技术领域
本发明涉及一种以正常分娩后获取的健康人胎盘为原料，制备保持天然结构的人胎盘I型、III型、IV型和V型胶原材料的方法，属于生物医用材料的制备领域。
背景技术
天然胶原作为一种特异性的结构蛋白质，其特点和优势已被广泛认识，并进一步成为生物医用材料的重要原料之一。目前在人体中已知至少26种胶原类型，每一种都为胶原的结构作用增加了特定的功能。哺乳动物胎盘，特别是人胎盘中的胶原含量十分丰富，同时含有I型、III型、IV型和V型胶原，因此是一种十分有价值的制备天然医用胶原的原材料。
使用人胎盘为原料制备的各型天然医用胶原，不携带任何已知的人传染性疾病，克服了使用牛、猪等异种动物组织或器官为原料制备胶原可能存在的病毒污染或潜在的人畜共患疾病的风险，因此人胎盘胶原具有更高的安全性。
关于以人胎盘为原料制备具有天然结构的人胎盘I型、III型、IV型和V型胶原的专利和报道相对较少。国内在二十世纪九十年代初进行过短期少量的人胎盘胶原的研究，主要代表成果有：刘秉慈以人胎盘为原料，经胃蛋白酶消化、盐析后获得沉淀A，并进一步酸性盐提取离心后获得沉淀B，将两种沉淀以不同比例混合并加入生长激素和利多卡因后用于填充小型凹陷性皮肤缺损（中国发明专利，公开号：CN1081379）
到目前为止，尚无文献资料以人胎盘为原料制备具有天然结构的人I型、III型、IV型和V型胶原材料的报道。因此，以健康人胎盘组织为主要原料在较短的周期内制备具有稳定性能的天然结构人I型、III型、IV型和V型医用胶原材料，是具有明显意义的。
发明内容
通过对现有技术的综合分析发现现有技术中存在以下不足：
1.人胎盘中含有I型、III型、IV型和V型胶原，但现有技术最多能提取三种类型的胶原，不能同时获得四种类型的胶原材料，对人胎盘组织资源利用不够充分；
2.现有的胶原提取技术周期冗长，需要15天以上，步骤繁琐，从而使提取效率和产率较为低下，工艺中影响产品质量的关键环节难以控制，容易造成产品质量不够稳定，最终影响胶原及胶原基生物医学材料的应用效果和价值。
本发明的目的在于提供一种人胎盘胶原的制备方法，明显缩短提取胶原的周期，得到高质量的人胎盘胶原。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种人胎盘胶原的制备方法，以人胎盘组织为原料，依次进行预处理、酶消化、分级盐析，分别获得保持天然结构的人I型、III型、IV型和V型医用胶原材料中的至少一种。
通过所述预处理步骤对胎盘组织进行清洗、破碎并去除主要杂质；
在所述酶消化步骤中，采用胃蛋白酶在胶原纤维中的端肽与螺旋区之间的特定位点打断肽链，使胶原溶于消化液中从而与其他组织成分相分离。
再通过所述分级盐析，对不同类型的胶原进行分离、提纯，以获得特定类型的胶原。
作为一种可选方式，所述的人胎盘组织是预产妇在分娩前已进行可传播疾病筛选并正常分娩后获取的新鲜的或经低温冷冻保存的胎盘组织，因此没有已知污染胎盘组织的病毒性病原体，从而使所得胶原具有良好的生物安全性，有利于其在组织工程支架、细胞培养载体、病理研究及药品开发等领域等顺利应用。所述胎盘组织可以选自胎盘的任意部分，如羊膜、绒毛膜或完整的胎盘。
作为一种可选方式，所述的预处理步骤具体包括：将胎盘组织充分清洗并切成小块，低温匀浆后离心去除上清液，沉淀用去离子水清洗后再离心，反复清洗离心2-4次至上清液透明；沉淀用pH为7.2-7.4、含有1.0-20.0 mmol/L金属络合剂、0.5-3.0mol/L中性盐的浓度为0.01-1.0mol/L的预处理缓冲液浸泡并缓慢搅拌2-4h，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；离心后所得沉淀再用预处理缓冲液清洗一次并进行离心，取沉淀备用。通过该步骤能够比较彻底的去掉杂质，获得胶原含量较高的混合物，且耗时短，效率高。
所述金属络合剂可以为氨基羧酸盐（如乙二胺四乙酸盐、二乙烯三胺五羧酸盐等）和羟基羧酸盐（如酒石酸钠、葡萄糖酸钠）中的至少一种。采用所述金属络合剂能更好的消除原料中含有的各种金属杂质，同时也去除各种其它活性生物分子。
所述预处理缓冲液可以为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种。采用所述缓冲液一方面维持体系pH值的稳定，同时还能起到清理杂蛋白的作用，其中三羟甲基氨基甲烷-盐酸清理杂蛋白的效果最佳。
作为一种可选方式，所述的酶消化是将预处理后的人胎盘组织浸泡于消化液中，所述消化液为胃蛋白酶（活力≥250U/mg）与醋酸（也可采取其他弱酸，如柠檬酸）的混合溶液，其pH 为2.2-2.8，胃蛋白酶浓度为0.5-5g/L，醋酸（HAC）浓度为0.2-0.8mol/L；所述消化液质量为人胎盘组织固体重量的5-10倍，低温条件下连续缓慢搅拌，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；酶消化6-30h后，离心分离取上清液备用。采用上述酶消化方法，消化程度适中，所得产物质量稳定，且相对于现有的人胎盘胶原提取工艺，大大缩短了消化时间，提高了效率。
作为一种可选方式，所述分级盐析操作为根据所需提取的胶原类型，从下述分级盐析步骤中选取相应的步骤组合：
1）用醋酸调节经酶消化后的样品至pH 为2.5-2.8，按照0.5-1.2mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，所得沉淀标记为CD-A，上清液标记为QY-A；
2）将所述沉淀CD-A用0.5mol/L醋酸溶解后，按照0.3-0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，所得沉淀标记为CD-B，上清液标记为QY-B；
3）向所述清液QY-B中，按照2.0-4.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-C；
4）将所述沉淀CD-C溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.2-7.5，按照1.2-2.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-D；
5）将所述沉淀CD-D溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.3-0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-E；
