猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103966313 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966313 A (21)申请号 201410102234.7 (22)申请日 2014.03.19 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (71)申请人 新乡学院 地址 453003 河南省新乡市红旗区金穗大道 东段 (72)发明人 王选年 岳锋 朱艳平 孙国鹏 张艳芳 李鹏 张万方 杨媛 王爱国 李博文 王军 李鹏 (74)专利代理机构 郑州市华翔专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 41122 代理人 张爱军 (54) 发明名称 猪外周血单核淋巴细胞。

2、 PD-L1 重组质粒的构 建、 基因丰度实时检测方法及其应用 (57) 摘要 本发明属于分子病理学与免疫学技术领域， 涉及猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 重组质粒的构 建、 基因丰度实时检测方法及其应用。 通过采集猪 外周血单核淋巴细胞的总RNA， 将总RNA反转录成 cDNA ； 采用普通 PCR 扩增 PD-L1 目的基因片段， 经 琼脂糖凝胶电泳检测， 并回收纯化 ； 将 PD-L1 目的 基因片段与 pMD18-T 载体连接， 转化至感受态细 胞 DH5 中， 提取重组质粒 ； 经克隆筛选后进行测 序分析， 选取与目的基因片段相同序列的阳性质 粒作为标准品质粒， 按拷贝浓度绘制成标。

3、准曲线 ； 根据荧光信号变化及标准曲线测出 PD-L1 的基因 丰度。本发明的猪 PD-L1 基因丰度实时检测方法 具有检测通量高、 敏感性高、 特异性强、 操作简便、 成本低及定量准确等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103966313 A CN 103966313 A 1/2 页 2 1. 猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 实时荧光定量 PCR 阳性标准重组质粒的构建方法， 其 特征在于 ：。

4、 该方法包括以下步骤 ： 采集仔猪的外周血， 分离出外周血单核淋巴细胞， 提取外周血单核淋巴细胞的总 RNA， 将总 RNA 反转录成 cDNA， 将 cDNA 保存于 -20， 采用普通 PCR 方法扩增 PD-L1 目的基因片 段 ； 采用普通 PCR 方法扩增 PD-L1 目的基因片段， 将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检 测， 并回收纯化 ； 然后将PD-L1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接， 转化至感受态细胞 DH5 中， 提取重组质粒， 经克隆筛选后进行测序分析， 得到与目的基因片段相同序列的阳 性标准重组质粒 ； 其中普通PCR扩增时的反应体系为25L， 反应体系如下 。

5、： 2L样品cDNA模板， 2.5L 10PCR Buffer， 2L dNTP， 浓度均为 20mol/L 的正向引物和反向引物各 0.5L， 0.5L 的 TaqDNA 聚合酶， 其余为无菌三蒸水 ； 普通 PCR 反应程序 ： 95热启动 1min ； 94变性 30s ； 55退火 30s ； 72延伸 30s， 30 个循环， 最后 72延伸 10min ； 其中， 正向引物 F 为 ： 5 - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3， 反向引物 R 为 ： 5 - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3。 2. 根据权利要求 1 所述的构建方法， 其特征在于 ： 。

6、所述目的基因片段为 SEQ ID No.1。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的构建方法， 其特征在于 ： 所述普通 PCR 扩增时的反应程 序 ： 95热启动 1min ； 94变性 30s ； 55退火 30s ； 72延伸 30s， 30 个循环， 最后 72延 伸 10min。 4. 一种猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 基因的丰度实时检测方法， 其特征在于 ： 该方法 包括以下步骤 ： （1） 将回收纯化的PD- L1目的基因片段与pMD 18-T载体连接， 然后转化至感受态细胞 DH5 中， 提取重组质粒 ； 经克隆筛选后进行测序分析， 选取与 PD- L1 目的基因片段相同序。

7、 列的阳性质粒作为标准品质粒， 测定标准品质粒的 DNA 浓度， 并换算成质粒的拷贝浓度， 按 1:10 倍的浓度梯度稀释阳性质粒 ； （2） 以稀释的阳性质粒为模板， 进行实时荧光定量 PCR 扩增反应， 用实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号， 反应结束后绘制出标准曲线， 然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出 样品 DNA 中 PD-L1 的基因丰度 ； 其中实时荧光定量 PCR 扩增的反应体系为 20L， 包括 2L 质粒模板， 浓度为 20mol/ L 的正向引物 F 和反向引物 R 各 0.2L， SYBR Green I PreMix 10L， 三蒸水 7.6 L ； 其中， 正向。

