技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种检测CYP3A4基因多态性的 试剂盒及方法。
背景技术
细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)，又称混合功能氧化酶(Mixed function oxcidase)、单加氧酶(Monooxygenase)或药物代谢酶，其广泛分布于动物、 植物和微生物体内。在哺乳动物的组织中已经发现有20多种同工酶，分为 CYP1～4的4个家族。CYP3A型酶在体内占CYP450总量的70％，占肝内CYP450 的30％，参与60％以上常用药物在体内的代谢转化。目前，在人体内己发现4 种CYP3A～基因，即CYP3A4、CYF3A5，CYP3A7和CYP3A43，而其中CYP3A4 是临床上最重要的P450酶之一，参与代谢38个类别的150多种药物的氧化代 谢，约占全部药物的50％，是许多药物因相互作用发生不良反应的根源。CYP3A4 是肝脏和胃肠道中主要的P450代谢酶，其活性表现为单态分布，在许多药物和 环境污染物的代谢中发挥着重要作用。研究表明，CYP3A4不仅在表达水平上具 有显著的个体差异，其底物的体内代谢也可相差10倍以上。编码CYP3A4蛋白 的基因位于染色体7q21.3—22.1，编码区域包含13个外显子和12个内含子，主 要调控其转录及表达的结构区位于5端，长约27kb，CYP3A4基因多态性具体 详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.ki.se)。到目前为止CYP3A4 已有24个等位基因已经确定，不同种族间CYP3A4SNPs的发生频率不同，如 CYP3A4*3和*17仅在白种人中发现，CYP3A4*15只在黑种人中发现，而 CYP3A4*16仅存在于日本人和墨西哥人中，在已发现的39个SNPs中， CYP3A4*4，*5，*6，*18，*19在中国人中已确定，它们的发生频率分别为1.5 ％，0.98％，0.5％，2％和2％。许多常用药物是CYP3A4的强诱导剂或抑制剂， 当CYP3A4作为诱导剂时，其与代谢底物合并用药，能大大提高后者的代谢速 率，从而可能使后者无法达到发挥药效时的血药浓度，降低后者的利用度或者 无法达到治疗效果。相反，当CYP3A4作为抑制剂时，它们与经CYP3A4代谢 的药物合并用药时，会减少后者的代谢速率，导致后者的血药浓度升高，可能 引起不良反应。
现有技术中采用直接测序法检测CYP3A4基因多态性，即首先采用PCR扩 增不同的目的片段后，回收纯化PCR产物，然后进行测序。
由于直接测序法的检测时间过长，一般需要48个小时以上，使该检测的效 率降低，因此，为检测CYP3A4基因多态性带来不便。
发明内容
针对现有技术中检测CYP3A4基因多态性的时间长、步骤繁琐、需要多次 PCR的问题，本发明的目的在于提供一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种检测CYP3A4基因多态性的方法。
为了解决现有技术检测CYP3A4基因多态性时间长、步骤繁琐、需要多次 PCR的问题，本发明采用了以下技术方案：
一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒，包括检测用引物，所述检测用引 物包括：CYP3A4基因第1～3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4 基因第4～7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第8～11外显 子的长片段扩增特异性上下游引物和CYP3A4基因第12～13外显子的长片段扩 增特异性上下游引物中的至少一对，以及与所述第1～3外显子的长片段DNA、 第4～7外显子的长片段DNA、第8～11外显子的长片段DNA以及第12～13外显 子的长片段DNA相对应的CYP3A4基因的各外显子的上下游测序引物中的至少 一对，其中：
所述CYP3A4基因第1～3外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表 中SEQ ID NO:1所示；
所述CYP3A4基因第1～3外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表 中SEQ ID NO:2所示；
所述CYP3A4基因第4～7外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表 中SEQ ID NO:3所示；
所述CYP3A4基因第4～7外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表 中SEQ ID NO:4所示；
所述CYP3A4基因第8～11外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表 中SEQ ID NO:5所示；
所述CYP3A4基因第8～11外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表 中SEQ ID NO:6所示；
所述CYP3A4基因第12～13外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列 表中SEQ ID NO:7所示；
所述CYP3A4基因第12～13外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列 表中SEQ ID NO:8所示；
所述CYP3A4基因第1外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9 所示；
所述CYP3A4基因第1外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:10 所示；
所述CYP3A4基因第2外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:11 所示；
