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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610573050.8 (22)申请日 2016.07.19 (71)申请人 清华大学深圳研究生院 地址 518055 广东省深圳市南山区西丽深 圳大学城清华园区 (72)发明人 刘潜马岚王晓虹 (74)专利代理机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通合伙) 11201 代理人 李志东 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N。
2、 1/21(2006.01) C12N 5/095(2010.01) G01N 33/574(2006.01) G01N 33/569(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 多肽、 核酸及其用途 (57)摘要 本发明提出了多肽、 核酸及其用途， 该多肽 具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列， 该核酸编 码所述多肽。 该多肽具有特异性识别肿瘤干细胞 的特性， 本发明实施例的多肽可用于特异性识 别、 标记、 分选肿瘤干细胞， 或用于肿瘤诊断、 治 疗或成像或用于制备靶向药物。 权利。
3、要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 106188240 A 2016.12.07 CN 106188240 A 1.一种多肽， 其特征在于， 具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。 2.一种核酸， 其特征在于， 编码权利要求1所述的多肽， 可选地， 所述核酸具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。 3.一种表达载体， 其特征在于， 包括权利要求2所述的核酸， 任选地， 所述表达载体为M13噬菌体单链DNA。 4.一种重组噬菌体， 其特征在于， 其含有权利要求2所述的核酸。 5.一种制备重组噬菌体的方法， 其特征在于， 包括： 将权利要求3所述的表达载体引入 宿主细胞中。
4、， 任选地， 所述宿主细胞是大肠杆菌细胞或其衍生细胞。 6.一种重组细胞， 其特征在于， 其含有权利要求2所述的核酸。 7.一种制备重组细胞的方法， 其特征在于， 包括： 将权利要求3所述的表达载体引入宿 主细胞中。 8.一种制备权利要求1所述多肽的方法， 其特征在于， 包括： 在适于所述蛋白表达的条件下， 培养权利要求4所述的重组噬菌体或权利要求6所述的 重组细胞， 以便获得所述多肽。 9.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的核酸在制备试剂盒中的用途， 所述试剂盒 用于特异性识别、 标记、 分选肿瘤干细胞， 或用于肿瘤诊断、 治疗或成像； 可选地， 所述肿瘤干细胞为肺癌干细胞或人乳腺癌干细。
5、胞； 可选地， 所述肿瘤为人非小细胞肺癌或人乳腺癌。 10.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的核酸在制备靶向药物中的用途， 所述药 物用于治疗癌症， 可选地， 所述癌症为人非小细胞肺癌、 人乳腺癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106188240 A 2 多肽、 核酸及其用途 技术领域 0001 本发明涉及生物领域， 具体地， 本发明涉及多肽、 核酸及其用途， 更具体地， 本发明 涉及多肽、 核酸、 表达载体、 重组噬菌体、 制备重组噬菌体的方法、 重组细胞、 制备重组细胞 的方法、 制备多肽的方法、 多肽或核酸在制备试剂盒或靶向药物中的用途。 背景技术 0002 肿瘤是机体细胞恶性。
6、增殖产生的一种病变。 少数细胞经过一系列突变后， 逃脱了 机体免疫系统监视， 获得了抗衰老和凋亡的能力， 从而产生肿瘤(Parris GE,Historical Perspective of Cell-Cell Fusion in Cancer Initiation and Progression.2013.18 (1-2):1-18； Craene BD and Berx G,Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression.Nat Rev Cancer,2013.13(2):97-110.)。。