8、引物 F 为 ： 5 - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3， 反向引物 R 为 ： 5 - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3。 5. 根据权利要求 4 所述的丰度实时检测方法， 其特征在于 ： 所述目的基因片段为 SEQ ID No.1。 6. 根据权利要求 4 所述的丰度实时检测方法， 其特征在于 ： 所述荧光定量 PCR 扩增的 反应程序为 ： 95热启动 30s ； 94变性5s ； 60退火和延伸34s， 60时收集荧光信号， 再 40 个循环。 7. 根据权利要求 4-6 任一项所述的丰度实时检测方法， 其特征在于 ： 所述稀释的 阳性质粒浓度范围为浓度。

9、范围为 9.661010-9.66101copies/L ； 所述标准曲线为 权 利 要 求 书 CN 103966313 A 2 2/2 页 3 Y=-3.266X 22.794。 8.权利要求4-7任一项所述的检测方法在分析猪感染病毒性疾病后PD-L1基因的转录 水平变化规律中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103966313 A 3 1/7 页 4 猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 重组质粒的构建、 基因丰度 实时检测方法及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子病理学与免疫学技术领域， 具体涉及猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 重组质粒的构建、 基因丰度实时检测方法及其应用。 背。

10、景技术 0002 猪瘟 （Classical swine fever， CSF）是由猪瘟病毒 （Classical swine fever virus， CSFV） 引起的一种急性、 热性、 高度接触性传染病。 研究表明， CSFV主要感染单核-巨 噬细胞系统， 引起严重的淋巴细胞减少、 血小板凝集和凝血机能障碍， 以及胸腺、 骨髓等中 枢免疫器官的萎缩。 CSFV还能通过引起机体抗病毒反应降低、 抑制感染细胞的凋亡、 促进未 感染细胞的凋亡等途径造成机体免疫功能损伤。 0003 程序性死亡配体 （PD-L1） 及其程序性死亡受体 -1(PD-1) 是 CD28/B7 超家族成员， 广泛表达于。

11、各种组织。PD-1/PD-L 共刺激信号视机体的炎症程度、 免疫状态和遗传背景不 同而激活或抑制， 主要参与 T 细胞的中枢及外周免疫耐受。与其他 CD28 超家族成员相比， PD-1/PD-L 信号通路发挥着更广泛和复杂的免疫调节作用， 与自身免疫病、 肿瘤、 慢性感染 及炎症密切相关。在免疫调节方面， PD-L1 与其受体 PD-1 共同介导 PD-1:PD-L 信号通路的 激活， 在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号， 对抗原特异性 T、 B 细 胞的功能、 T 细胞的增殖、 细胞因子的分泌和杀伤能力都有抑制作用， 阻断该通路后可以恢 复 T 细胞的大部分功能。经相关研究。

12、证实， 一些病毒的感染可以诱导 PD-L1 及其受体 PD-1 的表达， 从而影响 PD-1:PD-Ls 通路， 使病毒逃避免疫系统的监视与杀伤， 引起机体产生免 疫抑制和持续性感染。因此， PD-L1 及其受体 PD-1 近年来逐渐成为人们在慢性持续性病毒 感染、 免疫耐受性疾病、 肿瘤等免疫抑制性疾病研究中所关注的热点， 而在动物免疫抑制性 疾病或病毒持续性感染方面， T 细胞免疫抑制通路 PD-1:PD-Ls 的研究才刚刚起步， 特别是 在猪病毒性疾病方面的研究还少见报道。 0004 近年来， 实时荧光定量 PCR（Real-Time PCR） 技术为基因丰度检测提供了全新的 方法， 和。