所述CYP3A4基因第2外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:12 所示；
所述CYP3A4基因第3外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:13 所示；
所述CYP3A4基因第3外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:14 所示；
所述CYP3A4基因第4外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:15 所示；
所述CYP3A4基因第4外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:16 所示；
所述CYP3A4基因第5～6外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:17所示；
所述CYP3A4基因第5～6外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:18所示；
所述CYP3A4基因第7外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:19 所示；
所述CYP3A4基因第7外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:20 所示；
所述CYP3A4基因第8外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:21 所示；
所述CYP3A4基因第8外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:22 所示；
所述CYP3A4基因第9外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:23 所示；
所述CYP3A4基因第9外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:24 所示；
所述CYP3A4基因第10外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:25所示；
所述CYP3A4基因第10外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:26所示；
所述CYP3A4基因第11外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:27所示；
所述CYP3A4基因第11外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:28所示；
所述CYP3A4基因第12外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:29所示；
所述CYP3A4基因第12外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:30所示；
所述CYP3A4基因第13外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:31所示；
所述CYP3A4基因第13外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:32所示。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内参基因 ACTB以及内参基因ACTB扩增引物，其中，
所述内参基因ACTB扩增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:33 所示；
所述内参基因ACTB扩增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:34 所示；
所述内参基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO:35所示。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括测序缓冲液。 更有选地，所述测序缓冲液为Buffer缓冲液，所述Buffer缓冲液的pH为8.3。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照和 阳性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为CYP3A4*8型的 CYP3A4基因多态性中的含389G>A突变位点的基因序列DNA样品。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括各种PCR反 应试剂或者各种PCR反应试剂的混合物；更优选地，所述各种PCR反应试剂包 括：PCR预混合液、Mg2+、dNTPs dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌体的基因32 编码蛋白以及无RNase去离子水。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内部阳性控 制序列以及内部阳性控制序列的扩增引物，其中：所述内部阳性控制序列如序 列表中SEQ ID NO:36所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物如序 列表中SEQ ID NO:37所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物如序 列表中SEQ ID NO:38所示。
在上述试剂盒中，各种优选实施方式可以任意组合。
一种检测CYP3A4基因多态性的方法，包括如下步骤：
步骤一，提取受检者基因组DNA；
