有机酸的制造方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102076863 A (43)申请公布日 2011.05.25 CN 102076863 A *CN102076863A* (21)申请号 200980124268.3 (22)申请日 2009.06.29 2008-170854 2008.06.30 JP C12P 7/40(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12P 7/56(2006.01) (71)申请人 丰田自动车株式会社 地址 日本爱知县 (72)发明人 大西彻 松下响 多田宣纪 石田亘广 嶋村隆 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 苗堃 金。

2、世煜 (54) 发明名称 有机酸的制造方法 (57) 摘要 本发明使用生产有机酸的酵母发酵该有机 酸而进行生产时， 不实施突变育种、 DNA 重组育种 等， 通过简单的方法提高有机酸的发酵效率。 通过 将生产有机酸的酵母在调整为低 pH 的含有有机 酸的培养基中处理而大幅提高该酵母的有机酸生 产效率。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.12.24 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2009/061863 2009.06.29 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/001862 JA 2010.01.07 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国。

3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 3 页 CN 102076870 A1/1 页 2 1. 一种有机酸的制造方法， 其特征在于， 具有如下步骤 ： 使具有生产有机酸能力的酵母以调整为低 pH 的含有有机酸的培养基进行处理的步骤 a， 和 在所述步骤 a 之后， 通过使用了所述酵母的发酵来产生有机酸的步骤 b。 2.如权利要求1所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述步骤a具有通过使用了所 述酵母的发酵来产生有机酸的步骤 c， 通过所述步骤 c 中产生的有机酸而将所述含有有机 酸的培养基调整为低 pH。 3. 如权利要求 2 所述。

4、的有机酸的制造方法， 其特征在于， 在所述步骤 c 中， 在利用所述 酵母进行发酵时将所述酵母生产的有机酸通过添加碱而中和， 通过停止或减少添加碱而由 所述酵母生产的有机酸将所述含有有机酸的培养基调整为低 pH。 4. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述含有有机酸的培养基中 所含的有机酸是从外部添加的。 5. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述含有有机酸的培养基中 所含的有机酸是选自乳酸、 琥珀酸和丙酮酸中的至少 1 种有机酸。 6. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述含有有机酸的培养基含 有通过向含有有机酸盐的培养。

5、基添加无机酸而游离的有机酸。 7. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述酵母是属于酵母属的酵 母。 8. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述酵母是属于酿酒酵母菌 种的酵母。 9. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 所述酵母是导入有乳酸脱氢 酶基因的突变体。 10. 如权利要求 1 所述的有机酸的制造方法， 其特征在于， 酵母生产的有机酸是乳酸。 权 利 要 求 书 CN 102076863 A CN 102076870 A1/9 页 3 有机酸的制造方法 技术领域 0001 本发明涉及使用乳酸等的生产有机酸的酵母的有机酸的。

6、制造方法。 背景技术 0002 通常， 使用微生物发酵生产有机酸时， 通过中和剂将 pH 控制为中性而进行发酵。 然而， 以该方法生产的有机酸为盐的状态， 需要用提纯工序进行脱盐， 所以导致制造成本的 上升。因此， 虽然可以考虑在酸性条件下进行有机酸发酵， 但已知好酸菌的繁殖受乙酸、 乳 酸、 琥珀酸等有机酸的抑制 ( 非专利文献 1 ： 大岛泰郎主编 “极端微生物手册 ( 極限微生 物 )” 第 231 项 )， 除了曲霉属 (Aspergillus spp.) 的柠檬酸发酵情况， 几 乎不知道以高效率生产有机酸的菌。作为解决该问题的方法， 已公开有对高效率生产有 机酸的菌株通过突变育种而赋。

7、予耐酸性的方法 ( 非专利文献 2 ： R.Patnaik et al.， Nat. Biotechnol.20(2002)， pp.707-712)， 以耐酸性强但生产能力低的菌种为母株实施提高收 率为目的的代谢改变的方法(专利文献1 ： 特表2003-500062号公报)， 但其效果并不充分。 0003 如上所述， 虽然在进行通过利用突变育种法、 基因工学的方法而改变微生物这样 的方法来提高有机酸的生产率的尝试， 但这些改变微生物的方法较复杂， 且不尽然能够可 靠地得到所希望的特性。 0004 专利文献 1 ： 日本特表 2003-500062 号公报 0005 非专利文献 1 ： 大岛泰。

