《橡实粉发酵生产乳酸的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《橡实粉发酵生产乳酸的方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 102051385 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 102051385 B *CN102051385B* (21)申请号 200910188146.2 (22)申请日 2009.10.27 CGMCC No.3269 2009.09.11 C12P 7/56(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (73)专利权人 中国石油化工股份有限公司 地址 100728 北京市朝阳区朝阳门北大街 22 号 专利权人 中国石油化工股份有限公司抚顺 石油化工研究院 (7。
2、2)发明人 高大成 张霖 佟明友 黎元生 袁毅 (74)专利代理机构 抚顺宏达专利代理有限责任 公司 21102 代理人 李微 CN 1137530 A,1996.12.11, 全文 . 何健 . 板栗汁乳酸发酵的研究 .郑州工程 学院学报 .2002, 第 23 卷 ( 第 2 期 ),59 61. Zhengdong Lu et al.Fermentative production of L(+)-lactic acid using hydrolyzed acorn starch,persimmon juice and wheat bran hydrolysate as nutrients。
3、. Bioresource Technology .2010, 第 101 卷 3642 3648. (54) 发明名称 橡实粉发酵生产乳酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用橡实粉发酵生产乳酸 的方法。以具有一定目数及较低单宁含量的橡实 粉作为碳源， 经淀粉酶及糖化酶共同酶解糖化后， 用于乳酸发酵生产。 与现有技术相比， 本发明方法 以非粮的橡实资源为原料， 降低了生产成本， 具有 较高的经济效益， 并且该方法提高了橡实资源的 利用率， 有很好的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 苗荻 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 。
4、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种利用橡实粉发酵生产乳酸的方法， 包括以下步骤 ： (1) 取橡实粉添加水配比为 1 2 1 9， 加入淀粉酶 20 40U/g 橡实粉， 在 50 110液化 1 2h， 然后加入糖化酶 80 200U/g 橡实粉， 30 60保温 1 4h， 进行预糖 化处理 ； 其中所述的橡实粉中单宁含量小于等于 0.5wt ； (2) 当步骤 (1) 中葡萄糖浓度达到 20g/L 70g/L 时， 接入培养好的微生物种子培养 液， 接种量为520， 同时加入中和剂， 调节系。
5、统pH值为4.56.5， 所述中和剂为碱土 金属氢氧化物和/或碱土金属碳酸盐、 或氨水， 搅拌转数50300rpm， 发酵温度4050； 其中所述的微生物为干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)FY-04， CGMCC NO.3269。 2. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 在步骤 (2) 的发酵过程中通入空气， 空气 体积空速为 2.0h-1 60.0h-1。 3. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述中和剂的加入方式为一次性加入、 分 批加入或流加加入。 4.按照权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述橡实粉的目数为30200 目。。
6、 5.按照权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述橡实粉的目数为60150 目。 6. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (2) 中所述的微生物种子培养液为 MRS 培养基培养的对数期菌体培养液。 7.按照权利要求2所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中在发酵菌种对数生长期间或发 酵全程通入空气。 权 利 要 求 书 CN 102051385 B 2 1/4 页 3 橡实粉发酵生产乳酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种非粮淀粉资源的加工利用方法， 特别是以橡实资源为原料发酵生 产乳酸的方法。 背景技术 0002 乳酸， 是世界上应用广泛的三大有机酸之一。
