技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种鱼源抗冻多肽酸性蛋白酶制备方法及抗冻多肽的应用。
背景技术
食品和医药产品在低温储存和运输过程中由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。世界范围内的科学家正面临严肃的挑战：如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药产品品质的关键所在。
抗冻蛋白, 也称“冰结构蛋白”，是一类附着在冰晶体表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性蛋白质。抗冻蛋白由于其具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质的特点和突出意义而成为热点研究主题。 同样的研究还表明，抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异多肽链结构域而并不是整体蛋白质在起作用，即使是纯化了的抗冻蛋白，抗冻活性往往不高，仍然需要探究其活性域来进一步提高抗冻效率。 所以,如何获得食品源的结构紧凑的高活性抗冻多肽，就成为抗冻蛋白迫切的研究方向。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鱼源抗冻多肽酸性蛋白酶制备方法，使抗冻活性得以高效地实现，制备的抗冻多肽可作为在低温环境下减少细胞损伤的保护剂。
本发明的一种鱼源抗冻多肽酸性蛋白酶制备方法如下：
以包括来自鱼皮、鱼鳞的鱼源胶原蛋白为原料，采用酸性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽。
其中，酶解条件为： pH为5.4、温度是37℃、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15（w/w）。
所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min；收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10%-90% （v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为1mL/min，收集25%乙腈和75%水（v/v）处的洗脱峰,得到抗冻多肽。
所述的抗冻多肽，是由23个氨基酸所构成的多肽，其氨基酸序列为：pmgprgppgppgtpgpqgftgpp。
酸性蛋白酶制备的鱼源抗冻多肽的应用，其特征在于：抗冻多肽可作为低温环境下减少细胞损伤的保护剂。
为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下：
(1) 明胶酶解条件的优化
本发明所采用的酶和鱼（鱼皮、鱼鳞）胶原蛋白购自Sigma生物试剂公司（中国·上海）。采用单因素实验，分别对三个酶解因素进行考察，分别为酶解温度（37℃，45℃和50℃）、酶解时间（10，20，30，40和60分钟）以及酶-底物配比（1:100,1:50,1:20,1:15和1:10 w/w）。称取1.65克鱼源胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L HCL将其pH调节至5.4。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再1000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对其抗冻活性进行测定，以确定最佳酶解条件。
得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是： pH为5.4、温度是37℃、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15-1:20（w/w）。
(2) 酶解产物的分离、纯化
先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过Sephadex G-50凝胶色谱（长100cm，直径2.6cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量。收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱（长55cm，直径2.0cm）进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90% 乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽。
(3) 抗冻活性的测试
本发明按照国际抗冻蛋白活性检测的标准，建立抗冻活性检测系统。抗冻活性采用检测抗冻多肽对低温冻融细菌的保护作用来测试。
将活化的保加利亚乳酸杆菌接种到液体培养基中37℃，130r/min培养过夜作为种子液，将种子液以1:100的比例接种到新的液体培养基中，37℃，130r/min摇床培养至OD600=1.0左右。取若干1.5mL已灭菌的离心管，加入经过滤除菌的浓度为250μg/mL待测样品900μL，将菌液稀释104倍，吸取100μL加入至待测样品中，混匀，涂布，37℃倒置培养18h，计菌落数。将剩余的样品-菌液混合液置于-20℃低温处理24h，取出融化并涂布，37℃倒置培养18h，计菌落数，每组做两个平行。然后根据公式计算保加利亚乳酸杆菌的存活率。
保加利亚乳酸杆菌存活率（%）=
（4）氨基酸序列测定
利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定特异性抗冻多肽的氨基酸全序列为：pmgprgppgppgtpgpqgftgpp。
