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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410182887.0 (22)申请日 2014.04.30 C12N 9/20(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (73)专利权人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381 号 (72)发明人 王永华 元冬娟 蓝东明 王方华 杨博 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 宫爱鹏 CN 10352。
2、5784 A,2014.01.22, 未公开 .lipase Janibacter sp. HTCC2649.GenBank .2013, 登录号 ： WP_009776835. (54) 发明名称 一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种海洋微生物来源的低温偏 甘油酯脂肪酶及其应用， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。编码上述偏甘油酯脂肪酶的基因序列 如 SEQID NO:1 所示。本发明获得中性脂肪酶， 在 pH7.0 具有最适酶活性， 其对橄榄油的水解反应 中， 最适温度为 40； 对大豆卵磷脂为底物的水解 反应中， 最适反应温度为 。
3、30。MAJ1 对茶油的水 解反应表明其是一个 1,3 位选择性的偏甘油酯脂 肪酶。 同时该脂肪酶在 20 30处理 3小时仍 然具有大于 95的酶相对剩余活性， 可以应用于 去除油脂中偏甘油酯。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 于婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图8页 CN 103966187 B 2016.05.04 CN 103966187 B 1.一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶， 其特征在于， 其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。 2.一种偏甘油酯脂肪酶基因， 其特征在于， 基因序列如S。
4、EQIDNO:1所示。 3.包含权利要求2所述基因的表达载体。 4.一种细胞， 其特征在于， 包含权利要求3所述的载体， 或其基因组中整合有权利要求2 所述的脂肪酶基因。 5.一种偏甘油酯脂肪酶重组菌株的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)制备偏甘油酯脂肪酶表达质粒： a.人工合成权利要求2的基因序列； b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后， 限制性内切酶KpnI和SalI分别对纯化的基 因片段和质粒pGAPZ A进行双酶切消化， 连接， 转化至大肠杆菌E.coliDH5 感受态细胞， 得 到脂肪酶表达质粒； (2)利用表达质粒制备重组菌株： a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒。
5、经限制性内切酶BlnI线性化后， 电转至宿主细胞； b.将转化液涂布于含有100mg/mlZeocin的YPD平板中， 30培养3天后， 平板上长出酵 母单菌落为重组菌株。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述PCR的引物序列如下： MAJ1For5 -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3 MAJ1Rev5 -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3 。 7.根据权利要求5或6所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕 赤酵母(Pichiapastoris)X-33。 8.权利要求5或6或。
6、7所述的方法制备的重组菌株。 9.权利要求1所述脂肪酶的应用， 其特征在于， 该脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成 甘油二酯， 或用于植物油精炼过程中的酶法脱胶。 10.一种生产权利要求1所述的脂肪酶的方法， 其特征在于， 包括： 培养权利要求4所述 的细胞， 从培养物中分离出表达产物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103966187 B 2 一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程和酶工程领域， 具体的说， 涉及一种海洋微生物来源的低温 偏甘油酯脂肪酶及其应用。 背景技术 0002 脂肪酶(E.C.3.1.1.3)， 也称为三酰基甘油酰基水解。