13、传统的方法相比， 具有敏感性高、 特异性强、 操作简便、 成本低以及定量准确被广泛 应用， 它可以通过检测目标序列 PCR 扩增的荧光信号强度达到实时监控的目的。然而对猪 外周血单核细胞中PD-L1基因的丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见 报道。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题在于 ： 本发明提供了一种猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 实时荧光定量 PCR 阳性标准重组质粒的构建方法 ； 在此基础上本发明建立了一种 PD-L1 基因丰度的实时荧光定量 PCR 检测方法， 该方法 具有敏感性高、 特异性强等优点 ； 本发明通过研究外周血单核细胞中 PD-L。

14、1 的变化规律， 为猪 PD-L1 分子检测的定量分 说 明 书 CN 103966313 A 4 2/7 页 5 析提供了技术平台， 并能用于分析猪感染病毒性疾病如 CSF 后 PD-L1 基因的转录水平的变 化规律中。 0006 本发明的技术方案 ： 猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 实时荧光定量 PCR 阳性标准重组质粒的构建方法， 包括 以下步骤 ： 采集仔猪的外周血， 分离出外周血单核淋巴细胞， 提取外周血单核淋巴细胞的总 RNA， 将总 RNA 反转录成 cDNA， 将 cDNA 保存于 -20， 采用普通 PCR 方法扩增 PD-L1 目的基因片 段 ； 采用普通 PCR 方法扩。

15、增 PD-L1 目的基因片段， 将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检 测， 并回收纯化 ； 然后将PD-L1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接， 转化至感受态细胞 DH5 中， 提取重组质粒， 经克隆筛选后进行测序分析， 得到与目的基因片段相同序列的阳 性标准重组质粒 ； 其中普通PCR扩增时的反应体系为25L， 反应体系如下 ： 2L样品cDNA模板， 2.5L 10PCR Buffer， 2L dNTP， 浓度均为 20mol/L 的正向引物和反向引物各 0.5L， 0.5L 的 TaqDNA 聚合酶， 其余为无菌三蒸水 ； 普通 PCR 反应程序 ： 95热启动 1min ； 94。

16、变性 30s ； 55退火 30s ； 72延伸 30s， 30 个循环， 最后 72延伸 10min ； 其中， 正向引物 F 为 ： 5 - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3， 反向引物 R 为 ： 5 - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3。 0007 所述目的基因片段为SEQ ID No.1 ； 所述普通PCR扩增时的反应程序 ： 95热启动 1min ； 94变性 30s ； 55退火 30s ； 72延伸 30s， 30 个循环， 最后 72延伸 10min。 0008 一种猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 基因的丰度实时检测方法， 包括以下步骤 ： （。

17、1） 将回收纯化的PD- L1目的基因片段与pMD 18-T载体连接， 然后转化至感受态细胞 DH5 中， 提取重组质粒 ； 经克隆筛选后进行测序分析， 选取与 PD- L1 目的基因片段相同序 列的阳性质粒作为标准品质粒， 测定标准品质粒的 DNA 浓度， 并换算成质粒的拷贝浓度， 按 1:10 倍的浓度梯度稀释阳性质粒 ； （2） 以稀释的阳性质粒为模板， 进行实时荧光定量 PCR 扩增反应， 用实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号， 反应结束后绘制出标准曲线， 然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出 样品 DNA 中 PD-L1 的基因丰度 ； 其中实时荧光定量 PCR 扩增的反应体系为 。

18、20L， 包括 2L 质粒模板， 浓度为 20mol/ L 的正向引物 F 和反向引物 R 各 0.2L， SYBR Green I PreMix 10L， 三蒸水 7.6 L ； 其中， 正向引物 F 为 ： 5 - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3， 反向引物 R 为 ： 5 - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3。 0009 所述目的基因片段为 SEQ ID No.1。 0010 所述荧光定量 PCR 扩增的反应程序为 ： 95热启动 30s ； 94变性 5s ； 60退火 和延伸 34s， 60时收集荧光信号， 再 40 个循环。 0011 所述稀释的阳性。