7、 目前大量 研究表明， 在肿瘤中存在一部分支持肿瘤发生和发展的细胞， 这些细胞与正常干细胞一样， 具有自我更新和分化能力， 这部分细胞被称为肿瘤干细胞(Cancer stem cells， CSC)(Beck B and Blanpain C,Unravelling cancer stem cell potential.Nat Rev Cancer, 2013.13(10):727-738； Kreso A and Dick John E,Evolution of the Cancer Stem Cell Model.Cell Stem Cell,2014.14(3):275-291.)。 0。
8、003 肿瘤干细胞参与肿瘤发生、 发展、 转移和复发的全过程。 在联合免疫缺陷小鼠中的 研究显示， 造血干细胞能够转化成为白血病干细胞， 通过祖细胞进一步分化成为白血病肿 瘤细胞(Nobili S,Landini I,Giglioni B,et al.,Pharmacological strategies for overcoming multidrug resistance.Current Drug Targets,2006.7(7):861-879)。 而肺 部支气管上皮干细胞在其微环境的影响下能够发生一系列突变， 形成具有自我更新能力和 一定分化潜能的细胞， 从而促进了肿瘤发生(Zhou。
9、 BBS,Zhang HY,Damelin M,et al., Tumour-initiating cells:challenges and opportunities for anticancer drug discovery.Nature Reviews:Drug Discovery,2009.8(10):806-823.)。 肿瘤干细胞比普通 肿瘤细胞具有对药物和放射性治疗手段更强的耐受能力， 而这也是导致肿瘤治疗失败和复 发的主要原因。 寻找靶向和抑制肿瘤干细胞的途径， 以达到治疗肿瘤的效果， 是当前的研究 热点(Medema JP,Cancer stem cells:The chal。
10、lenges ahead.Nat Cell Biol,2013.15 (4):338-344； Omidfar K and Daneshpour M,Advances in phage display technology for drug discovery.Expert Opin Drug Discov,2015.10(6):651-69)。 0004 针对肿瘤干细胞的研究和治疗效果在很大程度上取决于特异性的肿瘤干细胞标 志物(CSC Marker)。 虽然目前已经有许多不同的肿瘤干细胞表面标志物被确定， 而采取多 种表面标志物联合鉴定肿瘤干细胞也有利于提高鉴定的可靠性， 然而， 缺乏足够。
11、特异性的 表面标志物仍是当前肿瘤干细胞研究面临的主要问题(Wang W,Chen X,Li T,et al., Screening a phage display library for a novel FGF8b-binding peptide with anti-tumor effect on prostate cancer.Exp Cell Res,2013.319(8):1156-64)。 0005 进而， 如何特异识别、 靶向和杀伤肿瘤干细胞仍有待进一步开发和研究。 说明书 1/7 页 3 CN 106188240 A 3 发明内容 0006 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中。
12、的技术问题之一。 为此， 本发明的 一个目的在于提出了一种具有特异性识别肿瘤干细胞的多肽。 0007 在本发明的第一方面， 本发明提出了一种多肽。 根据本发明的实施例， 所述多肽具 有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。 0008 NR PR Q I M Q R R H P(SEQ ID NO:1)。 0009 具有上述氨基酸序列的多肽具有特异性识别肿瘤干细胞的特性， 根据本发明的实 施例， 该多肽可用于特异性识别、 标记、 分选肿瘤干细胞， 或用于肿瘤诊断、 治疗或成像或用 于制备靶向药物。 0010 在本发明的第二方面， 本发明提出了一种核酸。 根据本发明的实施例， 所述核酸编 码前面。
