技术领域
本发明涉及一种杂交瘤细胞株及单克隆抗体。
背景技术
尽管近几年众多科技人员一直在努力研究人羧酸酯酶2，也有一些相关研 究报道，但羧酸酯酶(包括羧酸酯酶2)的天然底物仍不清楚，其生理作用也 待探索。
发明内容
本发明的目的是制备出分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及 人羧酸酯酶2的单克隆抗体，为人羧酸酯酶2的进一步研究提供了一种有力的 工具。分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过以下步骤制备：(一) 制备免疫原：提取人正常肝脏，破碎、离心后制成肝微粒体蛋白；(二)动物 免疫：将乳化后的肝微粒体蛋白注射进小鼠背部和腹腔，并反复加强免疫，直 至抗体效价等于、高于1∶1000；(三)制备滋养细胞：将HAT培养液注入正 常小鼠腹腔，揉捏小鼠腹部1～3min后回抽腹腔内液体离心，离心沉淀物加HAT 培养液注入孔培养板，在37±0.5℃环境中培养；(四)制备脾细胞：加强免疫 的小鼠注射与首次免疫注射剂量相同但不添加佐剂、未经乳化的人肝微粒体蛋 白，3天后将小鼠处死，消毒后取出小鼠脾脏制成脾细胞悬液，经静置、离心、 冰水浴、离心、稀释、计数和RPMI-1640培养液洗涤得到小鼠脾细胞；(五) 骨髓瘤细胞预处理：用RPMI-1640培养液将骨髓瘤细胞从培养容器壁上冲洗 下来，经收集、离心、稀释、计数和RPMI-1640培养液洗涤得到骨髓瘤细胞； (六)混合：脾细胞与骨髓瘤细胞按3～5∶1的细胞个数比混合；(七)细胞融 合：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合液离心，弃去上清液，轻轻弹动离心管使细胞 沉淀形成糊状，然后37℃水浴2min，之后在1min内加入1mL PEG4000、混 匀后37℃水浴45s，再分4次在7min内加入RPMI-1640培养液26mL，边加 培养液边不停的摇动离心管，培养液加入完成立即离心弃去上清液；(八)融 合细胞培养：向上一步细胞沉淀中缓慢加入HAT培养液，混匀后注入步骤(三) 中有滋养细胞的孔培养板，在37±0.5℃，CO2体积浓度为8±0.5％的环境中 培养，培养3～5天后用HAT培养液半量换液一次，继续培养10天后用HT培 养液半量换液一次，培养至第20天用RPMI-1640完全培养液半量换液；(九) 克隆化阳性杂交瘤细胞：孔培养板中融合细胞数量等于、大于105个/mL，采 用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞，用RPMI-1640完全培养液将阳性杂交瘤 细胞冲洗下来，在37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度的环境中克隆化培养， 培养1周后用RPMI-1640完全培养液半量换液培养，继续培养10～14天取培 养上清液用间接ELISA方法检测人羧酸酯酶2单克隆抗体效价，并选取抗体 效价高的培养孔中的阳性杂交瘤细胞再次在37℃、CO2体积浓度为5％、饱和 湿度的环境中反复克隆化培养至阳性杂交瘤细胞100％的分泌人羧酸酯酶2单 克隆抗体，即获得稳定分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。人羧酸 酯酶2的单克隆抗体通过以下步骤制备：(一)0.3～0.8mL液体石蜡注入小鼠 腹腔一周后将离心之后重悬浮于生理盐水中的分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体 的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔；(二)处死接种杂交瘤细胞7～12天腹部明显膨大 的小鼠，消毒后收集腹水，腹水在4℃、1000g的条件下离心5min，弃去上层 油脂和下层沉淀，吸取中层淡黄色腹水，在4℃、10000g的条件下离心10min， 弃去沉淀保留淡黄色腹水；(三)纯化淡黄色腹水中的人羧酸酯酶2的单克隆 抗体；(四)透析，即得到人羧酸酯酶2的单克隆抗体。本发明分泌人羧酸酯 酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株可稳定地分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体。本发 明制备出的人羧酸酯酶2单克隆抗体为进一步深入研究人羧酸酯酶2的结构、 功能和作用机制提供了一种有力的研究工具，具有良好的应用前景。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞 株通过以下步骤制备：(一)制备免疫原：提取人正常肝脏，破碎、离心后制 成肝微粒体蛋白；(二)动物免疫：将乳化后的肝微粒体蛋白注射进小鼠背部 和腹腔，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶1000；(三)制备滋 养细胞：将HAT培养液注入正常小鼠腹腔，揉捏小鼠腹部1～3min后回抽腹腔 内液体离心，离心沉淀物加HAT培养液注入孔培养板，在37±0.5℃环境中培 养；(四)制备脾细胞：加强免疫的小鼠注射与首次免疫注射剂量相同但不添 加佐剂、未经乳化的人肝微粒体蛋白，3天后将小鼠处死，消毒后取出小鼠脾 脏制成脾细胞悬液，经静置、离心、冰水浴、离心、稀释、计数和RPMI-1640 