19、质粒浓度范围为浓度范围为 9.661010-9.66101copies/L ； 所述标准曲线为 Y=-3.266X 22.794。 0012 所述的检测方法在分析猪感染病毒性疾病后 PD-L1 基因的转录水平变化规律中 的应用。 说 明 书 CN 103966313 A 5 3/7 页 6 0013 本发明的积极有益效果 ： 本发明通过合成正向引物、 反向引物和 PD-L1 目的基因片段， 建立了猪外周血单核细 胞中 PD-L1 基因丰度的实时荧光定量 PCR 的方法， 为更好的对猪病毒性疾病中 PD-L1 的转 录水平进行准确定量， 进而研究外周血单核细胞中PD-L1的变化规律， 为猪PD-。

20、L1分子检测 的定量分析提供了技术平台， 并为 PD-L1 在猪病毒性疾病中发挥的生物学功能及其应用机 制奠定基础。 0014 本发明的技术方案与传统技术相比， 敏感性较高， 利用所建立的方法对 109 101 copies/L 的 9 组不同浓度标准阳性质粒进行检测， 结果显示 ： 本发明中 PD-L1 的检测下 限为 10 copies/L， 其浓度与 Ct值之间有较好的线性关系， 相关系数 R2=0.998 ； 利用建立 的方法进行重复性试验， 组内和组间重复性试验结果表明， 变异系数均在 3% 以内， 具有较 好的重复性 ； 从溶解曲线图可知， PD-L1 分子溶解曲线出现单一狭窄峰 。

21、（图 4） ， 且琼脂糖凝 胶电泳分析表明， Real-time RT-PCR 扩增结果为单一特异性目的片段 （图 5） ， 说明本发明 具有较好的特异性 ； 另外本技术方案还具有检测通量高、 操作简便、 成本低以及定量准确等 特点。 0015 本发明通过实验证实， 猪感染 CSFV 后， 随着病毒在机体内复制 PD-L1 的表达量逐 渐升高， 说明 CSFV 的感染及病毒载量与猪 PD-L1 基因丰度的变化关系十分密切 ； 并证实了 猪感染 CSFV 后 PD-L1 表达变化与 IL-2 和 IL-10 细胞因子的表达变化之间存在一定关系， 猪PD-L1表达升高后激活了PD-L1 ： PD-。

22、Ls信号通路， 引起了猪T细胞免疫功能下降， 导致感 染猪免疫功能降低。 0016 本发明的猪 PD-L1 基因实时荧光定量 PCR 检测方法， 为检测猪病毒性疾病如 CSF （猪瘟） 所导致的免疫功能损伤中 PD-L1 的表达变化规律提供了技术平台， 从而进一步丰富 了猪瘟引起免疫功能损伤的机理。 附图说明 0017 图 1 为琼脂糖凝胶检测猪 PD-L1 基因扩增结果 ； 图 2 为猪 PD-L1 实时荧光定量分析扩增曲线 ； 图 3 为猪 PD-L1 实时荧光定量分析标准曲线 ； 图 4 为猪 PD-L1 实时荧光定量分析标准品溶解曲线 ； 图 5 为猪 PD- L1 实时荧光定量产物特。

23、异性分析结果 ； 图 6 为猪感染 CSFV 不同时期外周血单核细胞中 PD-L1 基因的拷贝数 ； 图 7 为猪感染 CSFV 不同时期血浆中 CSFV 病毒载量检测结果 ； 图 8 为猪感染 CSFV 不同时期 IL-2 基因的拷贝数 ； 图 9 为猪感染 CSFV 不同时期 IL-10 基因的拷贝数。 具体实施方式 0018 在本发明中， 基因拷贝数、 基因丰度代表同样的概念 ； Real-time PCR、 实时荧光定 量 PCR 表示同样的概念 ； ddH2O 表示双蒸水 ； CSF 表示猪瘟 ； CSFV 表示猪瘟病毒， 羧基荧光素 二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 （carboxyfluor。

24、escein succinimidyl amino ester， CFSE） 为一种 可以标记活体细胞的荧光染料。 说 明 书 CN 103966313 A 6 4/7 页 7 0019 实施例中的实验动物和菌种 ： 30 日龄健康仔猪， 隔离器中饲养 ； 石门株 CSFV 由中 国兽医药品检查所提供， 半数感染量为 105TCID50； 大肠杆菌感受态细胞 DH5， 为本实验 室保存。 0020 主要试剂和仪器 ： 淋巴细胞分离液， 购自天津灏阳生物制品科技有限公司 ； PCR 产 物纯化回收试剂盒， 购自上海生工生物工程技术服务有限公司 ； Taq DNA 聚合酶、 反转录试 剂盒、 pM。

