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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310463629.5 (22)申请日 2013.09.30 (73)专利权人 浙江大学 地址 310000 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 王佳堃杜文刘建新 (74)专利代理机构 杭州斯可睿专利事务所有限 公司 33241 代理人 林君勇 (51)Int.Cl. C12N 9/42(2006.01) A23K 20/189(2016.01) (56)对比文件 杜文 等. “湖羊瘤胃微生物Fosmid文库中木 聚糖酶基因的筛选” . 中国畜牧兽医学会动物营。
2、 养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会论 文集， 2012 年 .2012,第164页摘要. 王佳堃 等. “湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的 构建和分析” . 动物营养学报 .2010,第22卷(第 2期),第1.2-2.3节. Jiakun Wang 等. “SCREENING OF A XYLANASE CLONE FROM A FOSMID SCREENING OF A XYLANASE CLONE FROM A FOSMID” . Animal Biotechnology .2012,第23卷第156页摘要， 第 157页第2段， 第158页第2段. Jiakun Wang 等. 。
3、“SCREENING OF A XYLANASE CLONE FROM A FOSMID SCREENING OF A XYLANASE CLONE FROM A FOSMID” . Animal Biotechnology .2012,第23卷第156页摘要， 第 157页第2段， 第158页第2段. 审查员 蔺娜 (54)发明名称 一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及 其制备方法 (57)摘要 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及一种能 促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法。 一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶， 利用基 因克隆和酵母表面展示技术将一段源自湖羊瘤 胃微生物Fosmid文库。
4、的木聚糖酶编码基因ORF6- UN展示到酿酒酵母表面上， 诱导表达后， 离心回 收细胞沉淀， 经冷冻干燥后得到细胞干粉， 该干 粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶； 木聚糖酶编码基 因ORF6-UN的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。 所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶可作 为饲料添加剂补充到动物日粮中， 将这种瘤胃源 全细胞木聚糖酶添加到动物饲粮中， 不仅能增加 动物的营养摄入， 还能提高动物对纤维物质的利 用效率。 权利要求书4页 说明书9页 序列表2页 附图7页 CN 103525789 B 2016.08.17 CN 103525789 B 1.一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶的制备方法。
5、， 其特征在于该方法包括如下步 骤： 一、 重组质粒pYD1/ORF6-UN的构建 设计含有BamH 和Xho 两个限制性酶切位点的引物， 上游引物： 5 -TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3 SEQIDNo.2， 下游引物： 5 -CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3 SEQIDNo.3， PCR扩增木聚糖酶编码基因ORF6-UN， 采用50 l扩增体系， 在PCR管中加入以下组分： 轻弹PCR管混匀， 稍离心后置于PCR仪中， 扩增条件为： 94预变性4min； 6个循环反应， 94变性30s， 55退火30s， 72延伸 1min；。