8、郎主编 “極限微生物” 第 231 项 0006 非专利文献 2 ： R.Patnaik et al.， Nat.Biotechnol.20(2002)， pp.707-712 发明内容 0007 因此， 本发明的目的在于提供一种在使用生产有机酸的酵母发酵该有机酸而进行 生产时， 不实施突变育种、 DNA 重组育种等， 而通过简便的方法提高有机酸的发酵效率的方 法。 0008 为了达成上述目的， 本发明人进行深刻研究的结果， 发现将生产有机酸的酵母在 调整为低 pH 的含有有机酸的培养基中处理而能大幅提高该酵母的有机酸生产效率， 从而 完成了本发明。 0009 即， 本发明的有机酸的制造方法具。

9、有如下步骤 ： 使具有生产有机酸能力的酵母以 调整为低pH的含有有机酸的培养基进行处理的步骤a， 和在所述步骤a之后， 通过使用所述 酵母的发酵而产生有机酸的步骤 b。 0010 并且， 本发明的有机酸的制造方法中， 所述步骤 a 可以具有通过使用所述酵母的 发酵而产生有机酸的步骤 c， 通过所述步骤 c 中产生的有机酸而将所述含有有机酸的培养 基调整为低 pH。即， 将酵母通过在步骤 c 的发酵工序和步骤 b 的发酵工序之间用有机酸调 整为低 pH 的含有有机酸的培养基进行处理这样的、 例如在连续培养中可以应用本发明。 0011 并且， 本发明的有机酸的制造方法的上述步骤 c 中， 还可以在。

10、利用上述酵母进行 发酵时将上述酵母生产的有机酸通过添加碱而中和， 通过停止或减少添加碱， 从而通过上 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A2/9 页 4 述酵母生产的有机酸将含有有机酸的培养基调整为低pH。 即， 用于将培养基调整为低pH的 有机酸可以不是从培养系外部添加， 而是利用上述酵母生产的有机酸。 0012 进而， 在本发明的有机酸的制造方法中， 上述含有有机酸的培养基可以是通过向 含有有机酸盐的培养基添加无机酸而含有游离的有机酸的物质。 即， 如上所述， 在将酵母生 产的有机酸进行碱中和而以有机酸盐的状态含在培养基时， 通过添加无机酸 ( 例如强酸 。

11、) 而能使有机酸游离。由此， 能够准备用于处理酵母的含有有机酸的培养基。 0013 另一方面， 本发明的有机酸的制造方法中， 上述含有有机酸的培养基可以是从外 部添加有机酸而调整为低 pH 的培养基。 0014 其中， 作为用于将上述培养基调整为低 pH 的有机酸， 可以举出选自乳酸、 琥珀酸 以及丙酮酸中的至少 1 种的有机酸。 0015 本发明的有机酸的制造方法中， 上述酵母是属于酵母 (Saccharomyces) 属的酵 母， 特别是优选使用属于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌种的酵母。本发明的有 机酸的制造方法中， 优选使用导入了乳酸脱氢酶基因的突变。

12、体作为上述酵母。 即， 本发明的 有机酸的制造方法中， 优选以乳酸作为生产对象有机酸。 0016 根据本发明， 能够非常简单地提高生产有机酸的酵母的有机酸生产能力， 能够大 幅改善利用发酵法的有机酸生产率。 附图说明 0017 图 1 为表示施加乳酸应激与发酵试验的 pH 之间的关系的特性图。 0018 图 2 为表示各种培养基中的因菌自身生产的有机酸而导致的 pH 变化的特性图。 0019 图 3 为表示利用菌自身生产的有机酸而施加 pH 应激时的发酵试验的结果的特性 图。其中， 纵轴所示的浓度 ( ) 是发酵 18 小时后的发酵液组成的浓度。 具体实施方式 0020 本说明书包括作为本申请。

13、优先权基础的日本国专利申请 2008-170854 号的说明 书和 / 或附图所记载的内容。 0021 下面， 对本发明进行详细的说明。 0022 本发明中， 将生产有机酸的酵母， 在进行作为目标物质的有机酸的发酵生产之 前， 用调整为低 pH 的含有有机酸的培养基进行处理。在此， 作为生产有机酸的酵母， 可 以是原本就具有有机酸生产能力的酵母， 也可以是通过基因工学的方法等赋予了有机 酸生产能力的酵母。作为酵母的一例可以举出属于酵母 (Saccharomyces) 属、 酿酒裂 殖酵母 (Shizosaccharomyces) 属、 念珠菌 (Candida) 属、 毕赤酵母 (Pichia。