7、酶， 能够催化甘油三酯水解， 生成的产物包括甘油二酯、 甘油单酯、 脂肪酸和甘油。 偏甘油酯脂肪酶是指对酰基甘油碳链 数量具有催化选择性的一类脂肪酶， 它们对甘油三酯并没有催化水解活力， 仅对甘油二酯 和/或甘油单酯具有活力。 偏甘油酯脂肪酶主要有两类： 甘油单酯-甘油二酯脂肪酶和甘油 单酯脂肪酶。 偏甘油酯脂肪酶在饲料添加剂、 食品与营养， 农业、 日用化学工业都展现出诱 人的应用前景。 在油脂加工领域， 偏甘油酯脂肪酶可用于制备高纯度的甘油酯产品。 因此， 新型偏甘油酯脂肪酶的开发为高效制备甘油二酯和开发高纯度的甘油二酯生产工艺提供 现实意义。 0003 目前已知微生物来源的偏甘油酯脂肪酶。
8、非常有限。 另外， 国内开发的脂肪酶的酶 学性质并不能适应新的使用需求。 目前使用的脂肪酶大多都是中温酶(其最适温度基本都 在50左右)， 而在食品、 洗涤、 制药、 脂类加工、 环境修复等领域中， 却需要低温脂肪酶的参 与来进行。 因此， 开发低温酶获得新型有工业价值的偏甘油酯脂肪酶有潜在的需要。 利用生 活在高盐度、 高压、 低营养和低温等的所谓生命极限环境下的微生物， 筛选新型低温酶成为 寻找符合工业化要求的脂肪酶的主要途径之一。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种对偏甘油酯水解活性高的海洋微生物来源的低温偏甘 油酯脂肪酶， 可以应用于选择性去除油脂产品中的偏甘油酯， 以使其满足。
9、工业上的需要。 0005 本发明的第一个方面公开了一种来自海洋微生物的新型偏甘油酯脂肪酶。 0006 本发明的另一个方面， 提供了一种编码上述脂肪酶的优化的核酸分子， 获得在毕 赤酵母高表达的偏甘油酯脂肪酶。 0007 本发明的第三个方面， 提供了一种载体， 其包含上述多核苷酸。 0008 本发明的第四个方面， 提供了一种细胞， 其包含上述载体， 或其基因组中整合有上 述多核苷酸。 0009 本发明的第五个方面， 提供了上述脂肪酶的用途， 用于催化偏甘油酯水解反应。 0010 本发明的第六个方面， 提供了一种生产上述脂肪酶的方法。 0011 本发明的技术方案具体如下： 0012 一种海洋微生物。
10、来源的低温偏甘油酯脂肪酶， 该酶是对两面神菌(Janibacter sp.HTCC2649)偏甘油酯脂肪酶基因序列进行优化得到的， 其氨基酸序列如SEQIDNO:2所 示。 0013 一种偏甘油酯脂肪酶基因， 序列如SEQIDNO:1所示。 说明书 1/6 页 3 CN 103966187 B 3 0014 一种包含上述基因的表达载体。 0015 一种细胞， 包含上述表达载体， 或其基因组中整合有上述脂肪酶基因。 0016 一种生产上述脂肪酶的方法， 包括： 培养上述细胞， 从培养物中分离出表达产物。 0017 一种偏甘油酯脂肪酶重组菌株的制备方法， 包括如下步骤： 0018 (1)制备偏甘油。
11、酯脂肪酶表达质粒： 0019 a.人工合成权利要求2的基因序列； 0020 b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后， 限制性内切酶KpnI和SalI分别对纯化 的基因片段和质粒pGAPZ A进行双酶切消化， 连接， 转化至大肠杆菌E.coliDH5 感受态细 胞， 得到脂肪酶表达质粒； 0021 (2)利用表达质粒制备重组菌株： 0022 a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒经限制性内切酶BlnI线性化后， 电转至宿主细 胞； 0023 b.将转化液涂布于含有100mg/mlZeocin的YPD平板中， 30培养3天后， 平板上长 出酵母单菌落为重组菌株。 0024 步骤(1)所述PCR的引物。
12、序列如下： 0025 MAJ1For5 -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3 0026 MAJ1Rev5 -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3 。 0027 步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)。 0028 上述脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯， 或用于植物油精炼过程中的 酶法脱胶。 0029 与现有技术相比， 本发明具有如下优点： 0030 (1)本发明获得中性脂肪酶， 在pH7.0具有最适酶活性， 其对橄榄油的水解反应中， 最适温度为40； 对大豆卵磷脂为底物的水解反应中， 最。
13、适反应温度为30。 同时该脂肪酶 在2030处理3小时仍然具有大于95的酶相对剩余活性。 因此， 可以通过温度来调节 其脂肪酶和磷脂酶活性。 0031 (2)本发明所得毕赤酵母表达菌株具有良好的偏甘油酯水解活性， 也是首个海洋 微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶， 同时该酶的脂肪酶和磷脂酶活性相当， 因此， 可应用于 植物油精炼过程中的酶法脱胶， 也可应用于去除油脂中的偏甘油酯。 同时， 作为一种低温 酶， 可广泛运用于食品、 洗涤、 制药、 脂类加工、 环境修复等需要低温脂肪酶参与的领域中。 附图说明 0032 图1为来自两面神菌HTCC2649的编码脂肪酶的核酸序列MAJ1及其优化后的编码脂 。