6、 24个循环反应， 94变性30s， 58退火30s， 72延伸1min； 72延伸10min； 4终止 反应， PCR产物清洗， 用BamH 和Xho 双酶切PCR产物和pYD1质粒， 酶切体系如下： 混匀离心， 37过夜 混匀离心， 37过夜， 酶切产物清洗回收， 30 l灭菌水洗脱， 权利要求书 1/4 页 2 CN 103525789 B 2 连接反应， 体系如下： 混匀离心， 16连接过夜， 大肠杆菌E.coli化学转化 取上述的连接产物10 l加入200 l大肠杆菌Trans10感受态细胞中， 冰浴30min； 42下 热激60s， 立即冰浴5min； 加入500 l液体LB， 3。
7、7下150rpm培养1h， 使细胞复苏； 取50 l转化后的细菌液涂于含有100 g/ml氨苄青霉素Amp的LB平板上， 在37下培养 12-16h后， 观察平板上生长的菌斑， 初步确定含有重组质粒的阳性克隆， 重组质粒的抽提与鉴定 挑取单菌落至含有Amp的LB液体培养基中， 37， 225rpm培养过夜， 利用质粒小量抽提 试剂盒提取质粒， 酶切鉴定， 体系如下： 混匀离心， 37过夜， 阳性克隆送公司测序， 经测序鉴定后， 将其接入200mlLB+Amp培养基中扩大培养， 在 37， 225rpm的条件下培养12-16h后， 用质粒大量抽提试剂盒提取质粒， 二、 酿酒酵母Saccharom。
8、ycescerevisiaeEBY100细胞感受态的制备、 外源质粒的转化 (1)划线培养酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100， YPD固体培养基， 置于30 恒温培养箱， 直到长出菌斑， 挑单菌落接种于含4-5mlYPD液体培养基的试管中， 30， 225rpm恒温摇床上培养； (2)在超净台里分装10mlYPD培养基至50-100ml已高压灭菌的锥形瓶中， 按不同的体 积梯度50 l， 200 l， 400 l， 500 l接入上述培养得到的EBY100菌液， 编号E1、 E2、 E3、 E4， 摇菌 过夜； (3)用酶标仪测E1、 E2、 E3、 E4的OD。
9、600， 以YPD液体培养基作空白对照， 直到OD600在0.4- 0.6范围； (4)转移1.5ml菌液于1.5ml离心管中， 4500rpm离心3min， 弃上清， 尽量去除菌液， 用 ddH2O悬浮细胞清洗， 离心弃上清； (5)用1ml1TE缓冲液洗涤2次， 4500rpm离心3min， 弃上清， 尽量去除菌液； (6)用1ml1LiAc/0.5TE， pH7.5的缓冲液洗涤1次， 4500rpm离心3min去除菌液， 再 权利要求书 2/4 页 3 CN 103525789 B 3 向试管中添加100 l1LiAc/0.5TE悬浮细胞， 室温条件下孵育30min； (7)按1 g质粒。
10、DNA和100 gSSDNA的量加到上一步得到的100 l体系中， (8)添加700 l1LiAc/40PEG-3350/1TE到试管中， 混合均匀， 30静置30min； (9)向试管中添加88 lDMSO， 迅速混合均匀， 42水浴中热激7min， 放在30225rpm恒 温摇床上1h恢复细菌的活力； (10)4500rpm离心3min， 弃上清， 添加200 l灭菌水， 混合均匀， 转移50100 l的液体涂 布于最小葡萄糖培养基MinimalDextrose， 加亮氨酸选择性固体培养基平板上， 30恒温 培养箱中培养24天， 至生长出菌斑， 三、 酵母阳性克隆鉴定 采用酵母菌液PCR的。
11、方式鉴定， 模板制备： 挑取MD+Leu选择性固体培养基平板上生长出的菌斑至PCR管中， 加入20 l 灭菌水溶解； 100沸水浴3min， 然后在-80中放置5min， 此过程反复2-3次后， 离心取上 清， 上清即可作为PCR鉴定用的模板， PCR鉴定阳性转化子， 采用20 l扩增体系， 在PCR管中加入以下组分： 轻弹PCR管混匀， 稍离心后置于PCR仪中， 扩增条件为： 94预变性4min； 6个循环反应， 94变性30s， 55退火30s， 72延伸1min； 24个循环反应， 94变性30s， 58退火30s， 72 延伸1min； 72延伸10min； 4终止反应， 阳性克隆送公。
12、司测序， 经鉴定后， 将菌种与40的甘油1:1质量比混合保存在-80， 四、 重组酿酒酵母细胞EBY100-pYD1/ORF6-UN的诱导表达 接10 l上述保存的菌液进入4-5mL酵母浸出粉胨葡萄糖YPD培养基中， 30、 225rpm 摇床震荡培养24-48h； 吸取上述菌液1-2mL接种于50mL含2葡萄糖的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物 YNB-CAA培养基的200mL锥形瓶中， 瓶口用6层纱布封住， 30、 225rpm摇床震荡培养24-48h， 至OD600的在2-5之间时， 离心15min， 弃上清； 用含2半乳糖的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物YNB-CAA培养基悬浮细胞， 使。