25、D 18-T 载体， 均购自大连宝生物工程有限公司 ； SYBR Green I， 购自 Invitrogen 公 司。 0021 实施例 1 猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 阳性标准重组质粒的构建 采集 45 日龄仔猪的外周血， 参照淋巴细胞分离液的说明书分离外周血的淋巴细胞， 参 照 Invitrogen 公司 TRIzol 试剂盒说明书和相关文献进行总 RNA 的提取。提取的总 RNA 参 照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA， 保存于-20备用， 用于扩增PD-L1目的基因片段的 模板。 0022 采用普通 PCR 方法扩增 PD-L1 目的基因片段， 将该目的基因片段经琼脂糖凝。

26、胶电 泳检测， 并回收纯化 ； 然后将PD-L1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接， 转化至感受态 细胞 DH5 中， 提取重组质粒， 经克隆筛选后进行测序分析， 得到与目的基因片段相同序列 的阳性标准重组质粒 ； 所述目的基因片段为序列 SEQ ID No.1 ： AATGGCGAGGAAGACCTGAATGTTCAGCACAGTAGCTACAGCCAGAGGGCCCAGCTGTTGAAGGACCAGCTCT TCTTGGGAAAGGCCTCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAAGATGCAGGGGTTTACTGCTG。 0023 用以构建 PD-L1 实时荧光定量。

27、 PCR 阳性标准重组质粒的普通 PCR 反应体系 ： 普通 PCR 反应体系为 25L， 反应体系如下 ： 2L 样品 DNA 模板， 阴性对照以无菌三蒸 水为模板， 2.5L 10PCR Buffer， 2L dNTP， 正、 反向引物各 0.5L （20mol/L） ， 0.5L TaqDNA 聚合酶 （大连宝生物工程公司） ， 其余体积以无菌三蒸水补足 ； 将反应体系轻柔混 合， 于普通 PCR 仪进行扩增反应。 0024 普通 PCR 程序为 ： 95热启动 1min ； 94变性 30s ； 55退火 30s ； 72延伸 30s， 30 个循环， 最后 72延伸 10min。 0。

28、025 其中猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 引物由某生物公司合成， 引物序列如下 ： 正向引物 F 为 ： 5 - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3， 反向引物 R 为 ： 5 - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3。 0026 将普通 PCR 产物进行 2% 琼脂糖电泳分析， 电压 100V， 35min 后在紫外灯下观察产 物， 结果显示扩增出单一条带， 片段大小在 137bp 左右。 0027 扩增结果见附图1， 图中M为DL2000分子量标准， 1为PD-L1基因的扩增产物， 扩增 条带较清晰， 无引物二聚体影响。扩增序列经克隆、 测序后， 在 Gen。

29、Bank 中进行核酸同源性 的比对， 结果显示， 获得的序列SEQ ID No.1与GenBank中猪PD-L1基因 （NM_001025221.1） 的序列同源性为100%， 说明引物及扩增产物都正确， 可用于下一步实验研究。 将特异性片段 进行琼脂糖凝胶回收后， 进行克隆转化， 将获得的阳性克隆交由上海生工生物工程技术服 务有限公司进行测序分析。 0028 实施例 2 ： 猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 体系的建立 （1） 质粒 DNA 模板的制备 说 明 书 CN 103966313 A 7 5/7 页 8 采用普通 PCR 扩增方法扩增 PD-L1 目的基因片段， 将目的基因片段。

30、经 2% 琼脂糖凝胶电 泳检测并回收纯化， 与pMD 18-T载体 （TaKaRa， 大连） 连接后转化至感受态细胞DH5中， 提 取重组质粒 ； 经克隆筛选后进行测序分析， 测序结果显示与 GenBank 中猪 PD-L1 基因的序 列 100% 同源， 说明所获得序列正确， 阳性质粒可用于质粒标准品的制作。使用微量核酸蛋 白分光光度仪测定该标准品质粒 DNA 浓度为 300g/mL， 将初始标准品质粒溶液进行 1:10 倍的倍比稀释。 0029 （2） 标准质粒浓度计算和 PD-L1 标准曲线的制作 提取经过测序验证的阳性克隆质粒， 将质粒的 DNA 浓度换算成拷贝数。质粒拷贝数的 计算方。