步骤二，以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1 和SEQ ID NO:2所示的CYP3A4基因第1～3外显子的长片段扩增特异性上下游 引物、如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的CYP3A4基因第4～7外 显子的长片段扩增特异性上下游引物、如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6 所示的CYP3A4基因第8～11外显子的长片段扩增特异性上下游引物或者如序列 表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12～13外显子的长片 段扩增特异性上下游引物，PCR扩增CYP3A4基因第1～3外显子的长片段DNA、 CYP3A4基因第4～7外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第8～11外显子的长片 段DNA或CYP3A4基因第12～13外显子的长片段DNA；
步骤三，对步骤二的PCR扩增产物进行凝胶电泳，并回收纯化得到的 CYP3A4基因第1～3外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第4～7外显子的长片 段DNA、CYP3A4基因第8～11外显子的长片段DNA或CYP3A4基因第12～13 外显子的长片段DNA；
步骤四，以步骤三回收纯化后得到的产物为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的上下游引物、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所 示的上下游引物、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的上下游引物、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的上下游引物、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所 示的上下游引物、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的上下游引物、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所 示的上下游引物、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的上下游引物、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的上下游引物、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所 示的上下游引物以及SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至 少一对相应的上下游测序引物进行测序反应；
步骤五，将步骤四得到的测序反应产物纯化后上测序仪进行测序，将测得序 列在NCBI核酸数据库中进行比对分析以获得CYP2D6基因多态性。
在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二中，所述PCR的反 应条件如下：先经过95℃3min；然后进入PCR循环，所述PCR循环为95℃30s、 57℃3.6min、72℃3min，共35个循环；最后72℃10min。更优选地，所述PCR 的反应液中部分组分及浓度如下：1×的PCR预混合液、Mg2+：2.5-4.0mM、dNTPs： 0.2-0.4mM、dUTP：0.3-0.6mM、Taq酶：0.2U/μL、BSA：1.25wt％、T4噬菌 体的基因32编码蛋白：1nmol/L。
在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤四中，所述测序反应 的条件如下：先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10 s，50℃5s，60℃4min，共25个循环。
在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二中，所述PCR反应 中还加入了如序列表中SEQ ID NO:36所示的内部阳性控制序列、如序列表中 SEQ ID NO:37所示的内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物以及如序列表 中SEQ ID NO:38所示的内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物。
本发明试剂盒及检测方法的优点和效果如下：
(1)敏感性高：可以同时检测出目前报道的24种CYP3A4基因多态性， 具体详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.ki.se)。
(2)特异性强：使用特异性引物扩增CYP3A4基因长片段序列，然后进行 测序，对特定的分子进行识别，准确性高，特异性好、假阳性低，可达到直接 测序法的准确度，甚至比直接测序法更准确。
(3)简便安全：操作简单、安全，只需一次PCR扩增后可以同时进行多个 外显子测序检测多态性，极大地减少了检测环节，降低了污染的可能性。
(4)全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制 体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。
(5)快速：速度快、高通量，只需一次性扩增CYP3A4基因长片段序列， 而无需对CYP3A4基因每个外显子进行扩增，极大地降低了劳动强度，节省了 检测时间，可在8小时内完成。