13、稀 释后细胞的OD600在0.5-1之间， 摇瓶瓶口用6层纱布封住， 20-25、 225rpm摇床震荡培养， 诱导表达蛋白； 48h后， 5000rpm离心15min弃上清， 回收细胞沉淀得到表达产物， 将所得细胞沉淀冷冻干燥24h， 即得到细胞干粉， 该细胞干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖 权利要求书 3/4 页 4 CN 103525789 B 4 酶生物催化剂， -20保存。 2.一种权利要求1所述的制备方法得到的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶， 其特征 在于： 利用基因克隆和酵母表面展示技术将一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的木聚糖 酶编码基因ORF6-UN展示到酿酒酵母表面上， 诱。
14、导表达后， 离心回收细胞沉淀， 经冷冻干燥 后得到细胞干粉， 该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶； 木聚糖酶编码基因ORF6-UN的核苷酸 序列如SEQIDNo.1所示。 3.一种权利要求2所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶在提高反刍动物对粗饲料 的利用率方面的应用， 其特征在于： 所述的全细胞木聚糖酶按照粗饲料重量的1.5-2.0进 行饲喂。 权利要求书 4/4 页 5 CN 103525789 B 5 一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其 制备方法。 背景技术 0002 木聚糖是植物细胞壁。
15、中常见的半纤维素多糖， 占植物碳水化合物总量的1/3， 含量 仅次于纤维素， 是自然界中第二丰富的可利用资源。 在养殖生产中， 由于单胃动物缺少降解 半纤维素的酶， 因此木聚糖对单胃动物几乎没有营养作用， 而且没有消化的纤维物质会增 加食物的黏性， 干扰消化酶的作用及营养的吸收； 反刍动物由于瘤胃微生物的存在， 对木聚 糖具有一定的降解能力， 但是， 实际生产中仍需要补充外源酶制剂， 进一步提高动物对粗饲 料的消化效率。 木聚糖酶是能专一水解木聚糖为低聚木糖和D-木糖的一类糖苷水解酶的总 称， 由于其在天然材料中表达水平低、 生产周期长、 酶蛋白提取纯化过程繁琐且成本高， 严 重限制了它的推广。
16、应用。 为了满足饲用木聚糖酶的生产需要、 开发半纤维类生物能源， 利用 基因工程技术生产全细胞木聚糖酶具有重要意义。 0003 酵母表面展示技术是一种固定化的表达异源蛋白质的真核蛋白表达系统， 其原理 是将外源蛋白基因与载体连接后导入酵母细胞， 通过诱导表达， 信号肽引导融合蛋白向细 胞外分泌。 由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构， 可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁上， 从而实现外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。 酵母生长快、 易于培养， 展示蛋白在细 胞表面稳定且能维持生物活性， 加之酵母细胞具有生物安全性， 活力强， 转入基因在传代细 胞中能稳定表达。 因此， 利用酵母表面展示技术， 将。
17、木聚糖酶基因导入酵母细胞， 经过诱导 表达， 该木聚糖酶通过二硫键锚定在酵母表面， 使重组酵母细胞具有木聚糖酶的催化活性， 将这种具有木聚糖酶活性的酵母细胞冷冻干燥， 制成干粉， 即可得到全细胞木聚糖酶 （见图 1） 。 由于固定化的酶无需提取纯化， 对降低生产成本有十分重要的作用， 加之本方法所用酿 酒酵母本身就是一种安全、 绿色的高蛋白单细胞食品级微生物， 将这种全细胞木聚糖酶添 加到动物饲粮中， 不仅能增加动物的营养摄入， 还能提高动物对纤维物质的利用效率。 发明内容 0004 本发明提供一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶， 其添加到动物饲粮中， 不仅 能增加动物的营养摄入， 还能提高动。