本发明立足于抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于特异的肽链结构域而不是整体蛋白质在起作用的理论基础，以来自于鱼源胶原蛋白为原材料，着眼于通过酸性蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗冻活性得以高效地实现。
本发明为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。
附图说明
图1 纯化鱼皮胶原蛋白抗冻多肽的 CLC-HPLC-C18色谱图。
图2 纯化的特异性抗冻多肽对保加利亚乳酸杆菌的低温保护作用；其中，图中的 A、B分别表示空白保加利亚乳酸杆菌、添加0.5%（w/w）特异性抗冻多肽样品的保加利亚乳酸杆菌生长情况图。
具体实施方式
本发明的抗冻多肽是由23个氨基酸所构成的多肽。所述多肽的氨基酸全序列为：pmgprgppgppgtpgpqgftgpp。
制备方法如下：
以鱼源胶原蛋白为原料，使用酸性蛋白酶对其进行酶解，并按照国际抗冻蛋白活性检测的标准，建立抗冻活性检测系统，优化其酶解条件，得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是: pH为5.4、温度是37℃、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15（w/w）；在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过Sephadex G-50凝胶色谱（长100cm，直径2.6cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量。收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱（长55cm，直径2.0cm）进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱（长15cm，直径0.8cm）再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为梯度洗脱液，流速为1mL/min，洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集25%乙腈和75%水（v/v）处的洗脱峰,得到高纯度的特异性抗冻多肽。冷冻干燥得到本发明的抗冻多肽。是由23个氨基酸所构成的多肽。所述多肽的氨基酸全序列为：pmgprgppgppgtpgpqgftgpp。
本发明采用的仪器、检测手段如下：
本发明的制备抗冻多肽的抗冻活性检测系统,采用低温冻融细菌，检测添加抗冻多肽对细菌低温冻融后的生长保护作用。 将活化的保加利亚乳酸杆菌接种到液体培养基中37℃，130r/min摇床培养过夜作为种子液，将种子液以1:100的比例接种到新的液体培养基中，37℃，130r/min摇床培养至OD600=1.0左右。取若干1.5mL已灭菌的离心管，加入经过滤除菌的浓度为250μg/mL待测样品900μL，将菌液稀释104倍，吸取100μL加入至待测样品中，混匀，涂布，37℃在培养箱中倒置培养18h，计菌落数。将剩余的样品-菌液混合液置于-20℃低温处理24h，取出融化并涂布，在培养箱中37℃倒置培养18h，计菌落数，每组做两个平行。然后计算保加利亚乳酸杆菌的存活率。
应用Sephadex G-50分子筛、Sepharose SP C-25离子交换色谱、RP-HPLC反相高效液相色谱、透析等多种分离纯化手段，实现显著活性的特异抗冻多肽的高效分离纯化。
利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定特异性抗冻多肽的氨基酸全序列。
为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例：
实施例1
称取1.65克鱼皮胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L HCL将其pH调节至5.4。先将该溶液水浴加热到37℃，接着再按照酶-底物配比为1:15的比例加入相应量的酶，酶解时间为30分钟。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再14000rpm离心10分钟，收集上清液备用。
将上清液用Sephadex G-50凝胶色谱（长100cm，直径2.6cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量，收集具有最好抗冻活性的洗脱峰。
对Sephadex G-50凝胶色谱分离的具有最好抗冻活性的洗脱峰再进行下一步的分离，用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱（长55cm，直径2.0cm）进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min。收集各峰样品并测定抗冻活性，获得最好的抗冻活性的样品利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离纯化。 洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集25%乙腈和75%水（v/v）处的洗脱峰,得到高纯度的特异性抗冻多肽，冷冻干燥得到本发明的抗冻多肽。如图1所示，SP2峰为该特异性抗冻多肽的色谱峰。
纯化的特异性抗冻多肽具有很强的细菌低温保护的能力，可作为低温环境下减少细胞损伤的保护剂。由图2可以看出，与空白对照（图2A）相比，添加了0.5%(w/w)的特异性抗冻多肽，（图2B）。计算保加利亚乳酸杆菌的存活率为92.4％。
对纯化的特异性抗冻多肽利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定特异性抗冻多肽的氨基酸序列。多肽的氨基酸全序列为：pmgprgppgppgtpgpqgftgpp。