本发明的试剂盒及方法，利用长片段PCR测序法快速、准确的检测目前报 道的24种CYP3A4基因多态性，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的采用实施例1的试剂盒的长片段扩增引物对 扩增受检者外周血DNA PCR产物凝胶电泳结果，其片段大小预计的核酸片段大 小一致，扩增结果对应为：第一条带为Marker，第二条带为CYP3A4第1～3外 显子引物扩增长片段，第三条带为CYP3A4第4～7外显子引物扩增长片段，第 四条带为CYP3A4第8～11外显子引物扩增长片段，第六条带为CYP3A4第12～13 外显子引物扩增长片段，第七条带为阳性对照，第八条带为阴性对照；
图2是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的CYP3A4基因第7外 显子上游测序引物进行测序后所得的结果，在第7外显子核酸序列566碱基处 发生了566T>C，提示为CYP3A4基因多态性*17；
图3是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的CYP3A4基因第11外 显子上游测序引物进行测序后所得的结果，在第11外显子核酸序列1088碱基 处发生了1088C>T，提示为CYP3A4基因多态性*11。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实 施方式作进一步地详细描述。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 为本领域常规方法，如按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手 册(第三版)(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议 的条件。
实施例1.试剂盒的制备
1、内参基因ACTB以及CYP3A4基因的引物设计
根据基因序列ACTB基因序列和CYP3A4基因序列来源于美国国家生物技 术信息中心核酸数据库(NCBI)，其中ACTB基因ID为60，参考序列号为 NG_007992.1，也可参见本发明序列表中SEQ ID NO:35；CYP3A4基因ID为 1574，参考序列号为NG_008421.1，采用Primer5.0引物设计软件分别设计内参 基因ACTB和CYP3A4基因的特异引物，包括：CYP3A4基因第1～3外显子的 长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第4～7外显子的长片段扩增特异 性上下游引物、CYP3A4基因第8～11外显子的长片段扩增特异性上下游引物、 CYP3A4基因第12～13外显子的长片段扩增特异性上下游引物，以及CYP3A4 基因第1外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第2外显子上下游测序引物、 CYP3A4基因第3外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第4外显子上下游测序 引物、CYP3A4基因第5～6外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第7外显子上 下游测序引物、CYP3A4基因第8外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第9 外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第10外显子上下游测序引物、CYP3A4 基因第11外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第12外显子上下游测序引物和 CYP3A4基因第13外显子上下游测序引物，其中，如CYP3A4基因第1～3外显 子的长片段扩增特异性上下游引物分别用于鉴别CYP3A4基因的CYP3A4*14 型，CYP3A4基因第7外显子上下游引物用于鉴别CYP3A4*17基因多态性， CYP3A4基因第11外显子上下游引物用于鉴别CYP2D6*11等均为一一对应关 系，可以同时检测出目前报道的24种CYP3A4基因多态性，其中，24种CYP3A4 基因多态性具体详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.ki.se)。
通过上述引物设计得到：
CYP3A4基因第1～3外显子长片段扩增特异性上游引物序列： 5’-TGGACTTGGGGTGCTAATCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:1所示；
CYP3A4基因第1～3外显子长片段扩增特异性下游引物序列: 5’-TGTGTGTGTGTAAAAACCCTGAC-3’，如序列表中SEQ ID NO:2所示；
CYP3A4基因第4～7外显子长片段扩增特异性上游引物序列:5’- GGCTGTTGATGTTTAATCAACTCTG-3’，如序列表中SEQ ID NO:3所示；
CYP3A4基因第4～7外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5’- CAAATGTACTACAAATCACTGAACTG-3’，如序列表中SEQ ID NO:4所示；
CYP3A4基因第8～11外显子长片段扩增特异性上游引物序列5’- AGCAAATAATTATACAACCACATGAC-3’，如序列表中SEQ ID NO:5所示；
CYP3A4基因第8～11外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5’- GCTCCAGGTAAATTTTGCACA-3’，如序列表中SEQ ID NO:6所示；
CYP3A4基因第12～13外显子长片段扩增特异性上游引物序列:5’- GTAAGAAACCCTAACATGTAACT-3’，如序列表中SEQ ID NO:7所示；
CYP3A4基因第12～13外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5’- AGGCCAGGATGTCTCTCCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:8所示；