31、法为 ： 拷贝数 (copies/L)= 浓度 (g/L)6.021023(copies/L) MW（g/ mol） 。 0030 其中 MW=（克隆载体长度 + 目的片段长度） （bp） ） 660 g/mol/ bp。 0031 已知 ： cDNA=300 g/mL， 质粒PMD18-T序列长度为2692bp， PD-L1基因插入片段长 度为 137bp ； 单个碱基的平均摩尔质量为 660 g/mol， 计算公式为 ： 分子量 （MW） =（2692+137） 660=1.87106 g/mol。 0032 质粒拷贝浓度 ： 6.021023（30010-9） （1.87106） =9.。

32、661010 copies/ L。 0033 将上述已知拷贝浓度的质粒溶液作为标准质粒， 在进行 Real-time PCR 标准曲线 绘制时按 10 倍梯度稀释 （浓度范围为 9.661010-9.66101copies/L） 。 0034 将已知拷贝数的质粒进行 1:10 倍梯度稀释， 获得质粒标准品。 0035 以稀释好的质粒为模板， 进行实时荧光定量 PCR 扩增反应， 反应采用 Real-time PCR 试剂盒 SYBR PremixExTaqTM（Invitrogen 公司） ， 反应体系为 20L ： 2L 标准质粒 模板， F、 R 引物 （20mol/L） 各 0.2L， 。

33、SYBR Green I PreMix 10L， 三蒸水 7.6 L。每次 Real-time PCR 反应中均设置阴性对照 （模板为 2LddH2O） ， Real-time PCR 程序为 ： 95 热启动 30s ； 94 变性 5s ； 60 退火和延伸 34s， 60时收集荧光信号， 40个循环。 其中 的 F、 R 引物与实施例 1 相同。 0036 标准曲线及所有待测样品均设置 3 个平行反应。反应在 ABI 7500 定量 PCR 仪 （美 国 Life Technologies） 中进行， 利用 ABI 7500 软件检测和收集荧光信号， 并进行数据分 析。 0037 ABI。

34、 7500 软件实时荧光定量分析软件自行绘制出反应的扩增曲线 （见附图 2） 。扩 增曲线显示从左至右 6 条曲线依次代表标准品 107、 106、 105、 104、 103、 102的梯度稀释液的扩 增曲线， 6个质粒标准品扩增曲线较光滑， 呈现典型的S型， 且各循环阈值 （Ct值） 间隔均匀。 0038 根据扩增曲线提供的标准品各浓度梯度及反应的循环阈值 （Ct 值） ， ABI 7500 软件自行绘制出反应的标准曲线 （见附图 3） 。该标准曲线的相关系数 R2=0.998， 斜率 为 -3.266， 标准曲线为 Y=-3.266X 22.794， 其中 Y 为实时荧光定量 PCR 反。

35、应的 Ct 值， X 为 PD-L1基因构建的标准质粒拷贝数对数值。 计算其扩增效率Eff%=102.392%， 符合ABI 7500 荧光定量分析对标准曲线的要求。 0039 测定各浓度稀释梯度的标准品在实时荧光定量 PCR 过程中的溶解温度， 并绘 制溶解曲线 （见附图 4） 。标准品及样品的溶解曲线型峰单一， 且标准品溶解温度相同 （83.50.5） ， 表明扩增反应产物溶解温度均一， 特异性好， 且无引物二聚体。 说 明 书 CN 103966313 A 8 6/7 页 9 0040 根据荧光信号的变化及标准曲线即可测出样品 DNA 中 PD-L1 的基因丰度。 0041 实施例 3 。

36、： 猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 体系的敏感性、 特异性及重复性分析 采用实施例 1 所构建的猪 PD-L1 重组质粒作为阳性重组标准质粒 ； 采用实施例 2 所建 立的猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 检测体系 ； 实时荧光定量 PCR 仪采用 Life Technologies 公司 （美国） 生产的 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪进行。 0042 用 10 倍系列稀释的 101 109 copies/L 猪 PD-L1 阳性重组标准质粒做敏感性 试验， 结果表明， PD-L1 的检测下限为 10 copies/L。 0043 对猪 PD-L1 分子 Real-time。