14、) 属、 汉逊 酵母 (Hansenula) 属、 球拟酵母 (Torulopsis) 属、 亚罗酵母 (Yarrowia) 属、 克鲁维酵母 (Kluyveromyces) 属、 接合酵母 (Zygosaccharomyces) 属、 亚罗酵母 (Yarrowia) 属、 伊萨酵 母 (Issatchenkia) 属的酵母。其中， 优选使用属于酿酒酵母的菌种的酵母。而且， 优选使 用导入了 1 拷贝或多拷贝乳酸脱氢酶基因 (LDH 基因 ) 的酿酒酵母突变体且其被赋予了乳 酸生产能力。另外， 作为酵母生产的有机酸优选为乳酸， 但并不局限于此， 例如可以以丙酮 酸、 琥珀酸、 柠檬酸、 富马酸。

15、、 苹果酸、 乙酸、 3- 羟丙酸、 丙二酸、 丙酸、 天门冬氨酸、 谷氨酸、 衣 康酸、 乙酰丙酸、 抗坏血酸、 葡萄糖酸等的有机酸为生产对象。 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A3/9 页 5 0023 另外， 对于主要代谢产物为乙醇的野生型酵母， 为了赋予有机酸的生产能力有必 要进行代谢改变。 例如， 对酵母赋予乳酸生成能力时， 可以用转化与乳酸生物合成相关基因 的方法进行应对。 0024 作为与乳酸生物合成相关的基因， 可以例示日本专利特开 2003-259878 号公 报所记载的乳酸脱氢酶基因、 来源于乳酸菌的基因 (J.Ind.Microbiol。

16、.Biotechnol.31， 209-215、 特表 2005-518197 号 )、 来源于巨大芽胞杆菌 (Bacillus megatherium) 的基因 (特表2005-518197号)、 来源于真菌(根霉属)的基因(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30， 22-275)、 来源于牛的基因 (Appl.Environ.Microbiol.67， 5621-5625) 等。除此之外作为可 以使用的基因还可以举出来源于乳酸菌等的原核生物、 真菌等的真核生物、 植物、 动物和昆 虫等的高等真核生物的乳酸脱氢酶。 0025 特别是优选将日本专利特开 2003-25987。

17、8 号公报所记载的导入了乳酸脱氢酶基 因的酵母作为具有乳酸生成能力的酵母使用。 该乳酸脱氢酶基因由于其在酵母中的表达已 被最适化， 所以转化到酵母时能够高效率生产 L- 乳酸。其中， 作为转化微生物的例子可以 举出重组酵母 (Appl.Environ.Microbiol.， 1999， 65(9) ； 4211-4215) 等。 0026 另外， 所述对酵母的处理是指将调整为低 pH 的含有有机酸的培养基与酵母接触 的处理。在此， 低 pH 是指培养基呈酸性条件的意思， 即， 不足 pH7.0 的意思， 优选 pH4.0 以 下、 更优选 pH3.5 以下的意思。其中， 为酿酒酵母时， 对于乙。

18、醇发酵， 培养、 发酵的最适 pH 为 5.0 至 6.0， 当在 pH4.0 以下进行培养、 发酵时， 显著抑制菌的繁殖、 乙醇的生产。而且， 根据 处理对象的酵母， 在强酸性条件下有死亡的可能性。因此， 作为低 pH 优选的是调整成处理 对象的酵母不死亡的范围。例如， 处理导入了 LDH 基因的酿酒酵母突变体的培养基的 pH 下 限， 优选调整为 pH2.0。 0027 在此， 处理酵母的培养基含有有机酸， 被调整为低 pH。用于将培养基调整为低 pH 的有机酸， 可以举出选自乳酸、 琥珀酸以及丙酮酸中的至少 1 种的有机酸。然而， 作为有机 酸并不局限于这些示例， 例如可以举出乙酸、 甲。

19、酸、 安息香酸、 柠檬酸、 D- 葡萄糖醛酸、 草酸、 富马酸、 苹果酸、 3- 羟丙酸、 丙二酸、 丙酸、 天门冬氨酸、 谷氨酸、 衣康酸、 乙酰丙酸、 抗坏血 酸、 葡萄糖酸等。 0028 另外， 含有有机酸的培养基可以通过对后述的培养基组成从外部添加上述的有机 酸而准备， 也可以是对含有有机酸盐的组成添加硫酸等的强酸而使有机酸游离的培养基。 在此， 从有机酸盐游离有机酸时， 只要是比对象有机酸强的酸则无特别限定。 0029 用于处理酵母的培养基中， 对于培养基组成没有特别的限定。 例如， 作为发酵培养 基的营养碳源可以使用任意的作为具有有机酸生成能力的酵母的营养碳源已知的物质， 在 酵母。