14、肪酶的核酸序列MAJ1-optimum(SEQIDNO:1)。 0033 图2为两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶MAJ1在质粒pGAPZ A上的重组子结构图。 0034 图3为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的最适反应温度， 以温度对相对酶活力()作图。 0035 图4为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的最适反应pH， 以pH对相对酶活力()作图。 0036 图5为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 说明书 。
15、2/6 页 4 CN 103966187 B 4 肪酶的热稳定性， 以温度对残余酶活力()作图。 0037 图6为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的pH稳定性， 以pH对残余酶活力()作图。 0038 图7为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的温度对脂肪酶酶活的影响。 0039 图8为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的pH对脂肪酶酶活的影响。 0040 图9为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastor。
16、is)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的温度对磷脂酶酶活的影响。 0041 图10为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶的pH对磷脂酶酶活的影响。 0042 图11为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichiapastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂 肪酶纯化后样品的SDS-PAGE电泳图。 泳道一是蛋白分子量marker， 泳道二是纯化后的MAJ1。 0043 图12为脂肪酶的脂肪酸底物链长选择性图。 0044 图13为脂肪酶的催化植物油水解反应随时间变化的图， A为富含甘油三酯的茶油 水解反应后的各脂类组成， B为。
17、富含甘油二酯的油脂水解反应后的各脂类组成， C为富含甘 油二酯： 单甘油酯(1:1v/v)的油脂水解反应后的各脂类组成。 0045 图14为脂肪酶催化植物油水解的标准色谱图。 具体实施方式 0046 下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述， 但本发明的实施方式不限 于此， 对于未特别注明的工艺参数， 可参照常规技术进行。 0047 实施例1 0048 偏甘油酯脂肪酶MAJ1毕赤酵母表达载体的构建 0049 根据Genbank的两面神菌HTCC2649偏甘油脂肪酶maj1基因(GenBank登录号： WP_ 009776835)， 委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法， 并根据毕赤。
18、酵母密码子偏 好性对序列进行优化(序列SEQIDNO： 1)。 基因合成后， 利用下面引物扩增成熟肽序列， 0050 MAJ1For5 -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCCGTTG-3 0051 (SEQIDNO:3) 0052 MAJ1Rev5 -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3 0053 (SEQIDNO:4) 0054 PCR扩增条件： 945min； 9420s， 5330s， 7280s， 25个循环； 727min。 PCR扩 增产物经DNA纯化试剂盒纯化后， 限制性内切酶KpnI和SalI分别对纯化的基因片段和质粒 p。
19、GAPZ A(购自Invitrogen)进行双酶切消化， 连接， 转化至大肠杆菌E.coliDH5 感受态细 胞。 涂布于LB(含25ug/mlZeocin)平板。 挑取阳性克隆通过KpnI和SalI双酶切鉴定及基因 测序， 结果表明获得了pGAPZ A-MAJ1表达质粒。 0055 实施例2 0056 脂肪酶MAJ1的重组表达及纯化 0057 将脂肪酶MAJ1表达质粒经限制性内切酶BlnI线性化后， 电转至毕赤酵母X-33(购 说明书 3/6 页 5 CN 103966187 B 5 自Invitrogen)感受态态细胞。 将转化液涂布于YPD(100ug/mLZeocin)平板， 30培养。
20、3天 后， 挑取平板上单菌落于100mLYPD培养基中发酵72小时后， 离心并浓缩发酵液进行SDS- PAGE检测， 获得能够表达脂肪酶MAJ1阳性重组菌株。 0058 将重组菌株接种至100mLYPD培养基中， 30， 200rpm振荡培养48-72小时后， 收集 发酵上清液(10,000rpm， 离心20min， 4)。 0059 将MAJ1重组菌株的发酵上清液 用0 .45m的 滤膜抽滤。 后 用10kD膜胞 (Vivaflow200， Sartorius,Germany)将发酵液置换成20mMpH7.4含30mM咪唑的磷酸盐缓冲 液， 并将发酵液浓缩到大约30mL。 浓缩发酵上清利用镍。