CYP3A4基因第1外显子上游测序引物序列:5’-GCCCTGCTACTGGCTGCA -3’，如序列表中SEQ ID NO:9所示；
CYP3A4基因第1外显子下游测序引物序列:5’- CGGCCTGAACATCTTTTTTG-3’，如序列表中SEQ ID NO:10所示；
CYP3A4基因第2外显子上游测序引物序列:5’- TCGCTGTGACTTGATTTCTGT-3’，如序列表中SEQ ID NO:11所示；
CYP3A4基因第2外显子下游测序引物序列:5’- AAAACTTCAGACCTTCCCCCT-3’，如序列表中SEQ ID NO:12所示；
CYP3A4基因第3外显子上游测序引物序列:5’- TGACAAGAGCTTCATCCCAA-3’，如序列表中SEQ ID NO:13所示；
CYP3A4基因第3外显子下游测序引物序列:5’- TCCCAATTAGAGGCAGGGTTA-3’，如序列表中SEQ ID NO:14所示；
CYP3A4基因第4外显子上游测序引物序列:5’- TTGGGCTCCAGCTGTAGAATA-3’，如序列表中SEQ ID NO:15所示；
CYP3A4基因第4外显子下游测序引物序列:5’- CCTGGACATTTTTTAGGCAAC-3’，如序列表中SEQ ID NO:16所示；
CYP3A4基因第5～6外显子上游测序引物序列:5’- AAGTGTTCCTGTTTAACACATTTTC-3’，如序列表中SEQ ID NO:17所示；
CYP3A4基因第5～6外显子下游测序引物序列:5’- TCACTGGAATAACCCAACAGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:18所示；
CYP3A4基因第7外显子上游测序引物序列:5’- GTGGATGAATTACATGGTGATTT-3’，如序列表中SEQ ID NO:19所示；
CYP3A4基因第7外显子下游测序引物序列:5’- GGAAGGATGGTAAAAAGGTGCT-3’，如序列表中SEQ ID NO:20所示；
CYP3A4基因第8外显子上游测序引物序列:5’- GCTCCAGGTAAATTTTGCACA-3’，如序列表中SEQ ID NO:21所示；
CYP3A4基因第8外显子下游测序引物序列:5’- AAAACATACAGGTAACTGCACTGA-3’，如序列表中SEQ ID NO:22所示；
CYP3A4基因第9外显子上游测序引物序列:5’- TCAGGAGCCACTTTCTGTCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:23所示；
CYP3A4基因第9外显子下游测序引物序列:5’- TATGCCTGCATGCCTCTAGAA-3’，如序列表中SEQ ID NO:24所示；
CYP3A4基因第10外显子上游测序引物序列:5’- CTCTTCATCTAAACTGTGATGCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:25所示；
CYP3A4基因第10外显子下游测序引物序列:5’- AGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGATT-3’，如序列表中SEQ ID NO:26所示；
CYP3A4基因第11外显子上游测序引物序列:5’- CTTCATTAGTACTGCATGGACTGAG-3’，如序列表中SEQ ID NO:27所示；
CYP3A4基因第11外显子下游测序引物序列:5’- AGCAAATAATTATACAACCACATGACTG-3’，如序列表中SEQ ID NO:28所示；
CYP3A4基因第12外显子上游测序引物序列:5’- TCTCAACAAGACTGAAAGCTCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:29所示；
CYP3A4基因第12外显子下游测序引物序列:5’- GGGCTTTACATGATGTTTTTGATG-3’，如序列表中SEQ ID NO:30所示；
CYP3A4基因第13外显子上游测序引物序列:5’- TCCCCTCAACACTGAAGGAGT-3’，如序列表中SEQ ID NO:31所示；
CYP3A4基因第13外显子下游测序引物序列:5’- CAATGCATGTACAGAATCCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:32所示；
内参基因ACTB扩增上游测序引物序列： 5’-CGATTTCTCGCAGCTCACCAT-3’，如序列表中SEQ ID NO:33所示；
内参基因ACTB扩增下游测序引物序列： 5’-AATACACACTCCAAGGCCGC-3’，如序列表中SEQ ID NO:34所示。
2、内部阳性控制序列及其引物的设计
该内部阳性控制序列包含CYP3A4基因部分序列和一部分人工合成序列， 如序列表中SEQ ID NO:36所示。
采用Primer5.0引物设计软件并按照上述引物设计原则设计出上述内部阳性 控制序列的上下游引物分别为：5’-GCGCGTGACACTGCTACATG-3’(如序列 表中SEQ ID NO:37所示)、5’-TCGAGTAGCTGAGACTGCGT-3’(如序列表 中SEQ ID NO:38所示)。
3、试剂盒的组成及制备
本发明试剂盒组成如下：
①基因组DNA提取试剂：该提取试剂为本领域常用试剂，本实施例采用组 织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号：69504)中的试剂。
②引物：包括上述可以分别扩增CYP3A4基因第1～3外显子、4～7外显子、 8～11外显子和12～13外显子的长片段扩增上下游引物、上述CYP3A4基因第1、 2、3、4、5～6、7、8、9、10、11、12以及13外显子测序上下游引物、上述内 部阳性控制序列扩增上下游引物和内参基因ACTB扩增上下游引物。
③上述内参基因ACTB以及内部阳性控制序列。