6）将所述沉淀CD-E溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液，按照1.2-2.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.2-7.5，静置2-10h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.3-0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘I型胶原材料；
7）将所述CD-B溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.2-7.5，按照0.9-2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-F；
8）将所述沉淀CD-F溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.3-0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-G；
9）将所述沉淀CD-G溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.9-2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.2-7.5，静置2-10h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.3-0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘III型胶原材料；
10）向所述QY-A中，按照0.9-2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-H；
11）将所述沉淀CD-H溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.2-7.5，按照1.8-4.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-I；
12）将所述沉淀CD-I溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.6-1.9mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-J；
13）将所述述沉淀CD-J溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后，按照1.8-4.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.2-7.5，静置2-10h后进行离心，再将沉淀溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.6-1.9mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的中性盐颗粒，待中性盐完全溶解后静置2-10h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.05mol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl，pH为7.2-7.5的缓冲液并对同一缓冲液充分透析后进行离心分离，所得沉淀标记为CD-K，上清液标记为QY-C；
14）将所述清液QY-C转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘IV型胶原材料；
15）将所述述沉淀CD-K，溶于0.2-0.5mol/L 醋酸溶液后，转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘V型胶原材料。
该工艺操作灵活，可根据所需提取胶原的类型，选择对应的操作步骤，例如：仅需提取I型胶原时，则按所述步骤1）至步骤6）依次操作；仅需提取III型胶原时，则选择所述步骤1）、步骤2）以及步骤7）至步骤9）依次操作；仅需提取IV型胶原时，则选择所述步骤1）、步骤10）至步骤14）依次操作；仅需提取V型胶原时，则选择所述步骤1）、步骤10）至步骤13）以及步骤15）依次操作；如要提取多种胶原类型则将相应的步骤组合即可，按步骤1）至步骤15）操作，可从胎盘组织中同期分离出四种类型的胶原（I型、III型、IV型和V型）。
采用本发明所述方法制备的人胎盘I型、III型、IV型或V型胶原中包含原纤维状胶原、微纤维状胶原、颗粒状纤维、胶原纤维和胶原纤维束中的至少一种。所得的胶原最大程度地保留了天然胶原原有的三股螺旋结构。
本发明中所述中性盐为氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠和磷酸铵中的至少一种。
本发明还提供了一种从人胎盘组织中提取的胶原，所述胶原采用本发明所述方法制备而成，所得的胶原为保持天然结构的人I型、III型、IV型或V型医用胶原材料中的一种。所述胶原中包含原纤维状胶原、微纤维状胶原、颗粒状纤维、胶原纤维和胶原纤维束中的至少一种，最大程度地保留了天然胶原原有的三股螺旋结构。所述胶原纯度高，生物安全性高，经简单消毒处理即可用于组织工程支架、细胞培养载体、病理研究及药品开发等生物医药领域，例如作为细胞培养载体和表面改性材料；作为组织工程支架材料的主要原料；或进一步复合其它材料，应用于生物医学材料其它领域。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1、本发明所述胎盘胶原制备方法大幅度缩短了人胎盘I型、III型、IV型和V型胶原材料的制备周期，提高了制备效率和产率，同时使产品的质量也更加稳定。
2、采用本发明所述方法可以根据实际需要提前特定类型的胶原，还可以同期获得具有天然结构的人I型、III型、IV型和V型胶原材料，充分利用人胎盘组织资源。
附图说明
图1为本发明的制备工艺流程图；
图2为本发明所述实施例中制备的各型胶原的示差扫描量热仪（DSC）检测结果图，图中1为I型、3为III型、4为IV型、5为V型胶原。
具体实施方式
本发明的制备工艺流程为：以人胎盘组织为原料，依次进行预处理、酶消化、分级盐析。
其中预处理步骤包括将胎盘组织充分清洗并切成小块，低温匀浆后离心去除上清液，沉淀用去离子水反复清洗离心至上清液透明；沉淀用含有金属络合剂和中性盐的预处理缓冲液浸泡并缓慢搅拌后离心，所得沉淀再用预处理缓冲液清洗一次并进行离心，取沉淀备用；酶消化步骤包括将预处理后的人胎盘组织浸泡于消化液中，低温条件下连续缓慢搅拌，酶消化6-30h后，离心分离取上清液备用；所述分级盐析是利用不用类型的胶原在不同浓度的中性盐溶液中的溶解度的不同，经过使胶原混合物在不同浓度的盐溶液中反复地溶解和沉淀对不同类型的胶原进行分离、提纯，以获得特定类型的胶原。