18、物对纤维物质的利用效率。 0005 本发明还提供一种所述能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶的制备方法， 该方法可 以显著简化酵母转化的步骤， 缩短反应时间， 提高制备全细胞木聚糖酶的效率。 0006 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 0007 一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶， 利用基因克隆和酵母表面展示技术将一 段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的木聚糖酶编码基因ORF6-UN展示到酿酒酵母表面上， 诱导表达后， 离心回收细胞沉淀， 经冷冻干燥后得到细胞干粉， 该干粉即为瘤胃源全细胞木 聚糖酶； 木聚糖酶编码基因ORF6-UN的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。 由于全细胞木聚糖 。
19、说明书 1/9 页 6 CN 103525789 B 6 酶是一种固定化的酶， 无需提取纯化， 简化了生产步骤， 对降低生产成本有十分重要的作 用。 此外， 本方法所用酿酒酵母本身就是一种食品级的高蛋白单细胞微生物， 因此得到的全 细胞木聚糖酶可作为饲料添加剂补充到动物日粮中， 将这种瘤胃源全细胞木聚糖酶添加到 动物饲粮中， 不仅能增加动物的营养摄入， 还能提高动物对纤维物质的利用效率。 0008 一种所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶的制备方法， 该方法包括如下步 骤： 0009 a、 重组质粒pYD1/ORF6-UN的构建， 包含PCR扩增目的基因、 目的基因和质粒pYD1的 双酶切、 。
20、连接、 转化大肠杆菌、 阳性克隆鉴定等步骤； 0010 b、 酿酒酵母 （Saccharomycescerevisiae） EBY100细胞感受态的制备、 外源质粒的 转化； 采用的是PEG/LiAc法进行酵母转化， 利用营养缺陷型培养基进行筛选； 0011 c、 酿酒酵母阳性克隆鉴定， 采用酵母菌液PCR的方式进行阳性克隆鉴定， 模板制备 采取的是反复冻融的方法； 0012 d、 重组酿酒酵母细胞EBY100-pYD1/ORF6-UN的诱导表达。 先用含2%葡萄糖 （glucose） 的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物 （YNB-CAA） 培养基进行培养24-48h， 至OD600 的在2-5。
21、之间时， 离心15min， 弃上清， 用含2%半乳糖 （galactose） 的无氨基酸酵母氮源-酪蛋 白水解物 （YNB-CAA） 培养基悬浮细胞进行诱导表达。 0013 作为优选， 步骤a、 重组质粒pYD1/ORF6-UN的构建过程具体如下： 0014 PCR扩增木聚糖酶编码基因ORF6-UN； 0015 用限制性内切酶BamH 和Xho 双酶切目的片段和穿梭质粒pYD1； 0016 构成重组质粒转化大肠杆菌 （E.coli） Trans10感受态细胞； 0017 鉴定阳性克隆， 将阳性克隆单菌落接入LB培养基中扩大培养， 抽提质粒pYD1/ ORF6-UN。 0018 作为优选， 步骤。
22、中， PCR扩增采用的特异性引物为 0019 上游引物ORF6-BamH ： 5 -TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3 SEQIDNo.2， 0020 和下游引物ORF6-Xho ： 0021 5 -CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3 SEQIDNo.3。 0022 作为优选， 步骤d、 重组酿酒酵母细胞EBY100-pYD1/ORF6-UN的诱导表达过程具体 如下： 0023 采用添加了2%半乳糖的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物 （YNB-CAA） 培养基进 行诱导表达； 0024 培养48h后离心取细胞沉淀， 经冷冻干燥后得到细胞干。