21、金属螯合亲和层析柱(HisTrapHP column,GEHealthcare)， 流速1mL/min， 最后用20mMpH7.4含500mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗 脱目标蛋白。 利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定(见图11)。 0060 实施例3 0061 最适温度及温度稳定性 0062 温度对MAJ1脂肪酶酶活的影响： 在不同温度(5-50)条件下， 采用比色法测定 MAJ1酶活。 反应体系包括100mMNa2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)， 1mM对硝基苯酚辛酸酯(p- nitrophenolcaprylate， p-NPc)， 10 L酶液， 各温度下反应5mi。
22、n， 测定405nm处的吸光值 OD405。 温度对MAJ1酶活的影响用相对酶活表示， 测定的最大酶活定为100。 所有实验重复 三次。 结果表明MAJ1的最适反应温度是30， 在25达到了80的相对酶活(见图3)。 0063 测定MAJ1在不同温度条件下的稳定性时， 首先将MAJ1在不同的温度(20、 30和 40)条件下温育， 分别在0.5h、 1h、 1.5h、 2h和3h取样， 采用比色法测定其剩余酶活。 温度对 MAJ1稳定性的影响用相对酶活表示， 测定的最大酶活定为100。 所有实验重复三次。 结果 表明MAJ1在20-30处理3h后， MAJ1能保持95以上的脂肪酶酶活力。 表明。
23、MAJ1是一个低 温稳定脂肪酶(见图5)。 0064 实施例4 0065 最适pH及pH稳定性 0066 pH对MAJ1酶活的影响： 在不同pH(5.0、 6.0、 7.0、 8.0和9.0)条件下， 采用比色法测 定MAJ1酶活。 酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。 使用的各种pH溶液为： 100mM NaAc-HAc溶液(pH3.0、 pH4.0、 pH5.0)， 100mMNa2HPO4-NaH2PO4溶液(pH6.0,pH7.0)， 50mM Tris-HCl溶液(pH8.0)。 pH对MAJ1酶活的影响用相对酶活来表示， 测定的最大酶活定为 100。 所有实验重复三次。 结果表。
24、明MAJ1的最适pH值是7.0(见图4)。 0067 测定MAJ1在不同pH条件下的稳定性时， 首先将MAS1在不同的pH(3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0和9.0)条件下放置12h， 测定MAJ1的剩余酶活力。 酶活测定反应体系和反应条 件参考实施例3。 pH对MAJ1稳定性的影响用相对酶活表示， 测定的最大酶活定为100。 所有 实验重复三次。 结果表明MAJ1在pH3.0-9.0处理2h后， MAJ1在pH6.0-9.0保持90以上的脂 肪酶酶活。 表明MAJ1是一个偏碱性的脂肪酶(见图6)。 0068 实施例5 0069 橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活 0070 在。
25、对照组和实验组的100mL三角瓶中， 各加底物溶液(4PVA溶液:橄榄油,3:1) 4.00mL和相应pH值缓冲液5.00mL， 对照组中加入95乙醇15.00mL， 在特定温度下水浴预热 5min， 然后， 在两瓶中各加待测酶液1.00mL， 在特定温度水浴中准确反应15min， 在实验组中 说明书 4/6 页 6 CN 103966187 B 6 立即补加95乙醇15 .00mL终止反应， 取出。 对照组和实验组溶液在自动滴定仪下用 0.05mol/LNaOH标准溶液滴定， 以滴定曲线的拐点为滴定终点， 记录消耗NaOH标准溶液的 体积， 按下式计算酶活力。 0071 X(VV0)1/15。
26、nc/0.0550200(VV0)nc/33-1 0072 其中： X为样品的酶活力(U/mL)； 0073 V为滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积(mL)； 0074 V0为滴定空白时消耗NaOH标准溶液的体积(mL)； 0075 c为NaOH标准溶液浓度(mol/L)； 0076 0.05为NaOH标准溶液浓度换算系数； 0077 50为0.5mol/LNaOH标准溶液1.00mL相当于脂肪酸50 mol； 0078 15为反应时间(min)； 0079 n为稀释倍数。 0080 脂肪酶活力的定义为： 1mL酶液于特定温度与pH值的条件下， 水解脂肪每分钟产生 1微摩尔( mol)的脂肪。
27、酸所需的酶量即为1个脂肪酶单位， 以U/mL表示。 0081 结果表明MAJ1在以橄榄油为底物的反应中的最适温度为40， 最适pH值是7.0(见 图7和图8)。 0082 实施例6 0083 大豆卵磷脂法测定磷脂酶酶活 0084 在对照组和实验组的100mL三角瓶中， 各加底物溶液(4无油磷脂溶于0.5PVA) 25.00mL， 对照组中加入95乙醇15.00mL， 在特定温度下水浴预热5min， 然后， 在两瓶中各 加待测酶液1.00mL， 在特定温度水浴中准确反应15min， 在实验组中立即补加95乙醇 15.00mL终止反应， 取出。 空白和样品溶液在自动滴定仪下用0.05mol/LNa。
