈伤组织块， 用无菌水清洗34遍， 洗去材料表面粘附的大部分农杆菌菌液。 将清洗后的红掌愈伤组织 块转移至含有复合纳米银颗粒50 mg/L。
19、的抗菌剂溶液中， 于28、 200 r/min下振荡培养24 h。 然后用无菌水清洗34遍， 用无菌滤纸吸除表面多余水分， 接种到未添加任何抗生素的 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1 mg/L分化培养基上。 0024 其结果是： 在培养10 d后， 经复合纳米银抗菌剂处理的愈伤组织块中未见农杆菌 生长， 抑菌率达到了100%； 而用常规抑菌剂头孢霉素600 mg/L处理的愈伤组织块， 农杆菌污 染率为75.0%， 抑菌率仅为25.0%； 用常规抑菌剂羧苄青霉素600 mg/L处理的愈伤组织块， 农 杆菌污染率为33.3%， 抑菌率为66.7%。 说明使用复合纳米银材料的抑菌效果显著优于常规 的抗生素抑菌剂。 说明书 3/3 页 5 CN 107365796 A 5 。