技术领域：本发明涉及化学领域化合物的分离提取方法，具体的涉及植物天然 生理活性物质龙胆苦甙的制备方法。
背景技术：龙胆苦甙(gentiopicroside)属于植物中天然存在的裂环环烯醚萜 甙类化合物，具有多方面的生理活性，例如：保肝利胆、健胄、促进肠胃消化功能 (CN 1191132A)、抗氧化、抗炎、抗菌、升高血糖、以及对中枢神经系统的作用， 是我国传统中药材龙胆、秦艽、当药、獐芽菜等及其制成的中成药的主要有效成分。 龙胆苦甙为水溶性的配糖体类化合物，极性大，具有吸湿性，不稳定，分离纯化困 难，迄今没有工业化批量生产的制备工艺。
发明内容：鉴于龙胆苦甙为具有生理活性和医疗价值的植物天然产物，本发明 旨在提供一种低成本、高纯度、无污染、制备过程简单易行、生产周期短、适宜批 量制备和工业化生产的龙胆苦甙制备方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
龙胆苦甙的制备方法，取龙胆属植物和獐芽菜属植物中的任何一种含有龙胆苦 甙的植物，烘干、粉碎，用乙醇或甲醇加热回流提取，经过滤、浓缩、干燥得醇提 取物，然后经聚苯乙烯型的大孔吸附树脂进行柱层析分离，提取物与大孔吸附树脂 的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶15-20，在薄层层析的检测指导下，用不同浓 度的含水乙醇或甲醇进行梯度洗脱，收集含龙胆苦甙的洗脱液，减压浓缩，洗脱物 经弱碱型大孔阴离子交换树脂进行柱层析纯化，提取物与离子交换树脂的重量比为 1∶8-15，柱径高比为1∶10-15，再用乙醇或甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥， 得龙胆苦甙。
其中龙胆属植物选自坚龙胆(G.rigescens Franch.ex.Hemsl)、条叶龙胆 (G.manshurica Kirg)、龙胆(G.scabra Bunge)、三花龙胆(G.triflora Pall)、秦 艽(G.macrophylla Pall)、粗茎秦艽(G.crassicaulis)、麻花秦艽(G.straminea Maxim)、小秦艽(G.dahurica Fisch)；獐芽菜属植物选自川西獐芽菜(S.davidi Franch)、金沙獐芽菜(S.patens)、西南獐芽菜(S.cincta)、祁连獐芽菜 (S.przewalskii)、四数獐芽菜(S.tetraptera)、抱茎獐芽菜(S.franchetiana)等。
上述技术方案中用于柱层析分离的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树 脂。如：Diaion，XAD-2，XAD-4，D-101，KB-8等。提取物与大孔吸附树脂的重 量比为1∶8-15，柱径高比为1∶15-20。以含水低级醇梯度洗脱。
上述技术方案中用于柱层析纯化的弱碱型大孔阴离子交换树脂，包括不同厂 家生产的所有弱碱型大孔阴离子交换树脂的产品型号与规格，如：D900，Diaion， WA20，Amberlite IRA-93等。提取物与离子交换树脂的重量比为1∶8-15，柱径 高比为1∶10-15。
上述技术方案中用于检测和指导柱层析分离的薄层层析法是以7∶3∶0.5 的氯仿-甲醇-水为展开剂，10％硫酸乙醇液为显色剂。
上述技术方案中龙胆苦甙的干燥方法可采用加热干燥、冷冻干燥或喷雾干 燥。
上述技术方案中龙胆苦甙的纯度检测应用高压液相色谱法进行。
经过上述制备工艺分离得到的龙胆苦甙收率高，纯度大于95％，无有机溶剂 的残留，可直接用作为制药的天然原料或作为标准对照品使用。
本发明制备龙胆苦甙的具体步骤如下：
(1)植物原料去杂、洗净、烘干、粉碎成粗粉(过20-40目筛)。
(2)将该植物原料粗粉用工业乙醇(或甲醇)加热回流提取3次，每次提 取时间为2小时，过滤、减压浓缩，回收溶剂，干燥，得醇提取物。