13、所述的多肽。 如前所述， 所述多肽具有特异性识别肿瘤干细胞的特性， 根据本发明的 实施例， 该核酸或其编码的多肽， 可用于特异性识别、 标记、 分选肿瘤干细胞， 或用于肿瘤诊 断、 治疗或成像或用于制备靶向药物。 0011 根据本发明的实施例， 所述核酸还可进一步包括下列附加技术特征至少之一： 0012 根据本发明的实施例， 所述核酸具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。 0013 aataggcctagacaaataatgcaacggcgtcatccc(SEQ ID NO:2)。 0014 在合适启动子的调控下， 具有上述核苷酸序列的核酸分子表达前面所述的多肽， 所述多肽能够特异性识别。
14、肿瘤干细胞， 进而可进一步用于肿瘤干细胞特异性识别、 标记、 分 选或用于肿瘤诊断、 治疗或成像或用于制备靶向药物。 0015 在本发明的第三方面， 本发明提出了一种表达载体。 根据本发明的实施例， 所述表 达载体包括前面所述的核酸。 根据本发明实施例的表达载体可有效在受体细胞中表达前面 所述的多肽， 所述多肽可用于肿瘤干细胞特异性识别、 标记、 分选或可用于肿瘤诊断、 治疗 或成像或用于制备靶向药物。 0016 根据本发明的实施例， 上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之 一： 0017 根据本发明的实施例， 所述表达载体为M13噬菌体单链DNA。 前面所述核酸可有效 插入表达载。
15、体-M13噬菌体单链DNA， 并在宿主细胞中进行有效表达前面所述多肽并进行M13 噬菌体的包装。 0018 在本发明的第四方面， 本发明提出了一种重组噬菌体。 根据本发明的实施例， 所述 重组噬菌体含有前面所述的核酸。 前面所述的核酸随重组噬菌体外壳蛋白的表达而表达， 本发明的重组噬菌体可高效表达前面所述的多肽， 根据本发明的实施例， 该重组噬菌体可 用于肿瘤干细胞的特异性识别、 标记、 分选或可用于肿瘤诊断、 治疗或成像。 0019 在本发明的第五方面， 本发明提出了一种制备重组噬菌体的方法。 根据本发明的 实施例， 所述方法包括： 将前面所述表达载体引入宿主细胞中。 根据本发明的具体示例，。
16、 将 前面所述表达载体引入宿主细胞， 可实现前面所述核酸在宿主细胞中随噬菌体外壳蛋白的 表达而表达， 继而进行重组噬菌体的包装， 高效获得包含有前面所述核酸和多肽的重组噬 菌体， 所获得的重组噬菌体可用于肿瘤干细胞的特异性识别、 标记、 分选或可用于肿瘤诊 断、 治疗或成像。 说明书 2/7 页 4 CN 106188240 A 4 0020 根据本发明的实施例， 所述制备重组噬菌体的方法还可以进一步包括如下附加技 术特征至少之一： 0021 根据本发明的实施例， 所述宿主细胞是大肠杆菌细胞或其衍生细胞。 发明人经过 实验发现， 当宿主细胞是大肠杆菌细胞或其衍生细胞的条件下， 所述表达载体的表。
17、达效率 更高， 重组噬菌体的包装效率更高。 0022 在本发明的第六方面， 本发明提出了一种重组细胞。 根据本发明的实施例， 其含有 前面所述的核酸。 如前所述， 前面所述的核酸能够特异性编码前面所述的具有特异性识别 肿瘤干细胞的多肽。 利用根据本发明实施例的重组细胞可高效获的前面所述多肽， 继而利 用所述多肽可进一步有效用于肿瘤干细胞的特异性识别、 标记、 分选或制备靶向药物。 0023 在本发明的第七方面， 本发明提出了一种制备重组细胞的方法。 根据本发明的实 施例， 所述方法包括： 将前面所述表达载体引入宿主细胞中。 如前所述， 前面所述表达载体 包括前面所述的核酸， 并且能够实现前面所。
18、述核酸的高效表达。 根据本发明的具体示例， 将 前面所述表达载体引入宿主细胞， 获得的重组细胞能够高效表达前面所述的多肽。 0024 在本发明的第八方面， 本发明提出了一种制备前面所述多肽的方法。 根据本发明 的实施例， 所述方法包括： 在适于所述蛋白表达的条件下， 培养前面所述的重组噬菌体或前 面所述的重组细胞， 以便获得所述多肽。 根据本发明的具体示例， 在适于蛋白表达的条件 下， 培养前面所述的重组噬菌体或前面所述的重组细胞， 前面所述多肽可随噬菌体外壳蛋 白的表达而高效表达在外壳表面， 或在重组细胞中高效表达。 0025 在本发明的第九方面， 本发明提出了前面所述的多肽或前面所述的核酸。