20、进行繁殖生成有机酸的范围内根据所使用的酵母的种类适当选择。例如使用葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖、 糖蜜、 来自玉米浆以及纤维素系物质的糖类等作为营养碳源。 另外， 作为发酵 培养基的氮源， 例如可以使用酵母提取物、 蛋白胨以及乳清等， 但为了制成低价且对提纯工 序没有负担的培养基， 优选不添加氮源， 或者使用硫酸铵等铵盐等的无机态氮、 尿素。 进而， 作为无机物营养源， 例如可以使用磷酸钾、 硫酸镁、 Fe( 铁 )、 Mn( 锰 ) 化合物等， 但不是必须 的成分。 0030 将上述酵母用调整为低 pH 的培养基进行处理时， 例如， 使用以乳酸调整为 pH3.0 的培养基时， 优选 2 小时以上。

21、。并且， 培养基的 pH 越低， 越可以缩短处理时间。另外， 处理 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A4/9 页 6 温度虽然因酵母的种类而不同， 但通常在约为 20 40左右进行。其中， 根据酵母的种类 也可以在超过40的高温下进行处理。 另外， 也可以对调整为低pH的培养基进行搅拌或者 振荡等而处理上述酵母。 0031 如上所述， 通过将具有有机酸生产能力的酵母， 以调整为低 pH 的培养基进行处 理， 能够提高该酵母的有机酸生产能力， 进而能够提高该酵母的耐酸性。 有机酸生产能力可 以通过对使用未处理的酵母生产有机酸时的培养基所含的有机酸浓度和使用上述。

22、处理后 的酵母生产有机酸时的培养基所含的有机酸浓度进行对比而评价。 0032 另外， 使用上述酵母的有机酸的制造可以用分批式培养进行， 也可以用连续式培 养进行， 还可以用半分批式培养进行。 分批式培养是对于多次的培养每次准备新培养基， 向 其植入酵母， 直至有机酸的生产结束不添加培养基的方法。 连续式培养也称为灌流培养， 是 以一定的速度向培养系供给培养基， 同时抽取同量的培养液的培养法。半分批式培养是在 培养过程中一边将培养基自身、 培养基中的特定的成分连续或间歇性添加一边进行培养的 方法。 另外， 无论采用哪一个方式的情况下， 均可以将上述的酵母以担载于固体化载体的状 态进行使用。 00。

23、33 在这些的任一方式中， 均能通过在开始用上述酵母发酵生产有机酸之前使用上述 的调整为低 pH 的含有有机酸的培养基进行处理， 而大幅提高利用发酵生产的有机酸的生 产效率。另外， 任一方式中， 为了防止因培养中产生的有机酸而 pH 向酸性侧变化， 也可以进 行氨、 Ca(OH)2、 CaCO3以及 NaOH 等中和剂的添加 ( 添加碱 )。并且， 通过上述的调整为低 pH 的培养基进行处理的酵母， 由于其耐酸性得到了提高， 因此即使没有使用中和剂将 pH 维持 在中性区域， 也能发酵生产有机酸。 0034 另外， 在上述的任一方式中， 均能通过在有机酸的发酵制造结束时将培养基通过 有机酸调整。

24、为低 pH 而在下次的有机酸发酵制造中提高酵母的有机酸生产能力。即， 本发明 的有机酸的制造方法能够应用于经过多次的有机酸的发酵制造而进行的制造方法， 能够通 过在各次的发酵制造结束时通过有机酸调整为低 pH 而提高酵母的有机酸生产能力。 0035 在进行有机酸的发酵制造时通过上述的添加碱而进行中和的情况下， 可通过停止 添加碱或减少添加量而降低 pH， 从而能够准备调整为低 pH 的含有有机酸的培养基。另外， 通过添加碱而使培养基含有有机酸盐的情况下， 可通过添加硫酸等的强酸而使有机酸游离 于培养基中， 从而能够准备调整为低 pH 的含有有机酸的培养基。在此， 从有机酸盐使有机 酸游离时， 。

25、只要是比对象有机酸强的酸就没有特别限定。 0036 并且， 使用上述的酵母发酵制造有机酸时， 对于温度条件没有特别的限定， 约为 20 40左右。然而， 根据使用的酵母， 也可以在更高的温度下进行。对于生成有机酸所 需的反应时间也没有特别的限定， 可在能够得到本发明效果的范围内以任意的生成反应时 间实施。 另外， 由于生成有机酸所需的反应时间与菌体的接种量成反比， 所以探讨接种量则 能够调整反应时间。本领域技术人员能够容易地确定这些条件的最适化。 0037 实施例 0038 下面， 用实施例进一步详细说明本发明， 但本发明的技术范围并不被以下的实施 例所限定。 0039 实施例 1 0040 。