23、粉， 该干粉即为瘤胃源全 细胞木聚糖酶。 0025 一种所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶在提高反刍动物对粗饲料的利用 率方面的应用， 所述的全细胞木聚糖酶按照粗饲料重量的1.5-2.0%进行饲喂。 另一种表述 是， 该全细胞木聚糖酶在瘤胃液中达到2g/L添加量时， 可有效提高瘤胃对粗饲料的利用率。 经本发明能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶饲喂粗料型反刍动物， 产气量以及24h发酵后 的总VFA、 氨态氮和干物质降解率都显著增加 （P0.05） ， 说明该全细胞木聚糖酶的添加对瘤 胃发酵具有明显的促进作用， 能提高动物对粗饲料的利用效率。 0026 本发明具有下列优点和积极效果： 说明书 2/。
24、9 页 7 CN 103525789 B 7 0027 1.本方法中所用基因筛选至湖羊瘤胃微生物Fosmid文库。 0028 2.本方法中所用酵母为酿酒酵母， 其为食品级高蛋白的单细胞微生物， 具有安全， 生长快， 活性强等优点， 本身可以作为饲料补充到动物日粮中， 为全细胞酶的生产提供了必 需的条件。 0029 3.本方法中选择的穿梭质粒是pYD1， 它含有AGA2基因， 该基因的存在实现了木聚 糖酶基因的分泌表达和锚定在酵母细胞壁上； 含有XpressTMepitope和V5epitope， 可以实 现荧光检测展示的木聚糖酶； 含有6XHis标签， 可以通过它利用western检测展示蛋白。
25、以及 进行亲和层析纯化； TRP1基因， 转化成功的酵母， 可分泌色氨酸 （trp） ， 为利用营养缺陷型培 养基进行筛选提供了依据。 0030 4.本方法中PCR扩增目的片段时采取的是两种退火温度， 先低温后高温， 可以有效 保证扩增效率和产物特异性； 0031 5.本方法中酵母转化部分， 制备酵母感受态时， 设置了不同梯度浓度的菌液小体 积摇菌， 保证了OD600在0.4-0.6范围， 省去了从小体积培养基转到大体积培养基中摇菌扩 繁的过程， 简化了方法， 提高了效率。 0032 6.本方法中酵母转化部分， 离心转速为4500rpm， 避免了低转速离心效果不好， 高 转速对酵母细胞的损害。。
26、 0033 7.本方法中酵母诱导表达时间为48h， 48h是该瘤胃源全细胞木聚糖酶的最佳诱导 时间。 0034 8.本方法在荧光鉴定时选择的抗体， 为Anti-V5-FITCantibody， 只需要进行一次 抗体孵育， 避免了一抗、 二抗孵育过程的繁琐， 同时也保证了荧光检测的效果。 0035 9.本方法中木聚糖酶活性鉴定采取的是雷马氏亮蓝-木聚糖 （RemazolBrilliant BlueR-D-Xylan， RBB-xylan） 法， 该方法简单易行， 与刚果红染色法相比， 省去了染色洗脱 等过程。 0036 10.本方法所制得的干粉是通过冷冻干燥得到， 保证了全细胞酶的活性。 附图说。
27、明 0037 图1是全细胞木聚糖酶示意图； 0038 图2是pYD1/ORF6-UN的基因克隆策略。 0039 图3是ORF6-UN的PCR结果， 图中1、 2、 3为样品， 4为阳性对照， 5为阴性对照； 0040 图4是pYD1/ORF6-UN的酶切结果图； 0041 图5是pYD1/ORF6-UN的PCR鉴定结果图， 图中1-6为转化子， 7为阴性对照； 0042 图6是激光共聚焦显微镜下观察细胞表面图， 图中， a.EBY100， b.EBY100-pYD1， c.EBY100-pYD1/ORF6-UN； 0043 图7是温度对全细胞木聚糖酶活性的影响； 0044 图8是pH对全细胞木。
28、聚糖酶活性的影响； 0045 图9是全细胞木聚糖酶的pH稳定性； 0046 图10是全细胞木聚糖酶的热稳定性。 具体实施方式 说明书 3/9 页 8 CN 103525789 B 8 0047 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 应当理解， 本发 明的实施并不局限于下面的实施例， 对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。 0048 在本发明中， 若非特指， 所有的份、 百分比均为重量单位， 所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法， 如无特别说明， 均为本领域的常 规方法。 0049 实施例： 0050 一、。
29、 重组质粒pYD1/ORF6-UN的构建 0051 基因克隆策略见图2， 具体步骤如下： 0052 设计含有BamH 和Xho 两个限制性酶切位点的引物。 0053 上游引物 （ORF6-BamH ） ： 0054 5 -TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3 SEQIDNo.2， 0055 下游引物 （ORF6-Xho ） ： 0056 5 -CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3 SEQIDNo.3， 0057 PCR扩增木聚糖酶编码基因ORF6-UN， 采用50 l扩增体系 （3个平行） 。 0058 在PCR管中加入以下组分： 0059。