19、在制备试 剂盒中的用途， 所述试剂盒用于特异性识别、 标记、 分选肿瘤干细胞， 或用于肿瘤诊断、 治疗 或成像。 前面所述多肽具有特异性识别肿瘤干细胞的特性， 利用前面所述多肽或编码前面 所述多肽的核酸所制备的试剂盒， 能够用于特异性识别、 标记、 分选肿瘤干细胞， 或用于肿 瘤诊断、 治疗或成像。 0026 根据本发明的实施例， 上述多肽或核酸在制备试剂盒中的用途还可以进一步包括 如下附件技术特征至少之一： 0027 根据本发明的实施例， 所述肿瘤干细胞为肺癌干细胞或人乳腺癌干细胞。 发明人 通过实验发现， 本发明的多肽对肺癌干细胞或人乳腺癌干细胞的具有强的特异性识别能 力， 本发明的多肽或。
20、核酸用于制备试剂盒， 该试剂盒适用于特异性识别、 标记、 分选肺癌干 细胞或人乳腺癌干细胞。 0028 根据本发明的实施例， 所述肿瘤为人非小细胞肺癌或人乳腺癌。 发明人通过实验 发现， 本发明的多肽对肺癌干细胞或人乳腺癌干细胞的具有强的特异性识别能力， 本发明 的多肽或核酸用于制备试剂盒， 该试剂盒适用于人非小细胞肺癌或人乳腺癌的早期诊断、 治疗或成像。 0029 在发明的第十方面， 本发明提出了前面所述的多肽或前面所述的核酸在制备靶向 药物中的用途， 所述药物用于治疗癌症。 本发明的前面所述多肽具有特异性识别肿瘤干细 胞的特性， 利用本发明实施例的多肽携带治疗药物， 进而获得靶向肿瘤干细胞。
21、的靶向药物。 用于治疗癌症的靶向药物具有特异性靶向肿瘤干细胞， 特异性杀伤肿瘤细胞的功能。 0030 根据本发明的实施例， 上述多肽或核酸在制备靶向药物中的用途还可以进一步包 括如下附加技术特征至少之一： 说明书 3/7 页 5 CN 106188240 A 5 0031 根据本发明的实施例， 所述癌症为人非小细胞肺癌、 人乳腺癌。 发明人通过实验发 现， 本发明的多肽具有对人非小细胞肺癌干细胞或人乳腺癌干细胞的靶向性。 所述靶向药 物具有特异性靶向人非小细胞肺癌干细胞或人乳腺癌干细胞， 特异性杀伤人非小细胞肺癌 或人乳腺癌细胞的功能。 0032 需要说明的是， 本发明的重组噬菌体为携带有外源。
22、基因的噬菌体， 本发明的重组 细胞为携带有外源基因的细胞。 附图说明 0033 图1是根据本发明实施例的筛选特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的流程 图示于图； 0034 图2是根据本发明实施例的普通肿瘤细胞及肿瘤细胞球培养形态图； 0035 图3是根据本发明实施例的碱性磷酸酶(APK)和CD44/CD133免疫荧光鉴定结果图； 0036 图4是根据本发明实施例的展示特异性肽段的量子点标记噬菌体结合肿瘤干细胞 的免疫荧光检测结果图； 以及 0037 图5是根据本发明实施例的羟基荧光素标记肿瘤干细胞特异性肽段的免疫荧光检 测结果图。 具体实施方式 0038 下面详细描述本发明的实施例。 下面描。
23、述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发 明， 而不能理解为对本发明的限制。 实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均 为可以通过市购获得的常规产品。 0039 实施例特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸序列的筛选 0040 在本实施例中， 发明人详细介绍了特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸序列的筛 选过程。 0041 为了方便理解， 发明人筛选特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的流程图示 于图1， 为了除去非特异性的多肽， 本实验采用了减数杂交筛选法， 即用自由分化的人类胚 胎干细胞作为负筛材料， 除去那。
24、些非特异性的噬菌体多肽， 然后再用未分化的胚胎干细胞 作为正筛材料， 得到能与其特异性结合的多肽。 0042 具体步骤如下所述： 0043 1、 细胞的培养和准备 0044 1)负向筛选细胞悬浮液的制备： 0045 人类非小细胞肺癌细胞系A549公众可以以合法的方式从中国科学院细胞库申请 获得， 将复苏后的人非小细胞肺癌A549细胞接种于含10胎牛血清(FBS， Thermo Fisher, 美国)、 100U/mL青霉素和链霉素(Thermo Fisher,美国)的DMEM(FBS， Thermo Fisher,美国) 培养基中， 在37、 5CO2的条件下培养。 细胞汇合率达到约80时进行。