以下所列为本发明的几个最佳实施例，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例 1
按以下步骤提取胶原：
（1）选用新鲜的经过疾病筛选并正常分娩获得的完整人胎盘；
（2）将胎盘组织充分清洗并切成小块，低温匀浆后离心去除上清液，沉淀用去离子水清洗后再离心，反复清洗离心4次至上清液透明；沉淀用pH为7.2-7.4、含有10 mmol/L乙二胺四乙酸钠（Na2EDTA）、1.0 mol/L NaCl的0.5mol/L 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液浸泡并缓慢搅拌4h，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；搅拌完成后进行离心，离心后所得沉淀再用Tris-HCl缓冲液清洗一次并进行离心，最后离心得到的沉淀称重并作为后续计量的依据；
（3）将步骤（2）中最终获得的沉淀浸泡于消化液中，所述消化液为pH 2.8，胃蛋白酶（活力≥250U/mg）浓度为5g/L的0.5mol/L 的醋酸（HAC）溶液，所述消化液质量为沉淀重量的5倍，低温条件下连续缓慢搅拌，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；酶消化12h后，离心分离取上清液备用。
（4）按照以下步骤实行分级盐析操作：
1）用醋酸调节经酶消化后的样品至pH 为2.8，按照0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，所得沉淀标记为CD-A，上清液标记为QY-A；
2）将所述沉淀CD-A用0.5mol/L醋酸溶解后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，所得沉淀标记为CD-B，上清液标记为QY-B；
3）向所述清液QY-B中，按照4.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置8h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-C；
4）将所述沉淀CD-C溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，按照2.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-D；
5）将所述沉淀CD-D溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-E；
6）将所述沉淀CD-E溶于0.2mol/L 醋酸溶液，按照2.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，静置4h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液后转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘I型胶原材料；
7）将所述CD-B溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，按照2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-F；
8）将所述沉淀CD-F溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-G；
9）将所述沉淀CD-G溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液后转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘III型胶原材料；
10）向所述QY-A中，按照2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-H；
11）将所述沉淀CD-H溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，按照4.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-I；
12）将所述沉淀CD-I溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照1.2mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-J；
13）将所述述沉淀CD-J溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照4.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，静置4h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照1.2mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.05mol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl，pH为7.2-7.5的缓冲液并对同一缓冲液充分透析后进行离心分离，所得沉淀标记为CD-K，上清液标记为QY-C；
14）将所述清液QY-C转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘IV型胶原材料；
15）将所述述沉淀CD-K，溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘V型胶原材料。
采用上述技术制备具有天然结构的人I型、III型、IV型和V型胶原材料，周期缩短至5-10天，提高了制备的效率且产率较高。获得的上述医用胶原材料可用作生物医学材料的原料进一步加工成其他形式的胶原基生物医学材料，同时也可以采用离子交换色谱等色谱方法进一步纯化，获得更高纯度和分子量分布更加集中的各型医用胶原材料。鉴于不同类型胶原各自独特的特点和性能，获得分型的医用胶原材料可以发挥各自的生物学特点和优势，满足不同的生物医学材料研究和临床应用的需求，进一步提高胶原材料的附加值。
实施例 2
按以下步骤提取胶原：
（1）选用新鲜的经过疾病筛选并正常分娩获得的完整人胎盘；