30、 0060 0061 轻弹PCR管混匀， 稍离心后置于PCR仪中。 0062 扩增条件为： 94预变性4min； 6个循环反应 （94变性30s， 55退火30s， 72延 伸1min） ； 24个循环反应 （94变性30s， 58退火30s， 72延伸1min） ； 72延伸10min； 4 终止反应。 设置了两个不同的循环过程， 先低温退火， 后高温退火， 不仅保证了扩增效率， 更 保证了其特异性。 0063 PCR结果见图3。 0064 PCR产物清洗， 将3个平行各50 l的产物洗至一管， 85 l灭菌水洗脱。 0065 用BamH 和Xho 双酶切PCR产物和pYD1质粒 （结果见图。
31、4） ， 酶切体系如下： 说明书 4/9 页 9 CN 103525789 B 9 0066 0067 0068 混匀离心， 37过夜。 0069 0070 混匀离心， 37过夜。 0071 酶切产物清洗回收， 30 l灭菌水洗脱。 0072 连接反应， 体系如下： 0073 0074 混匀离心， 16连接过夜。（以上操作均在冰上完成） 。 0075 大肠杆菌 （E.coli） 化学转化 0076 取上述的连接产物10 l加入200 l大肠杆菌 （E.coli） Trans10感受态细胞中， 冰浴 30min； 0077 42下热激60s， 立即冰浴5min； 0078 加入500 l液体LB。
32、， 37下150rpm培养1h， 使细胞复苏； 说明书 5/9 页 10 CN 103525789 B 10 0079 取50 l转化后的细菌液涂于含有100 g/ml氨苄青霉素 （Amp） 的LB平板上， 在37 下培养12-16h后， 观察平板上生长的菌斑， 初步确定含有重组质粒的阳性克隆。 0080 重组质粒的抽提与鉴定 0081 挑取单菌落至含有Amp的LB液体培养基中， 37， 225rpm培养过夜。 利用质粒小量 抽提试剂盒提取质粒， 酶切鉴定。 体系如下： 0082 0083 混匀离心， 37过夜。 0084 阳性克隆送公司测序， 经测序鉴定后， 将其接入200mlLB+Amp培。
33、养基中扩大培 养， 在37， 225rpm的条件下培养12-16h后， 用质粒大量抽提试剂盒提取质粒。 0085 二、 酿酒酵母 （Saccharomycescerevisiae） EBY100细胞感受态的制备、 外源质粒 的转化 0086 （1） 划线培养酿酒酵母 （Saccharomycescerevisiae） EBY100 （YPD固体培养基） ， 置 于30恒温培养箱， 直到长出菌斑。 挑单菌落接种于含4-5mlYPD液体培养基的试管中， 30 ， 225rpm恒温摇床上培养； 0087 （2） 在超净台里分装10mlYPD培养基至50-100ml已高压灭菌的锥形瓶中， 按不同 的体。
34、积梯度 （50 l， 200 l， 400 l， 500 l） 接入上述培养得到的EBY100菌液， 编号E1、 E2、 E3、 E4， 摇菌过夜； 0088 （3） 用酶标仪测E1、 E2、 E3、 E4的OD600， 以YPD液体培养基作空白对照， 直到OD600在 0.4-0.6范围； 0089 （4） 转移1.5ml菌液于1.5ml离心管中， 4500rpm离心3min， 弃上清， 尽量去除菌液， 可用枪尽量吸干菌液， 用ddH2O悬浮细胞清洗， 离心弃上清； 0090 （5） 用1ml1TE缓冲液洗涤2次， 4500rpm离心3min， 弃上清， 尽量去除菌液； 0091 （6） 用。
35、1ml1LiAc/0.5TE， pH7.5的缓冲液洗涤1次， 4500rpm离心3min去除菌液， 再向试管中添加100 l1LiAc/0.5TE悬浮细胞 （用混合仪轻微混合） ， 室温条件下孵育 30min； 0092 （7） 按1 g质粒DNA和100 gSSDNA （100水中煮沸20min， 转入冰上聚冷备用） 的量 加到上一步得到的100 l体系中。 0093 （8） 添加700 l1LiAc/40%PEG-3350/1TE到试管中， 混合均匀， 30静置30min； 0094 （9） 向试管中添加88 lDMSO， 迅速混合均匀， 42水浴中热激7min， 放在30 225rpm恒。