25、传代。 在使用噬菌 体肽库筛选前， 细胞用0.25Trypsin-EDTA消化、 磷酸盐缓冲液(PBS， pH 7.4)洗涤两次， 重 悬于含3FBS的PBS封闭液中。 得到的细胞用于负向筛选。 0046 2)正向筛选细胞悬浮液的制备 说明书 4/7 页 6 CN 106188240 A 6 0047 正向筛选采用A549肿瘤干细胞， 该细胞通过无血清培养基进行悬浮培养获得， 其 制备方法如下所述： 0048 将上述培养的A549细胞， 以40,000个/孔接种到六孔板中， 采用无血清肿瘤干细胞 诱导培养基， 培养基为添加20ng/ml表皮生长因子EGF、 20ng/ml成纤维细胞生长因子bF。
26、GF、 5 g/ml胰岛素、 人类白细胞抗原B27(EGF、 bFGF、 胰岛素、 B27均来自Thermo Fisher,美国)的 DMEM/F12培养基(Thermo Fisher,美国)， 在37、 5CO2条件下培养7天(每23天换液)为 第一代诱导细胞。 细胞用0.25Trypsin-EDTA消化成单细胞并传代， 传代两次后， 用胰酶消 化成单细胞悬液后， PBS洗涤两次， 重悬于含3FBS的PBS封闭液中。 得到的细胞用于正向筛 选。 图2为普通肿瘤细胞及肿瘤细胞球培养形态， 图3为碱性磷酸酶(APK)和CD44/CD133免疫 荧光鉴定结果。 图2和图3结果表明， 通过无血清悬浮。
27、培养， 本实施例得到了具有肿瘤干细胞 特征的细胞， 可用于肿瘤干细胞特异性噬菌体多肽筛选。 0049 2、 噬菌体肽库筛选 0050 本实施例所用的噬菌体库是Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒(New England Bio- Labs， 美国)中的Ph.D.-12噬菌体展示肽库， 该试剂盒中Ph.D.-12噬菌体展示肽库使用的噬 菌体载体为M13单链噬菌体， 肽库表达的随机肽均在噬菌体次要包膜蛋白PIII的N端。 M13噬 菌体是一种丝状噬菌体， 属于温和型噬菌体， 不裂解宿主菌， 成熟的噬菌体可释放到培养基 中， 通过离心收集培养上清， 再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体颗粒沉淀下。
28、来， 从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。 0051 采用负筛/正筛的方法来进行筛选， 具体包括下述步骤： 0052 1)负筛： 1.51011的噬菌体(Ph.D.-12噬菌体肽库， New England Bio-LABS,美国) 被加入到1mL的悬浮的上述用作负向筛选的A549细胞悬浮液中， 在室温中轻微晃动1小吋， 3000rpm离心3分钟。 上清液中含有没有结合普通肿瘤细胞的噬菌体， 收集上清液。 0053 2)正筛： 将步骤1)获得的上清转入步骤1制备的肿瘤干细胞悬浮液中， 室温轻微晃 动1.5小时， 弃上清， 所获细胞与噬菌体的混合物用洗脱液1(含终质量百分浓度为3的BSA 和。
29、终质量百分浓度为0.1的Tween-20的pH7.4的PBS)洗5次。 接下来用1.6mL洗脱液2(含 0.1M glycine-HCl， 终质量百分浓度为0.1的BSA， pH 2.2的溶液)洗脱与细胞结合的噬菌 体， 然后加入0.3mL中和液(pH 9.1,1M Tris-HCl溶液)， 目标噬菌体即在液体中。 0054 3)将上述所获噬菌体于宿主细菌大肠杆菌ER2738(Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂 盒中提供)中扩增后并进行滴定计数。 通过2轮与上述步骤1)和步骤2)同样的筛选， 计算每 轮的噬菌体得率。 0055 其中， 噬菌体得率(Phage yield rate)筛选后噬菌体。
30、量/加入噬菌体量， 经过三 轮筛选后噬菌体的得率如表1所示。 0056 表1： 三轮筛选后噬菌体的得率 0057 说明书 5/7 页 7 CN 106188240 A 7 0058 0059 3、 噬菌体克隆的挑选和测序 0060 在上述三轮筛选后， 取10 L得到的噬菌体加入到200 L于LB培养基中生长至对数 生长期初期的.coli ER2738宿主菌， 37感染5分钟， 然后将该混合物加入到约50的顶 层琼脂中， 混匀后铺到LB/IPTG/X-gal平板(LB培养基， 15g/L琼脂， 灭菌后温度低于70时 加入1mL IPTG/X-gal， Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒提供)上。