培养液洗涤得到小鼠脾细胞；(五)骨髓瘤细胞预处理：用RPMI-1640培养液 将骨髓瘤细胞从培养容器壁上冲洗下来，经收集、离心、稀释、计数和 RPMI-1640培养液洗涤得到骨髓瘤细胞；(六)混合：脾细胞与骨髓瘤细胞按 3～5∶1的细胞个数比混合；(七)细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合液离 心，弃去上清液，轻轻弹动离心管使细胞沉淀形成糊状，然后37℃水浴2min， 之后在1min内加入1mL PEG4000、混匀后37℃水浴45s，再分4次在7min 内加入RPMI-1640培养液26mL，边加培养液边不停的摇动离心管，培养液 加入完成立即离心弃去上清液；(八)融合细胞培养：向上一步细胞沉淀中缓 慢加入HAT培养液，混匀后注入步骤(三)中有滋养细胞的孔培养板，在37 ±0.5℃，CO2体积浓度为8±0.5％的环境中培养，培养3～5天后用HAT培养 液半量换液一次，继续培养10天后用HT培养液半量换液一次，培养至第20 天用RPMI-1640完全培养液半量换液；(九)克隆化阳性杂交瘤细胞：孔培养 板中融合细胞数量等于、大于105个/mL，采用间接ELISA方法检测杂交瘤细 胞，用RPMI-1640完全培养液将阳性杂交瘤细胞冲洗下来，在37℃、CO2体 积浓度为5％、饱和湿度的环境中克隆化培养，培养1周后用RPMI-1640完全 培养液半量换液培养，继续培养10～14天取培养上清液用间接ELISA方法检 测人羧酸酯酶2单克隆抗体效价，并选取抗体效价高的培养孔中的阳性杂交瘤 细胞再次在37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度的环境中反复克隆化培养至 阳性杂交瘤细胞100％的分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体，即获得稳定分泌人羧 酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本实施方式中提取的人正常肝脏来自于死亡时间未到24h的意外死亡者 (烧死者除外)或肝脏未发生病变的死亡者。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：小鼠是4～12 周龄BALB/c(近交系)雌性小鼠。其它与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(二) 中首次免疫注射后第3周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注 射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同；首次免疫注射使用 福氏完全佐剂乳化，加强免疫用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。其它步骤 与实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(三) 中的孔培养板为96孔培养板。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(七) 中分4次在7min内加入RPMI-1640培养液26mL，第一次1min内加入1mL RPMI-1640培养液，第二次2min内加入5mL RPMI-1640培养液，第三次2min 内加入10mL RPMI-1640培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640培养 液。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞 株通过以下步骤制备：
(一)制备免疫原：取10g人正常肝脏，剪碎成体积小于1mm3的小块用 浓度为0.1mol/L KH2PO4，0.1mol/L K2HPO4，0.25mol/L蔗糖的磷酸钾盐缓 冲液反复冲洗以除去血红蛋白，再次加入浓度为0.1mol/L KH2PO4，0.1mol/L K2HPO4，0.25mol/L蔗糖的磷酸钾盐缓冲液制成匀浆，置于4℃、10000g的 条件下离心30min，取上清液在4℃、30000g的条件下离心60min，取上清液 在4℃、100000g的条件下离心60min，取粉红色沉淀(肝微粒体蛋白)悬浮 于含有20％甘油、0.5％胆酸钠、2μg/mL Aprotinin(抑肽酶)、2μg/mL leupeptin (亮抑霉肽)、1μg/mL pepstalin(抑胃肽)、1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟) 的磷酸钾盐缓冲液中，放于-80℃的环境中保存；
(二)动物免疫：用Bradford法测定蛋白浓度(测定步骤参见Bradford 蛋白浓度测定试剂盒使用操作说明书)，取肝微粒体蛋白1mg，加入0.25mL 生理盐水，再加入与肝微粒体蛋白和生理盐水混合液体积相等的福氏完全佐剂 乳化肝微粒体蛋白，将乳化后的肝微粒体蛋白分两点注射进6周龄BALB/c雌 性小鼠背部，每一点注射100g，其余的注射进小鼠腹腔；首次免疫注射后 第3周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强 免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，选用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐 剂；直至抗体效价等于、高于1∶1000；