36、温摇床上1h恢复细菌的活力； 0095 （10） 4500rpm离心3min， 弃上清， 添加200 l灭菌水， 混合均匀， 转移50100 l的液 说明书 6/9 页 11 CN 103525789 B 11 体涂布于最小葡萄糖培养基 （MinimalDextrose， MD） 加亮氨酸 （Leu） 选择性固体培养基平 板上， 30恒温培养箱中培养24天， 至生长出菌斑。 0096 三、 酵母阳性克隆鉴定 0097 采用酵母菌液PCR的方式鉴定。 0098 模板制备： 挑取MD+Leu选择性固体培养基平板上生长出的菌斑至PCR管中， 加入 20 l灭菌水溶解； 100沸水浴3min， 然后在。
37、-80中放置5min， 此过程反复2-3次后， 离心取 上清， 上清即可作为PCR鉴定用的模板。 0099 PCR鉴定阳性转化子 （图5） ， 采用20 l扩增体系。 0100 在PCR管中加入以下组分： 0101 0102 轻弹PCR管混匀， 稍离心后置于PCR仪中。 0103 扩增条件为： 94预变性4min； 6个循环反应 （94变性30s， 55退火30s， 72延 伸1min） ； 24个循环反应 （94变性30s， 58退火30s， 72延伸1min） ； 72延伸10min； 4 终止反应。 0104 阳性克隆送公司测序， 经鉴定后， 将菌种与40%的甘油 （1:1） 混合保存在。
38、-80。 0105 四、 重组酿酒酵母细胞 （EBY100-pYD1/ORF6-UN） 的诱导表达 0106 接10 l上述保存的菌液 （以EBY100和EBY100-pYD1作对照） 进入4-5mL酵母浸出 粉胨葡萄糖 （YeastExtractPeptoneMedium， YPD） 培养基中， 30、 225rpm摇床震荡培养 24-48h； 0107 吸取上述菌液1-2mL接种于50mL含2%葡萄糖 （glucose） 的无氨基酸酵母氮源-酪 蛋白水解物 （YNB-CAA） 培养基的200mL锥形瓶中， 瓶口用6层纱布封住， 30、 225rpm摇床震 荡培养24-48h， 至OD600。
39、的在2-5之间时， 离心15min， 弃上清； 0108 用含2%半乳糖 （galactose） 的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物 （YNB-CAA） 培养 基悬浮细胞， 使稀释后细胞的OD600在0.5-1之间， 摇瓶瓶口用6层纱布封住， 20-25、 225rpm摇床震荡培养， 诱导表达蛋白； 0109 48h后， 5000rpm离心15min弃上清， 回收细胞沉淀 （表达产物） 。 0110 将所得细胞沉淀冷冻干燥24h， 即得到细胞干粉， 该细胞干粉即为瘤胃源全细胞木 说明书 7/9 页 12 CN 103525789 B 12 聚糖酶生物催化剂， -20保存。 0111 五、 表达产。
40、物鉴定 0112 荧光抗体鉴定 0113 取1mL上述表达产物 （以EBY100和EBY100-pYD1作对照） ， 离心后弃上清； 用2mL磷酸 缓冲液 （PBS， pH7.4） 悬浮细胞沉淀， 离心后弃上清， 重复此过程清洗两次； 用2mL添加了10% 胎牛血清 （FBS） 不含抗体的PBS缓冲液室温孵育20min； 离心后弃上清， 用荧光抗体 （Anti- V5-FITCantibody） 避光处理细胞1h （Anti-V5-FITCantibody： PBS(含10%FBS)=1:300） ； 离 心后弃上清， 用不含抗体的PBS缓冲液悬浮沉淀， 重复此过程清洗三次后离心弃上清； 用4。
41、0 l灭菌水悬浮细胞， 滴加5-10 l于载玻片上， 盖上盖玻片， 在激光共聚焦显微镜下观察细胞 表面情况， 见图6。 以上离心过程均在4， 3000-5000*g条件下进行， 离心时间5-10min。 0114 因pYD1质粒含有荧光基因V5epitope （如图1所示） ， 因此EBY100-pYD1/ORF6-UN和 EBY100-pYD1经过荧光抗体处理， 在细胞表面能看到绿色荧光。 0115 木聚糖酶活性鉴定 0116 取1 l上述表达产物点种在雷马氏亮蓝-木聚糖 （RemazolBrilliantBlueR-D- Xylan， RBB-xylan） 平板上， 在菌液周围有透明圈形成。
42、， 说明其具有木聚糖酶活性。 0117 木聚糖酶全细胞催化剂酶学特性鉴定 0118 经鉴定， 该瘤胃源木聚糖酶全细胞生物催化剂的最适温度为50， 在50孵育 30min， 酶活性能保持80%左右， 90孵育30min， 酶活性能保持44%； 最适pH为6.0， 在pH范围 4.0-10.0能维持大于50%的活性； 在最适条件下的酶活性为30U/g （指每克细胞干重有30U的 木聚糖酶活性） ， 结果见图7、 图8、 图9和图10。 0119 全细胞木聚糖酶体外发酵试验 0120 下面结合瘤胃体外发酵试验详细说明该全细胞木聚糖酶对瘤胃发酵的作用。 0121 采用压力读取式体外产气法开展全细胞木聚。