26、本实施例中， 以日本特开 2006-006271 中制作的乳酸脱氢酶 4 拷贝导入菌株作为 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A5/9 页 7 母株， 制备进一步导入了 2 拷贝乳酸脱氢酶基因的菌株 ( 乳酸脱氢酶基因 6 拷贝导入菌 株 )， 作为乳酸生产酵母。 0041 (G418 耐性标记盒的构建 ) 0042 以酵母 NBRC2260 株的基因组 DNA 为模板， 对 TDH3 启动子区域的 DNA 片段以 PCR 进行了扩增。PCR 引物使用了 TDH3P-U(5 -ATA TAT GGA TCC GGT AGA ATC ATT TTG AAT AA。

27、-3 ( 序列号 1)、 TDH3 启动子序列上附加 BamHI 酶切位点 )、 TDH3P-D(5 -ATA TAT GAA TTC TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3 ( 序列号 1)、 TDH3 启动子序列上附加 EcoRI 酶切位 点 )。将扩增了的 TDH3 启动子序列用限制酶 BamHI 和 EcoRI 消化的片段称为 TDH3P 片段。 0043 以大肠杆菌 K-12 株基因组的基因组 DNA 为模板， 对 G418 耐性基因片段以 PCR 进 行了扩增。PCR 引物使用了 G418ORF-U(5 -ATA TAT GAA TTC ATG CAT ATT C。

28、AA CGG GAA AC-3 (序列号3)、 G418耐性基因序列上附加限制酶EcoRI酶切位点)和G418ORF-D(5 -ATA TAT CTT AAG TTA CAA CCA ATT AAC CAA TTC-3 ( 序列号 4)、 G418 耐性基因序列附加限制 酶 AflII 酶切位点 )。将扩增了的 G418 耐性基因序列用限制酶 EcoRI 和 AflII 消化的片段 称为 G418 片段。 0044 以酵母 NBRC2260 株的基因组 DNA 为模板， 将 CYC1 终止子区域的 DNA 片段用 PCR 进行了扩增。PCR 引物使用了 CYC1T-U(5 -ATA TAT C。

29、TT AAG ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3 ( 序列号 5)、 CYC1 终止子序列上附加 AflII 酶切位点 )、 CYC1T-D(5 ATA TAT CCG CGG GTT ACA TGC GTA CAC GCG-3 ( 序列号 6)、 CYC1 终止子序列上附加 SacII 酶切位点 )。将 扩增了的 CYC1 终止子序列用限制酶 AflII 和 SacII 消化的片段称为 CYC1T 片段。 0045 将在上述操作中得到的TDH3P片段、 G418片段和CYC1T片段， 以该顺序排列的方式 依次连接于 pBluescriptII SK+ 载体的多克隆位点， 。

30、构建了 G418 耐性标记盒。将得到的载 体用限制酶 SacI 和 EcoRV 消化， 并进行末端修饰酶 T4DNA polymerase 处理， 切取 G418 耐 性标记盒， 将末端平滑化的片段称为 G418 耐性标记盒片段。 0046 ( 染色体导入型载体 pBG418-LDHKCB 的构建 ) 0047 如下制备了用于在 7 号染色体中的 PDC6 基因和 CTT1 基因之间导入 LDH 基因的染 色体导入型载体。 0048 以酵母 NBRC2260 株的基因组 DNA 为模板， 将 PDC6 基因 5 上游序列的 DNA 片段用 PCR进行了扩增。 PCR引物使用了PDC6-U(5 。

31、-ATA TAT GAG CTC GTT GGC AAT ATG TTT TTG C-3 ( 序列号 7)、 PDC6 的 5 上游序列上附加 SacI 酶切位点 ) 和 PDC6-D(5 -ATA TAT GCG GCC GCT TCC AAG CAT CTC ATA AAC C-3 ( 序列号 8)、 PDC6 的 5 上游序列上附加 NotI 酶 切位点 )。将扩增了的 PDC6 基因 5 上游序列用限制酶 SacI 和 NotI 消化的片段称为 PDC6 片段。 0049 以酵母 NBRC2260 株的基因组 DNA 为模板， 将 CTT1 基因 5 上游序列的 DNA 片段 用 PC。

32、R 进行了扩增。PCR 引物使用了 CTT1-U(5 -ATA TAT GGG CCC GAT GTC GTA CGA TCG CCT GCA C-3 ( 序列号 9)、 CTT1 的 5 上游序列上附加 ApaI 酶切位点 ) 和 CTT1-D(5 -ATA TAT GGT ACC GGG CAA GTA ACG ACA AGA TTG-3 ( 序列号 10)、 CTT1 的 5 上游序列上附加 KpnI 酶切位点 )。将扩增了的 CTT1 基因 5 上游序列用限制酶 ApaI 和 KpnI 消化的片段称 为 CTT1 片段。 0050 对 在 日 本 特 开 2003-259878( 特 。