37、 -PCR 溶解曲线 （见附图 4） 及产物琼脂糖凝胶电泳做 特异性分析， 结果表明， 溶解曲线出现单一狭窄峰， 能够扩增到与预期目的片段同样大小的 特异性片段， 没有生成非特异性产物和引物二聚体 （见附图 5） 。 0044 用建立的方法分别进行批内和批间重复性检测， 结果显示， 批内和批间的变异系 数小于 3%， 重复性良好 （见表 1） 。 0045 表 1 猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 方法批内与批间重复性评价结果 实施例 4 ： 利用本发明建立的实时荧光定量 PCR 方法， 分析猪在病毒性疾病感染后外周 血单核淋巴细胞中 PD-L1 基因丰度的变化规律。 0046 采用实施例。

38、 2 建立的猪 PD-L1 实时荧光定量 PCR 体系 ； 实时荧光定量 PCR 仪采用 Life Technologies 公司 （美国） 生产的 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪。 0047 将 15 头 30 日龄的健康仔猪饲养至 45 日龄， 用 IDEXX 猪瘟病毒抗体检测试剂盒检 测， 确定 CSFV 抗体为阴性， 随机分为对照组 （5 头） 和实验组 （10 头） 。实验组和对照组隔离 饲养， 其中实验组通过颈部肌肉注射 CSFV 稀释液 0.1 mL/ 头 ； 对照组用灭菌 PBS 作相同处 理。 0048 分别于 CSFV 感染 45 日龄仔猪后的第 0、 3、 7、 。

39、10、 14 和 21 天采外周静脉血， 并以未 感染 CSFV 的同日龄仔猪为对照， 同时分离感染组与对照组外周血单核淋巴细胞， 并提取总 RNA， 利用反转录试剂盒 （大连宝生物） 反转录合成 cDNA， 利用实施例 1 提供的特异性引物， 采用实施例 2 建立的实时荧光定量 PCR 体系进行检测， 根据标准曲线计算即可获得感染组 和对照组外周血单核淋巴细胞中 PD-L1 基因拷贝数 （即基因丰度） ， 见附图 6。 0049 结果显示， 与未感染 CSFV 健康仔猪相比， 在 CSFV 感染后的不同时期， 因为机体 的免疫状态不同， 各期 PD-L1 基因的丰度不同， 在感染后第 310。

40、 天与对照组相比显著 （P 0.05） 升高， 其中第 3 天升高显著 （P 0.05） ； 第 7 天持续升高， 与对照组相比极显著 （P 0.01） ， 第 10 天开始下降， 但与对照组相比仍显著 （P 0.05） ， 之后继续降低， 且没有统 说 明 书 CN 103966313 A 9 7/7 页 10 计学意义。由此可见， 猪 PD-L1 基因的丰度和猪瘟病程具有较大的关联。 0050 实施例 5 ： 猪瘟病毒 （CSFV） 感染猪后 PD-L1 表达变化与血浆中病毒载量之间的关 系 CSFV 载量实时荧光定量 PCR 引物及探针由某生物公司合成， 引物及探针序列如下 ： 正向引物。

41、 F ： 5 -CCCTGAAGTGGATTAGAA-3 ， 反向引物 R ： 5 -TACCCTTGTTGATCCTATC-3 , TaqMan probe: 5 -(FAM) TTCACCGACTGTCCATTGTGG (Eclipse)-3 分别于 CSFV 感染 45 日龄仔猪后的第 0、 3、 7、 10、 14 和 21 天采取外周血， 提取外周血中 CSFV 的总 RNA， 利用反转录试剂盒 （大连宝生物） 反转录合成 cDNA。反转录反应体系为 ： 2 L 5PrimeScript Buffer, 0.5 L PrimeScript RT Enzyme Mix I, 0.5 L。