（2）将胎盘组织充分清洗并切成小块，低温匀浆后离心去除上清液，沉淀用去离子水清洗后再离心，反复清洗离心4次至上清液透明；沉淀用pH为7.2、含有20 mmol/L乙二胺四乙酸钠（Na2EDTA）、2.0 mol/L NaCl的0.05mol/L 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液浸泡并缓慢搅拌4h，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；搅拌完成后进行离心，离心后所得沉淀再用Tris-HCl缓冲液清洗一次并进行离心，最后离心得到的沉淀称重并作为后续计量的依据；
（3）将步骤（2）中最终获得的沉淀浸泡于消化液中，所述消化液为pH 2.5，胃蛋白酶（活力≥250U/mg）浓度为1g/L的0.8mol/L 的醋酸（HAC）溶液，所述消化液质量为沉淀重量的10倍，低温条件下连续缓慢搅拌，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；酶消化24h后，离心分离取上清液备用。
（4）按照以下步骤实行分级盐析操作：
1）用醋酸调节经酶消化后的样品至pH 为2.5，按照0.6mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，所得沉淀标记为CD-A，上清液标记为QY-A；
2）将所述沉淀CD-A用0.5mol/L醋酸溶解后，按照0.4mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，所得沉淀标记为CD-B，上清液标记为QY-B；
3）向所述清液QY-B中，按照2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-C；
4）将所述沉淀CD-C溶于0.5mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，按照1.2mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-D；
5）将所述沉淀CD-D溶于0.2mol/L醋酸溶液后，按照0.3mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-E；
6）将所述沉淀CD-E溶于0.5mol/L 醋酸溶液，按照1.2mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.3mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液后转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘I型胶原材料；
7）将所述CD-B溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，按照0.9mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-F；
8）将所述沉淀CD-F溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.35mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-G；
9）将所述沉淀CD-G溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照0.9mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.3mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液后转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘III型胶原材料；
10）向所述QY-A中，按照0.9mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-H；
11）将所述沉淀CD-H溶于0.5mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，按照2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-I；
12）将所述沉淀CD-I溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.6mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-J；
13）将所述述沉淀CD-J溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照2.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照0.6mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.05mol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl，pH为7.2-7.5的缓冲液并对同一缓冲液充分透析后进行离心分离，所得沉淀标记为CD-K，上清液标记为QY-C；
14）将所述清液QY-C转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘IV型胶原材料；
15）将所述述沉淀CD-K，溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘V型胶原材料。
实施例 3
按以下步骤提取胶原：
（1）选用冷冻保存的经过疾病筛选并正常分娩获得的部分人胎盘组织；
（2）将胎盘组织充分清洗并切成小块，低温匀浆后离心去除上清液，沉淀用去离子水清洗后再离心，反复清洗离心3次至上清液透明；沉淀用pH为7.2、含有5 mmol/L葡萄糖酸钠、1.0 mol/L NaCl的0.2mol/L 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浸泡并缓慢搅拌2h，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；搅拌完成后进行离心，离心后所得沉淀再用磷酸盐缓冲液清洗一次并进行离心，最后离心得到的沉淀称重并作为后续计量的依据；
（3）将步骤（2）中最终获得的沉淀浸泡于消化液中，所述消化液为pH 2.2，胃蛋白酶（活力≥250U/mg）浓度为2g/L的0.8mol/L 的醋酸（HAC）溶液，所述消化液质量为沉淀重量的8倍，低温条件下连续缓慢搅拌，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；酶消化30h后，离心分离取上清液备用。