33、愿 2002-65879) 号 公 报 中 制 备 的 质 粒 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A6/9 页 8 pBTrp-PDC1-LDHKCB， 通过 BamHI 和 PstI 进行消化而切取的片段称为 LDHKCB 表达盒片段 (PDC1 启动子、 LDH 基因、 TDH3 终止子以该顺序连接的片段 )。将在上述操作中得到的各 片段 (PDC6 片段、 LDHKCB 表达盒片段、 G418 耐性标记盒片段和 CTT1 片段 )， 依次连接于 pBluescriptII SK+ 载体的多克隆位点， 构建了染色体导入型载体 pBG418-LDHKCB。 。

34、0051 (LDH6 拷贝导入株的制备 ) 0052 以 乙 酸 锂 法 (Ito et al.， J.Bacteriol.， 153， 163-168(1983)，使 用 将 pG418-LDHKCB 载体用限制酶 SacI 和 KpnI 消化的片段， 将在日本特开 2006-006271 号公报 中制备的 PDC1p-LDH 4 拷贝菌株转化。以含 10g/ml G418 的 YPD 培养基选拔后， 用 PCR 确认导入基因， 得到了转化体。 0053 将该株用胞子形成培养基 (1磷酸钾、 0.1酵母提取物、 0.05葡萄糖、 2琼 脂 ) 形成胞子， 利用同宗配合性进行 2 倍化。取得作。

35、为 2 倍体的染色体的两者均导入了目 标基因的菌株， 将其作为 PDC1p-LDH 6 拷贝株。 0054 ( 赋予乳酸应激和发酵试验 ) 0055 对于上述 PDC1p-LDH6 拷贝株， 在含碳酸钙 0.1的 YPD 培养基 ( 酵母提取物 1、 蛋白胨 2、 葡萄糖 2 ) 上接菌， 以 150rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm) 进行了 30、 22 小时的培 养， 添加乳酸、 琥珀酸或丙酮酸成为规定浓度， 测定 pH， 进一步培养了 5 小时。 0056 将发酵培养基 ( 浓度糖 12、 磷酸二氢钾 0.04、 硫酸镁 0.04、 碳酸钙 0.4 )20ml 加入容量 100ml 的。

36、烧瓶， 将上述菌体以浓度成为 4的方式进行接种， 在 120rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm)、 34的条件下进行发酵， 研究乳酸的生产量。其中， 由于在发酵 16 小时的时间点上在全部处理区糖全被消费， 或即使存在残留糖的处理区乳酸浓度也开始 减少， 而结束了发酵试验。 0057 乳酸的测定使用了生物传感器 BF-4 以及 BF-5( 王子计测机器 )。对乳酸进行测 定， 将对酸处理后的培养基 pH 以及培养结束时的培养基 pH 进行测定的结果示于表 1。 0058 表 1 0059 0060 从表 1 可知， 发酵试验的结果， 在乳酸 400mM 以上、 琥珀酸 400mM 以上的处理区。

37、中 乳酸浓度提高。另外， 以低浓度就能使培养基酸性化的能力高的丙酮酸， 即使在 100mM 时也 提高了乳酸浓度。 0061 ( 赋予乳酸应激和发酵试验的 pH) 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A7/9 页 9 0062 对上述 PDC1p-LDH6 拷贝株， 在含碳酸钙 0.1的 YPD 培养基 ( 酵母提取物 1、 蛋 白胨 2， 葡萄糖 2 ) 进行接菌， 以 150rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm) 进行 30、 22 小时的培养， 进行乳酸 600mM 的处理， 进一步培养了 5 小时。并且， 将未进行乳酸处理培养了 27 小时的 菌作为对照。。

38、 0063 将通过改变碳酸钙的浓度而改变 pH 的发酵培养基 ( 浓度糖 12、 磷酸二氢钾 0.04、 硫酸镁 0.04、 碳酸钙 0.1、 0.5、 1.0、 2.0、 4.0或 5.0 )20ml， 加入容 量 100ml 的烧瓶， 将上述 2 种类的培养菌以浓度成为 4的方式进行接种， 在 120rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm)、 34下进行了发酵， 研究乳酸的生产量。并且， 在发酵 16 小时结束了发酵试 验。发酵 16 小时的时间点上除了碳酸钙 0.1的处理区， 糖全被消费。 0064 乳酸的测定使用了生物传感器 BF-4 以及 BF-5( 王子计测机器 )。结果示于图 1。 。