(3)用少量水将醇提取物溶解，过滤，缓缓倾入大孔吸附树脂(如：Diaion， XAD-2，XAD-4，D-101，KB-8等)层析柱的上端。醇提取物与大孔吸附树脂的重 量比为1∶8-15，柱径高比为1∶15-20。以不同浓度的醇梯度洗脱，同时用薄层 层析法检测指导洗脱。薄层层析的条件为：氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)为展开 剂，10％硫酸乙醇液为显色剂。富集含有龙胆苦甙的洗脱液，合并。
(4)将富集龙胆苦甙的洗脱液缓缓倾入弱碱型大孔阴离子交换树脂(如 D900，Diaion，WA20，Amberlite IRA-93)层析柱的上端，提取物与离子交换树脂 的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10-15。用50％的低级醇洗脱，收集洗脱液。
(5)将上述洗脱液减压浓缩，干燥，得到淡黄色粉末，即为龙胆苦甙。
(6)龙胆苦甙的干燥方法除加热干燥法，也可采用冷冻干燥或喷雾干燥。
(7)龙胆苦甙的高压液相色谱(HPLC)定量分析按以下的方法进行：
仪器与试剂：HPLC仪器为Alliance高效液相色谱仪，自动进样器，PDA二 级管阵列可变波长检测器。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余溶剂均为分析纯。
色谱条件及检测波长的选择：用十八烷基硅胶为填充剂(如：Agilent ZORBAX C18酸性柱，4.6×150mm)；乙腈∶水(0.2％醋酸)(5∶95至90∶10，线 形梯度)为流动相；柱温：40℃；流速：1ml/min；波长：254nm。
实验材料：精密称取龙胆苦苷1mg，加1ml甲醇充分振荡溶解后，即得对 照品溶液。
色谱条件与系统适用性试验：
1.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(0.2％醋酸)溶液(5-90％， 60min)为流动相；检测波长为254nm。柱温：40℃。理论板数按龙胆苦甙峰计算 应不低于10000。
2.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(0.2％醋酸)溶液(0-95％， 30min)为流动相；检测波长为254nm。柱温：40℃。理论板数按龙胆苦甙峰计 算应不低于10000。
3.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-水(0.2％醋酸)溶液 (8-50％，20min)，线性梯度洗脱；检测波长为254nm。柱温：40℃。理论板数按 龙胆苦甙峰计算应不低于10000。
系统精密度考察：以龙胆苦甙峰面积为指标，RSD为0.1％，系统精密度良 好。(表1)
重现性考察：以龙胆苦甙峰面积为指标，RSD为1.9％，重现性良好(表2)。
稳定性考察：以龙胆苦甙峰面积为指标，考察24小时，RSD为0.2％，龙 胆苦甙稳定性良好(表3)。
含量测定：由上述工艺制备的龙胆苦甙的含量为95％以上。
与现有技术相比，本发明的方法具有下述的优点：
1、本发明以龙胆科龙胆属和獐芽菜属植物的任何一种含龙胆苦甙的植物为 原料制备龙胆苦甙。
2、按本发明的技术方案生产制备的龙胆苦甙收率高，产品的纯度大于95％， 无有机溶剂的残留，可直接作为制药工业的天然原料。
表1 系统精密度考察 Area Conc. 15031283 15049102 15039097 15058864 14999074 97.4538 97.4768 97.4272 97.4304 97.4591
表2 重现性实验数据 Area Conc. 22566912 22014550 23212769 22120313 22463263 97.4209 97.4518 97.4272 97.4440 97.2591
表3 稳定性实验数据 Area Conc. 15160140 15131307 15165983 15099077 15124949 97.0989 97.1034 97.0987 97.0776 97.0844
3、本发明使用的柱层析填充剂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂和弱碱型大孔离 子交换树脂填充剂材料可以重复使用。
4、本发明仅使用低级醇和水提取分离龙胆苦甙，操作简便易行，生产成本 低。如选择乙醇进行生产，则无毒，无三废污染。
