《迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310443283.2 (22)申请日 2013.09.26 C12N 1/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 中国水产科学研究院黄海水产研 究所 地址 266071 山东省青岛市市南区南京路 106 号 (72)发明人 张正 王印庚 于永翔 廖梅杰 荣小军 史秀清 李彬 王岚 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 李素红 US 2013195802 A1,2013.08.01, CN 102947441 A,2013.02.27, 王磊。
2、 . 嗜酸乳杆菌高密度培养及冻干保护 剂的研究 .中国优秀硕士学位论文全文数据 库 .2012, 沈中艳 . 猪源益生乳酸菌的筛选及发酵 工艺研究 .中国优秀硕士学位论文全文数据 库 .2008, 谢起顺 . 菌种冻干法的改良 .广东卫生防 疫 .1993, (54) 发明名称 迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其 冻干方法 (57) 摘要 一种迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂 及其冻干方法， 属于海洋细菌冷冻真空干燥保存 技术领域。成份为 ： 脱脂乳粉， 乳糖， 海藻糖， 维 生素 C， NaCl 和无菌水。在无菌条件下将迟钝爱 德华氏菌的活菌悬液与上述冻干保护剂溶液按体 积比 1:4 。
3、1:1 的比例充分混合均匀后， 分装， 在 -80条件下快速冷冻 5 6 小时， 再在真空度 0.28mbar、 冻干舱温度 -54的条件下冻干 18 小 时后， 将真空度降至 0.034mbar， 温度 -54继续 冻干2小时。 冻干完成后向冻干舱内充入99.99 的干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封。 本发明建立了迟钝爱德华氏菌冷冻真空干燥长期 保存的技术方法， 为深入开展迟钝爱德华氏菌的 相关研究提供了技术支撑。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘铮 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 103。
4、468573 B (45)授权公告日 2015.03.25 CN 103468573 B 1/1 页 2 1.一种对迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保藏的冻干方法， 其特征在于它的方法步骤 是 ： 用无菌的 1.5 NaCl 溶液将待冻干的迟钝爱德华氏菌纯培养菌落配制成 107 109cfu/mL的活菌悬液， 并在无菌条件下将活菌悬液与保护剂溶液按体积比1:41:1的比 例充分混合均匀后， 分装至安培瓶中并置于 -80条件下快速冷冻 5 6 小时， 再放入预冷 的真空冷冻干燥机冻干舱中， 设置真空度 0.28mbar、 冻干舱温度 -54的条件下冻干 18 小 时后， 将真空度降至0.034mba。
5、r， 维持冻干舱温度-54继续冻干2小时， 待冻干完成后向冻 干舱内充入 99.99的高纯度干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封 ； 所述的保护剂溶液的组成成份为 ： 脱脂乳粉， 乳糖， 海藻糖， 维生素 C、 NaCl 和无菌蒸馏 水， 所述的各种成份的终浓度为 ： 脱脂乳粉 50 150g/L， 乳糖 50 100g/L， 海藻糖 100g/ L， 维生素 C5 20g/L， NaCl15g/L， 溶剂为无菌蒸馏水。 权 利 要 求 书 CN 103468573 B 2 1/4 页 3 迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法 技术领域 0001 本发明属于海洋细菌冷冻真空干燥保存。
6、技术领域， 具体地涉及一种适用于迟钝爱 德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂及其冻干方法。 背景技术 0002 迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)， 又名迟缓爱德华氏菌， 在世界范围内 广泛分布于海、 淡水环境中， 是水生生物的重要致病菌， 可引起鱼类、 两栖类等多种水产经 济动物的疾病， 对养殖生产构成严重的威胁 （郑大海等 2004） 。因此， 有关迟钝爱德华氏 菌的研究逐渐成为水产养殖病原学研究领域的一个热点， 国内外学者对迟钝爱德华氏菌 的分类、 致病机理、 抗原特性和疫苗等方面都进行了较为深入的研究 （Matt J.Griffin,et al.2013,Jong Ear。