上述引物序列、内部阳性控制序列和内参基因ACTB序列由上海生工生物 工程技术服务有限公司合成。
④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有CYP3A4*8型的 CYP3A4基因多态性中的含389G>A突变位点的基因序列DNA样品为阳性对 照；
阳性对照的制备：采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号： 69504)快速提取已经确诊的含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多态性中的含 389G>A突变位点的基因序列的0.5ml受检者外周血基因组DNA，作为阳性对 照。
⑤各种PCR反应试剂：PCR预混合液，本实施例中选用2×PCR Premix (Qiagen公司，产品货号：210212)；Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、BSA(Albumin from bovine serum，牛血清白蛋白)、T4噬菌体的基因32编码蛋白、无RNase 去离子水。
⑥测序缓冲液，pH为8.3的Buffer缓冲液，其Buffer缓冲液的配制：1μl Bigdye和3μl 5x含10mM MgCl2的400mM Tris溶液。
实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测CYP3A4基因多态性
以随机检测30例受检者外周血标本结果为例。
用本发明的试剂盒检测人群CYP3A4基因多态性的检测流程为：首先获取 临床受检者外周血样本，快速提取基因组DNA；其次，先配制内参基因ACTB 的PCR反应液，然后加入浓度均为2ng/μl内参基因ACTB序列和内部阳性控 制序列各2μl，进行PCR扩增，PCR结束后在浓度为2％的琼脂糖DNA凝胶中 进行电泳，查看PCR扩增情况。如果内参基因ACTB的PCR扩增产物中存在 390bp和800bp左右的两个条带，提示整个检测过程有效，如图1所示，如果缺 少一条或二条带，提示检测失败，则需要重新进行检测。再次，如果通过内参 基因ACTB的PCR结果证明检测过程有效，则配制CYP3A4基因长片段扩增 PCR反应液和阴性、阳性反应液，前者中加入2μl提取的受检者外周血基因组 DNA，后者分别加入2μl去离子水和阳性样品DNA，并各加入浓度为2ng/μl内 部阳性控制序列2μl，进行PCR扩增，PCR扩增结束后在浓度为2％的琼脂糖 DNA凝胶电泳上成像，查看PCR扩增情况。受检者外周血标本CYP3A4基因 第1～3外显子、4～7外显子、8～11外显子和12～13外显子扩增片段大小分别应 为3780bp、4500bp、5210bp、4281bp左右，而且均有390bp左右条带一个，阳 性对照组为800bp和390bp左右条带各一个，阴性对照组为390bp条带1个， 如图1所示。
最后，回收纯化PCR产物以得到受检者CYP3A4第1～3外显子、4～7外显 子、8～11外显子和12～13外显子的长片段中的一个，将该DNA片段用于测序 反应的模板，配制PCR测序反应液后进行PCR测序反应，将PCR测序反应物 纯化后上测序仪进行测序。
CYP3A4基因多态性的具体检测步骤如下：
①受检者外周血基因组DNA的抽提：采用实施例1试剂盒中的基因组DNA 提取试剂按DNA抽提纯化的方法快速提取0.5ml受检者外周血基因组DNA。
②将上述提取的受检者外周血基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整 性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算DNA的纯度与浓 度，用无菌去离子水调节抽提的DNA至相同浓度，置冰箱-20℃保存。
③将实施例1试剂盒中的内部阳性控制序列标准品和内参基因ACTB标准 品分别稀释至浓度为2ng/μl。
④内参基因ACTB的PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，在该反应体系中各成分及终浓度如下：1×的PCR 预混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix，10.0μL)、Mg2+： 3mM；dNTPs：0.3mM；dUTP：0.5mM；Taq酶：0.2U/μL；BSA：1.25wt％； T4噬菌体的基因32编码蛋白：1nmol/L；内参基因ACTB上、下游引物均为： 0.25pmol/μL；内部阳性控制序列上、下游引物均为：0.25pmol/μL；内部阳性控 制序列：0.3pmol/μL；内参基因ACTB序列:0.2ng/μl；其余为无RNase去离子 水。
在ABI9700PCR仪器上进行PCR扩增，PCR反应程序为：先经过95℃3min, 然后95℃30s，57℃3.6min，72℃3min，35个循环，最后72℃10min。
PCR扩增结束后在浓度为2％的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像，从电泳图中 可以看到存在390bp和800bp左右的两个条带，提示整个检测过程有效，因此 可以进行以下操作。
⑤CYP3A4基因第1～3外显子、4～7外显子、8～11外显子和12～13外显子 长片段PCR扩增：
上述四个CYP3A4基因长片段的PCR反应体系均为20μL，在该反应体系 中各成分及终浓度如下：1×的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号：210212， 2×PCR Premix，10.0μL)；Mg2+：3mM；dNTPs：0.3mM；dUTP：0.5mM； Taq酶：0.2U/μL；BSA：1.25wt％；T4噬菌体的基因32编码蛋白：1nmol/L； CYP3A4基因第1～3外显子、第4～7外显子、第8～11外显子或第12～13外显子 长片段扩增特异性上、下游引物均为0.25pmol/μL；内部阳性控制序列上、下游 引物均为0.25pmol/μL；内部阳性控制序列：0.3pmol/μL；受检者外周血基因组 DNA的用量为2μL；其余为无RNase去离子水。