28、OH标准溶液滴 定， 以滴定曲线的拐点为滴定终点， 记录消耗NaOH标准溶液的体积， 按下式计算酶活力。 0085 计算公式X(VV0)*c*50*n/(0.05*t)103*(VV0)*c*n/t式2-1 0086 其中： X样品的酶活力， U/mL； 0087 V滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积， ml； 0088 V0滴定空白时消耗的NaOH标准溶液体积， ml； 0089 cNaOH标准溶液的浓度， mol/L； 0090 500.05mol/LNaOH标准溶液1.00ml相当于脂肪酸50 mol； 0091 n酶液样品的稀释倍数； 0092 t测定酶活时的反应时间。 0093 磷。
29、脂酶酶活力定义为： 在特定条件下1min水解磷脂产生1微摩尔( mol)量游离脂 肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位(U)。Ultra为液体酶制剂， 其磷脂酶 活力表示为每mL酶液所测得的磷脂酶活力单位， 即U/mL。 0094 结果表明MAJ1在以大豆卵磷脂为底物的反应中的最适温度为30， 最适pH值是 7.0(见图9和图10)。 0095 实施例7 0096 MAJ1的脂肪酸底物链长选择性 0097 不同脂肪酸链长的1mM对硝基苯酚酯作为底物， 采用比色法测定MAJ1酶活。 酶活测 说明书 5/6 页 7 CN 103966187 B 7 定反应体系和反应条件参考实施例3。 不同链长底物。
30、对MAJ1酶活的影响用相对酶活表示， 测 定的最大酶活定为100。 所有实验重复三次。 结果表明MAJ1对C10底物的水解活性最大(见 图12)。 0098 实施例8 0099 偏甘油酯对TAG、 DAG和MAG的水解 0100 在25mL具塞三角瓶中加入3mL的茶油底物和来源于茶油的甘油二酯， 单甘油酯(纯 度达到96以上)， 加入经纯化后的MAJ1， 加酶量为100U/mL(U/v， 相对于油脂体积)酶液， 酶 液利用20mMpH7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释至1mL， 混合均匀后预热20min。 反应温度为30， 摇床转速为200rpm， 反应过程中分别在0.5h,1h,2h,3h,4h,5。
31、h,6h,8h及12h进行取样。 将所 取10 L样品溶于1mL的流动相中， 流动相的比例为： 正己烷/异丙醇/甲酸15:1:0.003(体 积比)， 震荡均匀后， 于10,000rpm下离心5min， 除去下层水相， 将上层有机相用0.45 m的有 机相滤膜过滤后， 取10 L进行HPLC分析。 0101 HPLC检测的条件为： 色谱柱为Luna5uSilica100A， 2504.60mm(phenomenex)， 流 动相为正己烷:异丙醇:甲酸15:1:0.003(体积比)； 流动相流速为1.0mL/min， 柱温保持30 ； 进样量为10 L， 每个样品检测时间约为30min， 数据处。
32、理软件为Breeze工作站。 脂肪酶 MAJ1对不同底物进行水解反应后各脂类组分含量的变化(见图13)。 在脂肪酶MAJ1催化的水 解甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)反应中， 甘油三酯的含量没有变化， 表明脂肪酶MAJ1不 能催化水解TAG。 在脂肪酶MAJ1催化的水解甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)和甘油二酯:单 甘油酯(monoacylglycerol,MAG)(1:1,v/v)的反应中， MAJ1倾向于水解1,3位甘油二酯生成 1位或者3位单甘油酯(1/3-monoacylglycerol,1/3-MAG)及自由脂肪酸(freefatty acids,F。
33、FAs)。 表明脂肪酶MAJ1是一个1,3位特异性偏甘油酯脂肪酶， 可应用于特异性的出 除位于1或者3位甘油酯上的脂肪酸。 0102 总之， MAJ1作为一个低温偏甘油酯脂肪酶， 同时具有相当的磷脂酶酶活， 可应用于 植物油精炼过程中的酶法脱胶和去除偏甘油酯， 用于制备高纯度的甘油三酯。 同时， 也可应 用于油脂改性。 说明书 6/6 页 8 CN 103966187 B 8 0001 序列表 1/5 页 9 CN 103966187 B 9 0002 序列表 2/5 页 10 CN 103966187 B 10 0003 序列表 3/5 页 11 CN 103966187 B 11 0004。
34、 序列表 4/5 页 12 CN 103966187 B 12 0005 序列表 5/5 页 13 CN 103966187 B 13 图1 图2 说明书附图 1/8 页 14 CN 103966187 B 14 图3 图4 说明书附图 2/8 页 15 CN 103966187 B 15 图5 图6 说明书附图 3/8 页 16 CN 103966187 B 16 图7 图8 说明书附图 4/8 页 17 CN 103966187 B 17 图9 图10 图11 说明书附图 5/8 页 18 CN 103966187 B 18 图12 说明书附图 6/8 页 19 CN 103966187 B 19 图13 说明书附图 7/8 页 20 CN 103966187 B 20 图14 说明书附图 8/8 页 21 CN 103966187 B 21 。