(三)制备滋养细胞：将正常8周龄BALB/c雌性小鼠拉颈脱臼处死，浸 泡于体积浓度为75％的酒精中5min，然后立即在超净工作台中剪开小鼠腹部 皮肤(注意切勿剪破小鼠腹膜，避免污染及腹腔液外流)，用酒精棉球擦拭腹 膜，将5～10mL HAT培养液注入小鼠腹腔，注射器停留不动，揉捏小鼠腹部 1min后回抽腹腔内液体5mL注入离心管，在1000r/min的条件下离心10min， 弃去上清液，离心沉淀物加20～50mL HAT培养液，重悬细胞，计数(50～100 个/L)后注入96孔培养板，每孔滴加80～120L，在37℃环境中培养、观 察(生长良好的滋养细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强)；
(四)制备脾细胞：加强免疫的小鼠注射与首次免疫注射剂量相同但不添 加佐剂、未经乳化的人肝微粒体蛋白，3天后将小鼠拉颈脱臼处死，用浓度为 75％的酒精消毒后取出小鼠脾脏，去除结缔组织，放入RPMI-1640培养液中制 成脾细胞悬液，抽取3～5mL脾细胞悬液和10mL RPMI-1640培养液注入离心 管静置10min，弃去组织块沉淀，将上悬液移至另一离心管(不含有沉淀组织 块)在1000r/min条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入6～7mL浓度 为0.17mol/L的NH4CL溶液悬浮沉淀，再冰水浴中10min(破碎红细胞)，然 后在1000r/min条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀(脾细胞)中加入20mL RPMI-1640培养液悬浮沉淀，从悬浮液中抽取10L悬浮液用磷酸盐缓冲液 (PBS)稀释100～200倍，计数，再用40mL RPMI-1640培养液洗涤小鼠脾细 胞2～3次，得到小鼠脾细胞；
(五)骨髓瘤细胞预处理：用加压的RPMI-1640培养液将生长良好的骨 髓瘤细胞(活细胞数＞95％，细胞生长密度过大的弃去不用)从培养容器壁上 冲洗下来，收集冲洗下来的骨髓瘤细胞并加入20mL RPMI-1640培养液，在 1000r/min条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入20mL RPMI-1640培 养液悬浮沉淀，从悬浮液中抽取10L悬浮液用PBS稀释10～20倍，计数， 再用40mL RPMI-1640培养液洗涤骨髓瘤细胞2～3次，得到骨髓瘤细胞；
(六)混合：脾细胞与骨髓瘤细胞按3～5∶1的细胞个数比混合；
(七)细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合液在1000r/min条件下离心 5min，弃去上清液，轻轻弹动离心管使细胞沉淀形成糊状，然后37℃水浴2min， 之后在1min内加入1mL PEG4000、混匀后37℃水浴45s，再分4次在7min 内加入RPMI-1640培养液26mL(第一次1min内加入1mL RPMI-1640培养液， 第二次2min内加入5mL RPMI-1640培养液，第三次2min内加入10mL RPMI-1640培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640培养液)，边加培养 液边不停的摇动离心管，培养液加入完成立即在1000r/min条件下离心5min， 弃去上清液；
(八)融合细胞培养：向上一步细胞沉淀中缓慢加入100mL HAT培养液， 重悬混匀后注入步骤(三)中有滋养细胞的96孔培养板，在37℃，CO2体积 浓度为8％的环境中培养，培养3～5天后用HAT培养液半量换液一次，继续培 养10天后用HT培养液半量换液一次，培养至第20天用RPMI-1640完全培养 液半量换液；
(九)克隆化阳性杂交瘤细胞：孔培养板中融合细胞数量等于、大于105个/mL，采用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞，用加压RPMI-1640完全培养 液将阳性杂交瘤细胞冲洗下来，并用RPMI-1640完全培养液将细胞稀释至 2500～3200个/mL，取0.1mL细胞稀释液和5mL RPMI-1640完全培养液混匀 滴入96孔培养板，在第1、2、3、7、8、9排每孔滴入2滴，第4、5、6、10、 11、12排每孔滴入1滴，并在第1至第6排每孔中加RPMI-1640完全培养液 至体积为5mL，然后将96孔培养板置于37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿 度的环境中克隆化培养，培养1周后用RPMI-1640完全培养液半量换液培养， 继续培养10～14天取培养上清液用间接ELISA方法检测人羧酸酯酶2单克隆 抗体效价，并选取抗体效价高的培养孔中的阳性杂交瘤细胞再次用RPMI-1640 完全培养液稀释100～200倍，置于37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度的环 境中反复克隆化培养至阳性杂交瘤细胞100％的分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体 