（4）按照以下步骤实行分级盐析操作：
1）用醋酸调节经酶消化后的样品至pH 为2.5，按照0.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，所得沉淀标记为CD-A，上清液标记为QY-A；
2）将所述沉淀CD-A用0.5mol/L醋酸溶解后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，所得沉淀标记为CD-B，上清液标记为QY-B；
3）向所述清液QY-B中，按照4.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置8h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-C；
4）将所述沉淀CD-C溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.4，按照2.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-D；
5）将所述沉淀CD-D溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.7mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-E；
6）将所述沉淀CD-E溶于0.2mol/L 醋酸溶液，按照2.5mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.2，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液后，按照0.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的NaCl颗粒，待NaCl完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液后转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘I型胶原材料；
7）将所述CD-B溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.2，按照1.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-F；
8）将所述沉淀CD-F溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.4mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-G；
9）将所述沉淀CD-G溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照1.0mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.4mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的(NH4)2SO4颗粒，待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液后转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘III型胶原材料；
10）向所述QY-A中，按照0.9mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的磷酸铵颗粒，待磷酸铵完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-H；
11）将所述沉淀CD-H溶于0.2mol/L 醋酸溶液后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，按照1.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的磷酸铵颗粒，待磷酸铵完全溶解后静置4h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-I；
12）将所述沉淀CD-I溶于0.5mol/L 醋酸溶液后，按照0.6mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的磷酸铵颗粒，待磷酸铵完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，所得沉淀标记为CD-J；
13）将所述述沉淀CD-J溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照1.8mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的磷酸铵颗粒，待磷酸铵完全溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.5，静置2h后进行离心，再将沉淀溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，按照0.6mol/L的终浓度边搅拌边加入研细的磷酸铵颗粒，待磷酸铵完全溶解后静置2h再进行离心，弃上清液，将所得沉淀溶于0.05mol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl，pH为7.5的缓冲液并对同一缓冲液充分透析后进行离心分离，所得沉淀标记为CD-K，上清液标记为QY-C；
14）将所述清液QY-C转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘IV型胶原材料；
15）将所述述沉淀CD-K，溶于0.2mol/L 醋酸溶液后，转入透析带对去离子水充分透析，所得产物经冷冻干燥后即为人胎盘V型胶原材料。
采用示差扫描量热仪（DSC）对上述各实施例中所得的各型胶原进行检测，结果如图2所示，从图中可以看出所得的I型、III型、IV型和V型胶原材料的DSC曲线的出峰位置与对应胶原的标准曲线基本吻合，说明通过本发明所述方法成功制备了I型、III型、IV型和V型这四种类型的胶原材料。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。