在CYP3A4基因第1～3外显子、4～7外显子、8～11外显子和12～13外显子 长片段PCR扩增的同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照和阴性对照的反应 体系均为20μL，在该反应体系中各成分及终浓度如下：1×的PCR预混合液 (Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix，10.0μL)；Mg2+：3mM； dNTPs：0.3mM；dUTP：0.5mM；Taq酶：0.2U/μL；BSA：1.25wt％；T4噬菌 体的基因32编码蛋白：1nmol/L；内参基因ACTB扩增上、下游引物均为： 0.25pmol/μL；内部阳性控制序列上、下游引物均为0.25pmol/μL；内部阳性控制 序列：0.3pmol/μL；阳性样品或者阴性样品的用量为2μL，其余为无RNase去离 子水。
在ABI9700PCR仪器上进行PCR扩增，PCR反应程序为：先经过95℃3min, 然后95℃30s，57℃3.6min，72℃3min，35个循环，最后72℃10min。
PCR扩增结束后在浓度为2％的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像。如图1所示。
⑥分别切取CYP3A4基因第1～3外显子、第4～7外显子、第8～11外显子和 第12～13外显子长片段扩增PCR产物以及内部阳性控制序列PCR产物，利用 Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。
⑦测序反应液的配制：取4μl Buffer测序缓冲液，浓度均为2ng/μl的步骤⑥ 回收纯化得到的四个长片段DNA各1μl，再相对应地取浓度均为1pmol/ml的 CYP3A4基因第1、2、3、4、5～6、7、8、9、10、11、12和13外显子上下游 测序引物各1μl。
在ABI9700仪器上先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数 为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
⑧采用醋酸钠/乙醇法纯化步骤⑦的测序反应产物，按照ABI3130测序仪的 操作说明进行测序。
⑨数据收集处理和分析：将所测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分 析，分析CYP3A4基因多态性，结果参见表1。
表1为长片段PCR测序法分析受检者外周血基因组中CYP3A4基因多态性
样品 核酸变异 氨基酸变异 基因多态性 受检者外周血1 508G>A V170I CYP3A4*9 受检者外周血2 — — CYP3A4*1 受检者外周血3 — — CYP3A4*1 受检者外周血4 — — CYP3A4*1 受检者外周血5 600A>T Q200H CYP3A4*24 受检者外周血6 — — CYP3A4*1 受检者外周血7 664T>C S222P CYP3A4*2 受检者外周血8 1247C>T P416L CYP3A4*13 受检者外周血9 — — CYP3A4*1 受检者外周血10 — — CYP3A4*1 受检者外周血11 485G>A R162Q CYP3A4*15 受检者外周血12 653C>G P218R CYP3A4*5 受检者外周血13 — — CYP3A4*1 受检者外周血14 — — CYP3A4*1 受检者外周血15 — — CYP3A4*1 受检者外周血16 1247C>T P416L CYP3A4*13 受检者外周血17 — — CYP3A4*1 受检者外周血18 352A>G I118V CYP3A4*4 受检者外周血19 — — CYP3A4*1 受检者外周血20 — — CYP3A4*1 受检者外周血21 — — CYP3A4*1
受检者外周血22 352A>G I118V CYP3A4*4 受检者外周血23 1247C>T P416L CYP3A4*13 受检者外周血24 664T>C S222P CYP3A4*2 受检者外周血25 — — CYP3A4*1 受检者外周血26 — — CYP3A4*1 受检者外周血27 — — CYP3A4*1 受检者外周血28 352A>G I118V CYP3A4*4 受检者外周血29 1088C>T T363M CYP3A4*11 受检者外周血30 — — CYP3A4*1
本发明试剂盒检测能力评价：
以直接测序法作为本发明的比较检测方法，同时对上述30例受检者外周血 标本进行检测，分析结果与表1相同，因此采用本发明本试剂盒进行检测的敏 感性、特异性及灵敏度与直接测序法一致，但检测时间明显缩短、劳动强度明 显下降，完全符合实用要求(具体参见表2)。
表2为两种不同方法检测受检者外周血中CYP3A4基因多态性的比较
由上表可知，通过长片段PCR扩增测序法检验CYP3A4基因多态性，以直 接测序法作为参照，长片段PCR扩增测序法和直接测序法同时检测到13例突变 型和17例野生型，二者检测结果一致，由此得出，长片段PCR扩增测序法的阳 性预测值为100％；长片段PCR扩增测序法和直接测序法同时检测到17例野生 型，均未检测出突变型，由此得出，长片段PCR扩增测序法的阴性预测值为 100％，同时，特异性和灵敏度均为100％，阳性预测值和阴性预测值也达到100％， 且多次重复实验结果一致，一份临床标本的检测时间约为10h，耗时短，而直接 测序法法耗时约48h。
上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的本发明试剂盒并利用长 片段PCR测序法检测CYP3A4基因多态性，其检测结果的特异性和敏感度不降 低的条件下，检测时间明显缩短及劳动强度明显降低，同时，具有检测快速以 及降低了污染等特点，而且目前尚未有长片段PCR测序法检测CYP3A4基因多 态性试剂盒的相关报道。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。