为止，即获得稳定分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本实施方式取10mL阳性杂交瘤细胞培养上清液，加入400L Protein G-Sepharose混匀后室温摇动孵育30min，再在室温、4000g的条件下离心1min， 用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀(Protein G-抗体复合物)2～3次；取200g人肝微 粒体蛋白与磷酸钾盐缓冲液按1∶1的体积比混合后加入经过洗涤的沉淀 (Protein G-抗体复合物)，在室温条件下摇动孵育1h，之后在室温、4000g的 条件下离心1min，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2～3次，然后加入190L酸性洗 脱液，在室温、4000g的条件下离心1min，并重复离心两次，收集阳性杂交瘤 细胞离心上清洗脱液(抗原-抗体复合物)；取15L正常小鼠血清重复上述操 作。在15L阳性杂交瘤细胞上清洗脱液和15L正常小鼠血清上清洗脱液 中分别加入15L 2×SDS Loading Buffer，然后在95℃条件下加热5min，再置 于冰上冷却10min，经浓度为7.5％的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶)分离后考马斯亮蓝染色，脱色后切下阳性杂交瘤细胞泳道中与正常小鼠 血清泳道中不对应的蛋白条带(抗原蛋白条带)送往上海基康生物技术有限公 司，经鉴定为人羧酸酯酶2，top score为99，证明本实施方式成功获得稳定分 泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本实施方式获得的杂交瘤细胞株 连续培养或液氮冻存半年以上仍能稳定分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体。
具体实施方式七：本实施方式人羧酸酯酶2的单克隆抗体通过以下步骤制 备：(一)0.3～0.8mL液体石蜡注入小鼠腹腔一周后将离心之后重悬浮于生理 盐水中的分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔；(二)处 死接种杂交瘤细胞7～12天腹部明显膨大的小鼠，消毒后收集腹水，腹水在4 ℃、1000g的条件下离心5min，弃去上层油脂和下层沉淀，吸取中层淡黄色 腹水，在4℃、10000g的条件下离心10min，弃去沉淀保留淡黄色腹水；(三) 纯化淡黄色腹水中的人羧酸酯酶2的单克隆抗体；(四)透析，即得到人羧酸 酯酶2的单克隆抗体。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七的不同点是：步骤(三) 中采用G蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体。其它步骤与实施方式七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七的不同点是：步骤(四) 中透析液为PBS，透析22～26h，透析过程中透析液更换1～3次。其它步骤与
实施方式七相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式七的不同点是：小鼠是6～12 周龄BALB/c雄性小鼠。其它与实施方式七相同。
具体实施方式十一：本实施方式人羧酸酯酶2的单克隆抗体通过以下步骤 制备：
(一)0.5mL液体石蜡注入小鼠腹腔一周后将在1000r/min条件下离心 5min后重悬浮于生理盐水中的分泌人羧酸酯酶2单克隆抗体的杂交瘤细胞注 入10周龄BALB/c雄性小鼠腹腔；
(二)拉颈脱臼处死接种杂交瘤细胞7～12天腹部明显膨大的小鼠，消毒 后收集腹水，腹水在4℃、1000g的条件下离心5min，弃去上层油脂和下层沉 淀，吸取中层淡黄色腹水，在4℃、10000g的条件下离心10min，弃去沉淀保 留淡黄色腹水(可在-80℃的条件下保存)；
(三)采用G蛋白亲和层析技术纯化淡黄色腹水中的人羧酸酯酶2的单 克隆抗体，G蛋白亲和层析纯化步骤参见Amersham Biosciences公司HiTrap Protein G HP(HiTrap affinity columns)试剂盒使用操作说明书；
(四)将装有人羧酸酯酶2单克隆抗体的透析袋放入盛有1L PBS的容器 中，透析24h，透析过程中透析液PBS更换2次，即得到人羧酸酯酶2的单克 隆抗体。
通过免疫印迹检测证明本实施方式制备的抗体能特异性识别人肝微粒体 蛋白中分子量约为62kD的蛋白分子(人肝脏羧酸酯酶2分子量为61.807kD)， 并能与还原及非还原的人羧酸酯酶2结合，说明本实施方式制备的抗体与羧酸 酯酶2结合的抗原表位是线性的，而且位于酶蛋白的表面。本实施方式采用亚 类测定试剂盒(HyCult biotechnology bv公司)测定人羧酸酯酶2的单克隆抗 体，测定步骤参见亚类测定试剂盒使用操作说明书，亚类测定结果表明：人羧 酸酯酶2的单克隆抗体为IgG型，其中重链为IgG1，轻链为κ。在400×光镜 下观察免疫组化结果，本实施方式制备的人羧酸酯酶2单克隆抗体只与肝细胞 内蛋白有特异性弥漫结合，与血管壁平滑肌细胞蛋白及内皮细胞蛋白无特异结 合。