具体实施方式：
下面以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容 并不局限于此。
实施例1：从中药材坚龙胆(G.rigescens Franch.ex.Hemsl)中制备龙胆苦 甙。
(1)坚龙胆原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。
(2)坚龙胆粗粉5kg用工业乙醇加热回流提取3次，每次提取时间2小时， 过滤、合并滤液、减压浓缩、回收溶剂、干燥，得坚龙胆乙醇提取物。回收溶剂 可用于反复提取。
(3)用少量水将乙醇提取物溶解，缓缓倾入D101大孔吸附树脂层析柱的 上端，乙醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶15-20，以 不同浓度的乙醇梯度洗脱。同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件 为氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)为展开剂，10％硫酸乙醇液为显色剂。收集含有龙胆苦 甙的洗脱液。
(4)将富集龙胆苦甙的洗脱液缓缓倾入离子交换树脂层析柱的上端，用50％ 乙醇洗脱，收集洗脱液。
(5)合并上述乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到的淡黄色粉末180g， 即为龙胆苦甙，得率为3.6％。
(6)应用HPLC定量分析方法，对分离制备得到的龙胆苦甙进行纯度检测， 含量为95％以上。
实施例2：从中药材龙胆(G.scabra Bunge)中提取制备龙胆苦甙
(1)龙胆原料清杂、洗净、烘干、粉碎成粗粉。
(2)将龙胆粗粉2kg，工业甲醇加热回流提取3次，每次提取时间为2小 时，然后经过滤、浓缩、干燥，得龙胆甲醇提取物。
(3)用少量水将甲醇提取物溶解，缓缓倾入D101大孔吸附树脂层析柱的 上端，甲醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶15-20， 以不同浓度的乙醇梯度洗脱。同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条 件为：氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)为展开剂，10％硫酸乙醇液为显色剂。收集含有龙 胆苦甙的洗脱液。
(4)将富集龙胆苦甙的洗脱液缓缓倾入离子交换树脂层析柱的上端，用 50％甲醇洗脱，收集洗脱液。
(5)将50％甲醇洗脱液浓缩，喷雾干燥，得到的淡黄色粉末85g。即为龙 胆苦甙，得率为4.25％。
应用HPLC定量分析方法，对分离制备得到的龙胆苦甙进行纯度检测。含量 为95％以上。
由上述工艺制备的龙胆苦甙的物理常数和光谱数据：
分子式：C16H20O9
分子量：356
结构式：
性状：淡黄色粉末；易溶于甲醇、乙醇、水。
红外光谱νmax(KBr)：3500，2900，1710，1619cm-1
紫外光谱λmax(EtOH)：268，252，244nm
质谱(FAB--MS)：355[M-H]-
1H NMR谱(CD3OD，125MHz)δ：5.66(1H，d，J＝2.5Hz，H-1)，7.46(1H，s， H-3)，5.75(m，H-6)，5.05(m，H-7)，5.70(1H，m，H-8)，3.72(m，H-9)，5.21(m，H-10)， 4.64(1H，d，J＝8.6Hz，glu-1′)。
13C NMR谱(CD3OD，125MHz)δ：98.5(d，C-1)，150.7(d，C-3)，104.7(s，C-4)， 126.5(s，C-5)，117.4(d，C-6)，71.0(t，C-7)，134.6(d，C-8)，46.3(d，C-9)，118.8(t， C-10)，166.8(s，C-11)；glu 104.7(d，C-1)，74.2(d，C-2)，78.0(d，C-3)，71.2(d，C-4)， 77.5(d，C-5)，62.4(t，C-6)。