7、n Yu,et al.2013,Meng Zhang,et al.2012,Seung Hyuk Choi,et al.2011） 。 0003 近十年来， 随着我国海水鱼类养殖产业的快速发展， 由迟钝爱德华氏菌引起的疾 病在不同的海水鱼类养殖品种中都有发现。中国水产科学研究院黄海水产研究所从患 “脾 肾结节症” 的大菱鲆脾脏和肾脏中分离到了一株优势细菌， 经过深入细致的病原学和病理 学研究， 证实大菱鲆 “脾肾结节症” 的致病原是迟钝爱德华氏菌 （水产学报， 2007 年第 31 卷 第 4 期） ， 并深入进行了迟钝爱德华氏菌和其他常见海水鱼类病原菌的多重 PCR 检测技术和 荧光定量 P。
8、CR 检测技术研究 （刘智超， 中国海洋大学硕士毕业论文， 2012 年） 。同时， 针对包 括迟钝爱德华氏菌在内的多种大菱鲆常见病原筛选了一种多效中草药复方 （国家发明专利 ZL201010100782.8） 。这些研究主要集中于迟钝爱德华氏菌感染养殖大菱鲆发病的流行病 学、 病原学、 病理学和防治技术等方面， 并未涉及到迟钝爱德华氏菌的长期保存技术研究。 0004 因为迟钝爱德华氏菌是鱼类较为常见且致病力较强的病原菌， 已被公认为水生经 济动物细菌性疾病病原学研究的模式物种之一。 在深入研究了该菌的病原学特性和致病机 理等方面后， 国内外很多学者研究认为研制开发相应的疫苗是预防迟钝爱德华氏。
9、菌病最有 效的措施之一， 而如何长期保藏具有生物学活性的迟钝爱德华氏菌或其疫苗成为其中的关 键技术环节。 真空冷冻干燥技术是目前长期保藏微生物菌株并保存其活性最有效的技术方 法， 非常适宜用于迟钝爱德华氏菌活菌株或疫苗的长久保存。 然而， 由于迟钝爱德华氏菌自 身的生物学特性、 生境条件、 营养需求、 人工培养方法等有其特异性， 很难借鉴其他微生物 菌株的保存方法， 因此寻找合适的真空冷冻干燥保护剂和冻干方法是实现迟钝爱德华氏菌 冻干长久保存必须解决的技术难题。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于冷冻真空干燥保存迟钝爱德华氏菌 菌株的冻干保护剂和具体的冻干方法， 能够实。
10、现迟钝爱德华氏菌在常温下的长期保藏和保 存活力， 为深入开展迟钝爱德华氏菌的相关研究提供技术支撑。 0006 本发明采用如下技术方案予以实现 ： 说 明 书 CN 103468573 B 3 2/4 页 4 0007 一种迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂， 它的组成成份为 ： 脱脂乳粉、 乳糖、 海藻糖、 维生素 C、 NaCl 和无菌蒸馏水。 0008 进一步， 所述的迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂， 它的组成成份及其终浓 度为 ： 脱脂乳粉 50 150g/L， 乳糖 50 100g/L， 海藻糖 100g/L， 维生素 C 5 20g/L， NaCl 15g/L， 溶剂为无菌蒸馏水。
11、。 0009 一种所述的保护剂的配制方法为 ： 将脱脂乳粉、 乳糖和海藻糖溶于无菌 NaCl 溶液 中， 在106条件下湿热灭菌30min， 自然冷却后配制成溶液A ； 将维生素C溶于无菌NaCl溶 液中， 并经 0.22m 混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液 B ； 将配置好的溶液 A 和溶液 B 在无 菌条件下混合， 并振荡均匀后配制成冻干保护剂溶液， 其各成份的终浓度为脱脂乳粉 50 150g/L、 乳糖 50 150g/L、 海藻糖 100g/L、 维生素 C 5 20g/L、 NaCl 15g/L。 0010 本发明还提供一种迟钝爱德华氏菌的冻干方法。 0011 本发明是按如下技术方案实。
12、现的 ： 0012 一种迟钝爱德华氏菌冷冻真空干燥保藏的冻干方法， 具体步骤是将经纯化培养的 迟钝爱德华氏菌用无菌的 1.5 NaCl 溶液配制成 107 10 9cfu/mL 的活菌悬液， 并将活菌 悬液与上述冻干保护剂溶液按体积比 1:4 1:1 的比例充分混合均匀后， 分装至安培瓶中 并置于 -80条件下快速冷冻 5 6 小时， 再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中， 在真空 度 0.28mbar、 冻干舱温度 -54的条件下冻干 18 小时后， 将真空度降至 0.034mbar， 并维持 冻干舱温度-54的条件下继续冻干2小时， 待冻干完成后向冻干舱内充入99.99的高纯 度干燥二氧化碳。