31、， 于37过夜培养。 挑选单 个噬菌斑扩增后获得噬菌体单克隆。 使用PEG/NaCl溶液(含终质量百分浓度为20 polyethylene glycol-8000和2.5M NaCl的溶液)沉淀噬菌体， 用DNA抽提液(含10mMTris- HCl(pH 8.0),1mM EDTA和4M NaI的溶液)抽提噬菌体DNA， 得到的DNA用于测序。 测序表明， 其中一个噬菌体单克隆展示的肽段的序列为如SEQ ID NO： 1所示， 其编码序列如SEQ ID NO： 2所示。 0061 4、 量子点-噬菌体偶联 0062 羧基修饰水溶性量子点(浙江纳晶科技股份有限公司)发射波长为620nm， 1-(。
32、3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与透析后的噬菌体 (11010cfu)偶联。 反应在常温下在0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES， pH5.6)溶液中反应3小时后， 用甘氨酸对活化的量子点进行灭活； 随后将量子点-噬菌体在20000g下离心30min， 并用PBS 洗涤后， 保存在PBS溶液中。 0063 5、 免疫荧光检测 0064 A549肿瘤干细胞于24孔板(Falcon， 美国)中聚赖氨酸处理的盖玻片上培养4小时 后， 弃培养上清， 用PBS溶液(pH7.4)洗细胞一次。 多聚甲醛溶液(质量百分浓度为4)固定 细胞10分钟， 200 L/。
33、孔。 吸去固定液， 用PBS溶液洗细胞3次。 加入封闭液1BSA-PBS-T， 于37 下封闭2小时。 PBS-T溶液洗三次。 每孔加入200 L以封闭液(含终浓度为1的BSA和终浓 度为0.1的Tween-20的pH 7.4的PBS)为稀释液的序列1所示的肽段(上海荣熙生物工程有 限公司， 尾端添加羟基荧光素(FAM)荧光标记， 终浓度为1 mol/L)， 或上述步骤(4)量子点- 噬菌体复合物10 L(含1.01010cfu噬菌体)， 37下避光孵育60分钟。 孵育完成后， 使用 PBS-T溶液(含终浓度为0.1的Tween-20的pH7.4的PBS)洗板三次， 再用PBS溶液洗板三次。 。
34、细胞核用DAPI(Sigma， 美国)复染， 噬菌体-量子点标记肿瘤干细胞结果如图4所示， 从图4中 可见对照(未经筛选的control噬菌体)未见在普通A549细胞或A549肿瘤干细胞膜上量子点 的荧光， 包含具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽(NRP)的阳性噬菌体在普通A549细胞上也未 见荧光， 而在A549肿瘤干细胞上呈现明亮的红色荧光， 表明NRP噬菌体能与A549肿瘤干细胞 特异性结合。 图5中用FAM荧光探针标记的NRP多肽序列同样在肿瘤干细胞膜上显示为阳性 绿色的小点， 在普通肿瘤细胞中未见明显反应； 而作为对照(control)的随机多肽(序列为 KSNQRHPRPHS。
35、S)未表现出细胞结合阳性。 试验结果进步表明NRP多肽序列与肿瘤干细胞能 说明书 6/7 页 8 CN 106188240 A 8 够特异性结合。 0065 在本说明书的描述中， 参考术语 “一个实施例” 、“一些实施例” 、“示例” 、“具体示 例” 、 或 “一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结构、 材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 此外， 在不相互矛盾的情况下， 本领域。
36、的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。 0066 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例， 可以理解的是， 上述实施例是示例 性的， 不能理解为对本发明的限制， 本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、 修改、 替换和变型。 说明书 7/7 页 9 CN 106188240 A 9 0001 序列表 1/1 页 10 CN 106188240 A 10 图1 图2 说明书附图 1/3 页 11 CN 106188240 A 11 图3 图4 说明书附图 2/3 页 12 CN 106188240 A 12 图5 说明书附图 3/3 页 13 CN 106188240 A 13 。