39、并且， 图的乳酸浓度表示发酵 16 小时为止的最高浓度。pH 表示乳酸最高浓度时的数据。 0065 发酵试验的结果、 进行乳酸 600mM 处理的菌， 与未处理的菌相比， 在所有的处理区 中乳酸浓度均提高。并且， 发酵液的 pH 成为 2.4 至 5.1 的范围。从本结果可知， 通过有机 酸应激的发酵能力提升效果是与发酵时的控制 pH 无关的。 0066 ( 利用菌自身生产的有机酸而赋予 pH 应激和发酵试验 ) 0067 从培养基消减酵母提取物、 蛋白胨等缓冲能力高的培养基添加物， 仅通过菌所生 产的有机酸降低培养基的 pH， 从而研究了是否能够得到与从外部添加有机酸而降低 pH 的 情况相。

40、同的效果。在改变的 YPD 培养基 ( 酵母提取物 0.5、 蛋白胨 1、 葡萄糖 3 ) 上接 菌上述 PDC1p-LDH6 拷贝株， 以 150rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm) 进行了 30、 33 小时的培养。作 为对照， 准备了培养开始8、 24、 29小时后添加碳酸钙， 抑制培养基的pH下降的处理区， 以及 用 YPD 培养基培养的处理区 ( 未添加碳酸钙 )。 0068 以改变的 YPD 培养基进行培养的菌， pH 降低至 3.0， 而在向改变的 YPD 培养基添加 了碳酸钙的处理区(1)(8、 24、 29小时后各添加了0.1、 0.2、 0.1浓度量的碳酸钙)中， 虽然在 。

41、24 小时后降低至 pH3.3， 但培养结束时变成了 pH4.3。在向改变的 YPD 培养基添加 了碳酸钙的处理区 (2)(8、 24、 29 小时后各添加 0.1、 0.3、 0.2浓度量的碳酸钙 ) 中， 培养结束时成为 pH6.4。以 YPD 培养基进行培养时， 虽然 pH 降低至 3.8， 但培养结束时成为 pH4.2( 图 2)。并且， 测定培养结束时的培养基的乳酸浓度的结果， 未检测到乳酸， 所以 pH 降低的主要原因考虑是由于乳酸导致的 ( 参照表 2)。 0069 表 2 0070 0071 将发酵培养基 ( 浓度糖 13.8、 碳酸钙 0.5、 磷酸二氢钾 0.04、 硫酸镁。

42、 0.04 )20ml 加入容量 100ml 的带挡板烧瓶， 以上述培养菌体的浓度成为 4的方式进行 接种， 在 120rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm)、 34下进行发酵， 研究了 18 小时后的发酵液组成 ( 图 3)。发酵试验的结果， 以改变的 YPD 培养基培养的菌呈最高的乳酸浓度。乳酸、 葡萄糖、 乙 醇的测定使用了生物传感器 BF-4 以及 BF-5( 王子计测机器 )。进一步测定发酵 18 小时后 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A8/9 页 10 的活细胞数的结果， 细胞数虽然波动为培养开始时的 30-50左右， 但在乳酸发酵能力和活 细胞。

43、数之间未存在相关性。活细胞数的测定使用了生死细胞自动分析仪 Vi-CELL(Beckman Coulter)。 0072 从本结果可知， 作为提高发酵能力所需的有机酸应激， 只要在培养基中存在一定 浓度的有机酸， 并不是非要从外部添加有机酸而将培养基调整为低 pH， 其效果依赖于 pH。 0073 实施例 2 0074 本实施例中， 对实施例1中使用的PDC1p-LDH6拷贝株的有机酸处理时间进行了探 讨。具体而言， 将 PDC1p-LDH6 拷贝株在含碳酸钙 0.1的 YPD 培养基 ( 酵母提取物 1、 蛋 白胨 2， 葡萄糖 2 ) 上接菌， 以 150rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm。

44、) 进行了 30、 21 小时的培养。 其后， 添加乳酸 600mM 作为有机酸处理， 进一步进行了 30 分钟至 5 小时的培养。另外， 以未 乳酸处理而进行了 21 小时的培养的菌作为对照。 0075 接着， 将发酵培养基 ( 浓度糖 13、 磷酸二氢钾 0.04、 硫酸镁 0.04、 碳酸钙 0.4)20ml加入容量100ml的烧瓶， 将上述菌体以浓度成为4的方式接种， 在120rpm/分 钟(振幅35mm)、 34下进行发酵， 研究了乳酸的生产量。 发酵17小时后测定的乳酸浓度以 及葡萄糖浓度的结果示于表 3。其中， 即使 17 小时以上继续发酵， 乳酸浓度也未提高。乳酸 以及葡萄糖的。