13、气体至标准大气压并压盖密封。 密封完毕的安培瓶内即装有冻干的迟钝爱 德华氏菌菌粉， 能够置于常温下长期保存。 0013 本发明与现有技术对比的有益效果 ： 0014 1. 优化了冻干保护剂的配方， 并在其中添加了一定的盐分， 使其更加适用于迟钝 爱德华氏菌的冻干保藏。 0015 2. 改良了冷冻真空干燥的冻干程序， 将冻干程序设置为不同真空度的两个阶段， 使冻干更为彻底， 保存效果更好。 0016 3. 冻干完毕后向冻干舱中充入了高纯度二氧化碳气体并直接压盖密封， 由于二氧 化碳气体密度较大， 有效隔绝了冻干菌株与空气的直接接触， 在惰性气体的保护下使冻干 菌株的保存期更长。 具体实施方式 0。
14、017 下面通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明 ： 0018 实施例 1 0019 从山东省威海市某大菱鲆养殖厂采集到患 “脾肾结节症” 的大菱鲆病鱼数条， 将其 打包充氧带回中国水产科学研究院黄海水产研究所实验室进行病原分离。 无菌操作分别剪 取少许病鱼的脾脏和肾脏组织， 将其放入无菌培养皿中用灭菌的 1.5的 NaCl 溶液轻轻滴 洗数次后， 将组织剪碎。 用接种环挑取少量剪碎的组织， 在胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基上 进行划线分离细菌。将划线完毕的培养基置于 28恒温培养箱培养 48h， 从形态一致的优 势菌落中选取单个菌落， 再次转接至一个新的胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基上进行划线培。
15、 养。重复以上步骤 2 3 次， 直至获得病原菌的纯培养菌落。将获得的纯培养物制成高浓 说 明 书 CN 103468573 B 4 3/4 页 5 度的活菌悬液， 并腹腔注射健康大菱鲆以验证其致病性。对验证后的病原菌进行常规生理 生化表型实验和 16S rDNA 序列比对分析， 鉴定为迟钝爱德华氏菌 （Edwardsiella tarda） 。 0020 挑取纯培养的迟钝爱德华氏菌单菌落接于胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中， 置于 生化培养箱中在 28、 150rpm 条件下培养 20h 后， 于 4000r/min 离心 8min 弃上清， 收集菌 体沉淀， 然后加入菌体体积 15 倍左右的浓。
16、度为 1.5% 的无菌 NaCl 溶液充分振荡均匀后， 再 次于 4000r/min 离心 8min， 弃上清， 收集菌体沉淀， 重复同样步骤两次后， 用浓度为 1.5% 的 无菌 NaCl 溶液将收集的菌体重悬配制成 107 10 9cfu/mL 的菌悬液备用。 0021 先分别将 5g 脱脂乳粉、 5g 乳糖和 10g 海藻糖溶于 90mL 浓度为 1.5% 的 NaCl 溶液 中， 在 106条件下湿热灭菌 30min， 自然冷却后配制成溶液 A。将 0.5g 维生素 C 溶于 10mL 浓度为 1.5% 的无菌 NaCl 溶液中， 并经 0.22m 混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液 B。。
17、将 配置好的溶液 A 和溶液 B 在无菌条件下混合， 并振荡均匀后配制成 100mL 的冻干保护剂溶 液， 其各成份的终浓度为脱脂乳粉 50g/L、 乳糖 50g/L、 海藻糖 100g/L、 维生素 C 5g/L、 NaCl 15g/L。 0022 在无菌条件下， 将已配置好的菌悬液和保护剂溶液按体积比 1 ： 1 的比例混合并振 荡均匀后， 分装至数个 2mL 的无菌安培瓶中， 每个安培瓶中装有 1.5mL 的混合液， 将安培瓶 盖上胶塞后在 -80超低温冰箱中冷冻 5h。然后将已结冰的混合溶液迅速放入预冷的真空 冷冻干燥机冻干舱中， 在真空度0.28mbar、 冻干舱温度为-54的条件下。