43、糖酶对瘤胃发酵的作用试验。 试验分 两组进行， 分别为对照组、 全细胞木聚糖酶组， 每组三个重复。 试验底物为粗质饲料玉米秸 秆。 称取干物质0.5g的底物， 置入120mL产气瓶中， 再将产气瓶置于厌氧培养箱中。 晨饲前， 从3头瘘管奶牛瘤胃的3个不同位点共抽取大约2L左右的瘤胃液， 经4层纱布过滤后， 与9倍 体积的厌氧人工唾液混合后， 得到人工瘤胃液。 取50mL人工瘤胃液于每个产气瓶， 全细胞木 聚糖酶组添加0.1g步骤五所得的冻干粉， 终浓度为2g/L， 即每升人工瘤胃液中加2g全细胞 木聚糖酶。 对照组不添加冻干粉， 将对照组和全细胞木聚糖酶组置于390.5的恒温摇床 中培养24h。
44、后， 测定3,6,9,12,24h的产气量， 每次测定后放气， 最后计算累积产气量。 取1ml 发酵后的上清用气相色谱仪测量挥发性脂肪酸含量， 再取1ml上清用比色法测定氨态氮含 量。 实验结果见表1。 0122 表1全细胞木聚糖酶对瘤胃体外发酵24h的作用 0123 说明书 8/9 页 13 CN 103525789 B 13 0124 注： 肩标字母不同为差异显著 （P0.05） 0125 与对照组相比， 3,6,9,12,24h的产气量， 以及24h发酵后的总VFA、 氨态氮和干物质 降解率都显著增加 （P0.05） ， 说明该全细胞木聚糖酶的添加对瘤胃发酵具有明显的促进作 用， 能提高。
45、动物对粗饲料的利用效率。 0126 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说明书 9/9 页 14 CN 103525789 B 14 SEQUENCELISTING 浙江大学 一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法 WJK001 3 PatentInversion3.3 1 699 DNA 天然序列 1 gatttttgtcaaactgccgcccatagtggaacaagcaggcaagttactacgaataccgtg60 ggttcgttcgacaacggtattggtt。
46、acgaactttggaacgagggcggcaatggcggttcc120 gcgacattctatgacgacggctccttcaactgcaaaatgaccggcgccaaggactatctg180 tgccgtgcaggcctttctttcaatagcgataagactcatggtgaaattggacacatgaag240 gcggatttcaagttggtcaagagaaatctttccggaatccagtattcctacatcggcatt300 tacggctggactcgtgaaccgctggtggaatggtacatcgtggacaacaccggtagtgac360 tatat。
47、gcccggtgactgggttgcccagggaaattccaaaaagaagcacggcgtgtttaaa420 attgatggagccgattatacggtttacgagggagaccgaacatcctattccattgatggc480 gacggcaaatatttcaagcaatatttcagcgtccgtacgagcaagcgcgattgcggtacc540 atcgacattactgcacacttcaaaaagtgggaagaacttggcatgaaaatgggcaagatg600 cacgaggccaagattcttggcgaggctggcaactctaatggcgcacagg。
48、ctaggggcgaa660 序列表 1/2 页 15 CN 103525789 B 15 tacgatttcccctatgccaaggtctatatcgagggggcg699 2 30 DNA 人工序列 2 tgacggatccgatttttgtcaaactgccgc30 3 29 DNA 人工序列 3 cacctcgagcgccccctcgatatagacct29 序列表 2/2 页 16 CN 103525789 B 16 图1 说明书附图 1/7 页 17 CN 103525789 B 17 图2 说明书附图 2/7 页 18 CN 103525789 B 18 图3 图4 图5 说明书附图 3/7 页 19 CN 103525789 B 19 图6 说明书附图 4/7 页 20 CN 103525789 B 20 图7 图8 说明书附图 5/7 页 21 CN 103525789 B 21 图9 说明书附图 6/7 页 22 CN 103525789 B 22 图10 说明书附图 7/7 页 23 CN 103525789 B 23 。