42、 Oligo dT 引物, 0.5 L Random 6 mers, 1 g 总RNA 和 RNase Free dH2O。 反转录反应条件 为 ： 37反应 15 分钟， 85 5 秒， 合成 cDNA 置于 -20保存备用。实时荧光定量 PCR 检测 CSFV 的载量， 试剂为 premix Ex Taq (probe qPCR)（大连宝生物） ， 在 ABI 7500 仪器进行， 实时荧光定量 PCR 反应体系为 20L 体系 ： 10 L Premix Ex Taq, 0.4 L CSFV 正向引 物 (10 mol/L), 0.4 L 反向引物 (10 mol/L), 0.8 L T。

43、aqMan 探针 (10 mol/ L), 0.4 L ROX Preference Dye, 2 L 模板DNA 和 6 L 三蒸水。 反应体系为 ： 95 热启动 10 秒， 45 个循环 ： 95变性 15 秒， 56退火和延伸 45 秒。根据标准曲线计算血浆 中 CSFV 的载量。 0051 结果表明， 在 CSFV 感染后第 3 天病毒载量开始升高， 第 7 天达到峰值， 之后逐渐降 低 （见附图 7） 。 0052 结合实施例 4 结果可以看出， 随着病毒在机体内的复制， PD-L1 的表达量逐渐升 高， 说明 CSFV 的感染及病毒载量与猪 PD-L1 基因丰度的变化关系十分密切。

44、。 0053 实施例 6 ： 猪 CSFV 感染后 PD-L1 表达变化与 IL-2、 IL-10 细胞因子表达变化之间 的关系 采用实施例2建立的猪PD-L1实时荧光定量PCR体系， 采用实施例4的CSFV感染45日 龄仔猪后第0、 3、 7、 10、 14和21天的外周血， 以其外周血单核淋巴细胞的总RNA反转录cDNA 的产物为模板， 对 CSFV 感染后第第 0、 3、 7、 10、 14 和 21 天的猪细胞因子 IL-2、 IL-10 的表达 变化进行检测。 0054 实时荧光定量 PCR 仪采用 Life Technologies 公司 （美国） 生产的 ABI 7500 荧光 。

45、定量 PCR 仪进行。 0055 结果表明， IL-2 mRNA 表达水平在 CSFV 感染第 7 天表达水平降低 （P0.05） ， 当 PD-L1 表达增高时 （第 7 天） ， IL-10 表达水平升高且变化极显著 （P0.01） ， 见附图 8。 0056 CSFV感染后， PD-L1表达量升高， 激活PD-L1 ： PD-Ls信号通路， 导致IL-2表达的降 低 （第 7 天） ， 见附图9。于此同时， IL-10的表达量升高 （第7天） ， 说明在CSFV感染后， IL-10 的表达影响了 PD-L1 的表达。而 IL-10 是一种免疫抑制性细胞因子， 所以 CSFV 感染后， 猪。

46、 PD-L1 表达的升高， 激活了 PD-1 ： PD-Ls 信号通路， 以及 IL-2 的降低和 IL-10 的升高， 使机 体处在免疫抑制的状态。 说 明 书 CN 103966313 A 10 1/2 页 11 SEQUENCE LISTING 新乡学院 猪外周血单核淋巴细胞 PD-L1 重组质粒的构建、 基因丰度实时检测方法及其 应用 分子病理学与免疫学研究 6 PatentIn version 3.4 1 137 DNA 人工序列 1 aatggcgagg aagacctgaa tgttcagcac agtagctaca gccagagggc ccagctgttg 60 aaggac。

47、cagc tcttcttggg aaaggcctca cttcagatca cagatgtgaa attgcaagat 120 gcaggggttt actgctg 137 2 20 DNA 人工序列 2 aatggcgagg aagacctgaa 20 3 21 DNA 序 列 表 CN 103966313 A 11 2/2 页 12 人工序列 3 cagcagtaaa cccctgcatc t 21 4 18 DNA 人工序列 4 ccctgaagtg gattagaa 18 5 19 DNA 人工序列 5 tacccttgtt gatcctatc 19 6 21 DNA 人工序列 6 ttcaccgact gtccattgtg g 21 序 列 表 CN 103966313 A 12 1/4 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103966313 A 13 2/4 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103966313 A 14 3/4 页 15 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103966313 A 15 4/4 页 16 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103966313 A 16 。