18、冻干18小时， 之后 将真空度降低为 0.034mbar， 维持冻干舱温度 -54继续冻干 2 小时。冻干程序完成后， 向 冻干舱内缓慢充入 99.99的高纯度干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封即完成迟 钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保存。冻干并密封后的安培瓶置于常温下保存。 0023 在冻干完成后的当天， 第 7 天和第 90 天， 分别随机挑选 5 个安培瓶， 在无菌条件下 打开密封并加入1.5mL的灭菌蒸馏水进行复水， 待冻干粉末完全溶解后用浓度为1.5%的无 菌 NaCl 溶液进行梯度稀释， 并用胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板培养基涂布进行活菌计数， 以 测定冻干菌株的存活率。每个梯度进行 。
19、2 次平行实验， 取其平均值， 结果见表 1。 0024 本次实验结果证明， 通过本方法获得的迟钝爱德华氏菌冻干菌粉常温保存 1 天、 7 天和 90 天后的平均存活率均高于 19%， 取得了较佳的冻干保存效果。 0025 表 1 迟钝爱德华氏菌冻干菌粉复水后的存活率 0026 0027 实施例 2 0028 2012 年， 中国水产科学研究院黄海水产研究所获中国海洋大学交流赠送迟钝爱德 华氏菌一株， 该菌为中国海洋大学实验室从患病的养殖牙鲆内脏中用 Luria-Bertani 琼脂 培养基 （LB培养基） 通过划线培养法分离得到， 可以引起牙鲆的 “腹水病” ， 造成严重的死亡。 0029 。
20、在实验室中， 用胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基对这株菌进行转接培养， 通过划线 培养法获得这株迟钝爱德华氏菌的纯培养物。 挑取纯培养的单菌落接种于胰蛋白胨大豆肉 说 明 书 CN 103468573 B 5 4/4 页 6 汤液体培养基中， 置于生化培养箱中在 28、 150rpm 条件下培养 18h 后， 于 4000r/min 离心 8min， 弃上清， 收集菌体沉淀， 加入菌体体积 15 倍左右的浓度为 1.5% 的无菌 NaCl 溶液充分 振荡均匀后， 再次于 4000r/min 离心 8min， 弃上清， 收集菌体沉淀， 重复同样步骤两次后， 用 浓度为 1.5% 的无菌 NaCl 溶液。
21、将收集的菌体重悬配制成 107 10 9cfu/mL 的菌悬液备用。 0030 先分别将 15g 脱脂乳粉、 10g 乳糖和 10g 海藻糖溶于 90mL 浓度为 1.5% 的 NaCl 溶 液中， 在 106条件下湿热灭菌 30min， 自然冷却后配制成溶液 A。将 2g 维生素 C 溶于 10mL 浓度为 1.5% 的无菌 NaCl 溶液中， 并经 0.22m 混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液 B。将 配置好的溶液 A 和溶液 B 在无菌条件下混合， 并振荡均匀后配制成 100mL 冻干保护剂溶液， 其各成份的终浓度为脱脂乳粉 150g/L、 乳糖 100g/L、 海藻糖 100g/L、 维。
22、生素 C 20g/L、 NaCl 15g/L。 0031 在无菌条件下， 将已配置好的菌悬液和保护剂溶液按体积比 1 ： 4 的比例混合并振 荡均匀后， 分装至数个 2mL 的无菌安培瓶中， 每个安培瓶中装有 1.5mL 的混合液， 将安培瓶 盖上胶塞后在 -80超低温冰箱中快速冷冻 6h。然后将已结冰的混合溶液迅速放入预冷的 真空冷冻干燥机冻干舱中， 在真空度0.28mbar、 冻干舱温度为-54的条件下冻干18小时， 再将真空度降低至 0.034mbar， 维持冻干舱温度 -54继续冻干 2 小时。冻干程序完成后， 向冻干舱内缓慢充入 99.99的高纯度干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密。
23、封即完成 这株迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保存。冻干并密封后的安培瓶置于常温下保存。 0032 在冻干完成后的当天， 第 7 天和第 90 天， 分别随机挑选 5 个安培瓶， 在无菌条件下 打开密封并加入1.5mL的灭菌蒸馏水进行复水， 待冻干粉末完全溶解后用浓度为1.5%的无 菌 NaCl 溶液进行梯度稀释， 并用胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板培养基涂布进行活菌计数， 以 测定冻干菌株的存活率。每个梯度进行 2 次平行实验， 取其平均值， 结果见表 2。 0033 本次实验结果证明， 通过本方法获得的迟钝爱德华氏菌冻干菌粉常温保存 1 天、 7 天和 90 天后的平均存活率均高于 19%， 冻干保护效果比较理想。 0034 表 2 迟钝爱德华氏菌冻干菌粉复水后的存活率 0035 说 明 书 CN 103468573 B 6 。