45、测定使用了生物传感器 BF-4 以及 BF-5( 王子计测机器 )。 0076 表 3 0077 0078 从表 3 可知， 发酵试验的结果， 在乳酸处理 2 小时以上的处理区中， 相对于未处理 区乳酸浓度显著提高， 所以， 有机酸应激所需的时间优选设成 2 小时以上。并且， 本实施例 中是以使用乳酸作为有机酸， 培养结束时的培养基 pH 为 3.0 的试验系进行了评价， 可以理 解为根据有机酸的种类、 培养结束时的 pH， 有机酸应激所需的时间不同。 0079 实施例 3 0080 本实施例中， 对实施例 1 使用的 PDC1p-LDH6 拷贝株的有机酸处理优选的 pH 进行 了探讨。具体而。

46、言， 对上述 PDC1p-LDH6 拷贝株， 使用 Biott 公司制的 1L 培养罐， 将 pH 控制 为 5.2、 4.5、 4.0 或 3.5 进行了繁殖。使用如此以各种 pH 处理的菌体进行发酵试验， 测定乳 酸生产量， 从而研究了赋予乳酸应激时的 pH 对发酵试验的影响。其中， 1L 培养罐中的菌体 增殖(赋予乳酸应激)使用YPD培养基， 以搅拌数450rpm、 通气量1vvm(volume per volume per minute(每单位体积的气体通气量)、 30进行了17小时的培养。 pH的控制是以乳酸 和氢氧化钠进行的。 0081 将发酵培养基 ( 葡萄糖 13、 磷酸二氢钾。

47、 0.01、 硫酸镁 0.01、 碳酸钙 0.4 )20mL 加入容量 100mL 的烧瓶， 将上述菌体以浓度分别成为 1的方式进行接种， 在 120rpm( 振幅 35mm)、 34下进行发酵， 探讨了乳酸的生产量。 0082 乳酸的测定使用了生物传感器BF-4以及BF-5(王子计测机器社制)。 结果示于表 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A9/9 页 11 4。其中， 表 4 的乳酸浓度表示发酵 54 小时为止的最高浓度。 0083 表 4 0084 0085 发酵试验的结果， 存在越将菌体增殖时的培养基的 pH 控制为低值， 最高乳酸浓度 越提高的倾向。

48、。该效果即使在 pH4.5 中也能确认， pH3.0 时的效果最高。 0086 比较例 1 0087 本比较例中， 除了使用用无机酸代替有机酸而调整为低 pH 的培养基或添加了在 有机酸时具有效果的浓度为相同摩尔浓度的有机酸盐的培养基(未调整成低pH的培养基) 之外， 与实施例 1 同样地进行了发酵试验。即， 本比较例中， 作为无机酸将硫酸以成为 20mM 或 40mM 的方式进行添加， 测定 pH， 进而培养 5 小时。通过如此以硫酸调整为低 pH 的培养基 处理 PDC1p-LDH6 拷贝株。接着， 将发酵培养基 ( 浓度糖 12、 磷酸二氢钾 0.04、 硫酸镁 0.04、 碳酸钙 0.。

49、4 )20ml 加入容量 100ml 的烧瓶， 将上述菌体以浓度成为 4的方式进 行接种， 在 120rpm/ 分钟 ( 振幅 35mm)、 34下进行发酵， 探讨了乳酸的生产量。其中， 在发 酵 16 小时的时间点上， 由于全部的处理区糖全被消费、 或即使存在残留糖的处理区中乳酸 浓度也开始减少， 所以结束了发酵试验。乳酸的测定使用了生物传感器 BF-4 以及 BF-5( 王 子计测机器 )。结果示于表 5。 0088 表 5 0089 0090 比较表 1 和表 5， 则使用以有机酸调整为低 pH 的培养基进行处理时乳酸的生产率 提高， 与此相对， 使用以无机酸调整为低 pH 的培养基、 含有机酸盐的未降低 pH 的培养基进 行处理时乳酸的生产率下降。 从本比较例可明确， 对于生产有机酸的酵母， 通过以调整为低 pH 的含有有机酸的培养基进行处理而提高了该酵母的有机酸生产能力。 0091 本说明书中引用的所有的出版物、 专利以及专利申请将被视为原样参考而引入本 说明书。 说 明 书 CN 102076863 A CN 102076870 A1/2 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 102076863 A CN 102076870 A2/2 页 13 序 列 表 CN 102076863 A CN。