7、， 学名 - 羟基丙酸， 又名丙醇酸， 分 子式为C2H5OCOOH， 其分子结构中含有一个不对称碳原子， 因此具有旋光性， 按其构型及旋光 性可分为L-乳酸、 D-乳酸和DL-乳酸三类。 乳酸作为一种重要的有机酸， 广泛应用于食品、 医药、 印染、 日化、 皮革以及化学工业中。 随着生物技术的广泛应用， 乳酸主要以微生物发酵 法生产， 工业发酵生产乳酸主要采用细菌类菌种发酵和霉菌类菌种发酵两种模式， 其生物 发酵工艺已相对成熟。 0003 用于乳酸发酵生产的工程菌通常可以利用碳水化合物作为碳源， 因此糖及淀粉类 物质作为碳源被广泛应用于乳酸发酵生产中。CN02136166.5 公开了采用淀粉。
8、质材料 ( 玉 米、 大米、 小麦等 ) 发酵法生产 L- 乳酸的技术。由于粮食资源有限， 因此低品位原料的开 发应用成为目前研究的热点， CN200510057160.0 公开了采用淀粉含量较高的农副产品， 如 ： 大米、 薯干、 山芋、 玉米、 米糠等等为原料， 通过糊化、 糖化、 接种、 发酵、 过滤、 浓缩等工 序生产乳酸的方法， CN200580016164.2 公开了一种以可再生农业原料 ( 糖渣、 甘蔗水解产 物、 玉米浆、 甜菜或甘蔗汁 ) 发酵生产乳酸及聚乳酸的方法。上述这些原料或者是潜在的 粮食作物， 或者是农副产品的分离产物， 因此在资源量上很难保证工业上的可持续利用。 。
9、CN200610112967.4公开了一种以纤维素类生物质的热解产物1， 6-脱水-D-吡喃葡萄糖 发酵生产乳酸的方法。虽然纤维素类生物质资源是地球上数量最丰富的可再生资源， 通过 水解或热解糖化可以提供可发酵用糖， 但是由于木质纤维素物质如农作物秸秆等， 比较难 被利用， 需要进行包括预处理， 脱毒等繁琐的工序， 到目前为止其生产成本远远超过以粮食 作物生产乳酸的成本， 因此不具有经济上的竞争力。 0004 橡实是壳斗科 Fagaceae 植物籽实的统称。橡实含有淀粉、 单宁以及蛋白质、 脂肪、 纤维素、 矿质、 维生素和色素等成分， 其中淀粉含量高达 50 68。我国橡实资源十分丰 富， 。
10、我国约有橡实林 1.33107 1.67107公顷， 年产橡实 600 700 万吨， 主要分布于东 北、 华北、 及陕西、 宁夏、 甘肃、 青海、 山东、 四川等地。 国内从橡实中提取淀粉， 制作橡实粉的 技术在不断完善， 有关专利 CN92106312.1、 CN94110375.7、 CN96103688.5 均在不同方面对 从橡实中提取高纯度淀粉的方法进行了改进。虽然橡实制备淀粉的工艺相对成熟， 但橡实 粉还没有得到广泛的应用， 目前橡实粉主要应用于制作牲畜饲料及精制食用淀粉， 极少应 用于微生物发酵中。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种以橡实粉为原料生产乳酸的发酵方法， 一。
11、方面可以使发 酵法生产乳酸在原料上多了一种选择， 另一方面可以使橡实资源得以充分利用。 说 明 书 CN 102051385 B 3 2/4 页 4 0006 本发明以橡实粉为原料发酵生产乳酸的方法， 包括以下步骤 ： 0007 (1) 橡实粉的酶解和预糖化 ： 取橡实粉添加水配比为 1 2 1 9， 加入淀粉酶 20 40U/g 橡实粉， 在 50 110液化 1 2h， 然后加入糖化酶 80 200U/g 橡实粉， 在 30 60保温 1 4h， 进行预糖化处理 ； 0008 (2)当步骤(1)中葡萄糖浓度达到20g/L70g/L时， 接入培养好的微生物种子培 养液， 同时加入中和剂， 接。
12、种量为 5 20 (v/v)， 搅拌转数 50 300rpm， 发酵温度 30 50。 0009 根据本发明的发酵方法， 步骤 (1) 所采用的橡实粉原料单宁含量小于 5.0wt， 优 选小于 1.0wt， 更优选小于 0.5wt。橡实粉的目数为 30 200 目， 优选为 60 150 目， 更优选为 80 120 目。 0010 在步骤 (1) 中加入适量淀粉酶后， 还可加入适量脱支淀粉酶， 脱支酶的用量为 0.10U/g 10.0U/g 橡实粉。 0011 步骤 (2) 中在加入糖化酶后， 在 1 4h 内即葡萄糖浓度达到 20g/L 70g/L 时接 种发酵菌种子液， 所接入的微生物种。
13、子培养液为 MRS 培养基培养的对数期菌体培养液。 0012 步骤 (2) 中加入中和剂后调节系统 pH 值为 4.5 6.5， 发酵 24 72h。所述的中 和剂为碱土金属氢氧化物和 / 或碱土金属碳酸盐、 或氨水， 中和剂的加入方式为一次性加 入、 分批加入或流加加入。 0013 根据本发明的方法， 所制备的乳酸及其盐的对映体纯度为 50 100。 0014 所述的微生物为厌氧微生物或者兼性厌氧微生物。 所述的厌氧微生物可以选自现 有常规的厌氧乳杆菌、 链球菌和芽孢杆菌属的一种或几种。所述的兼性厌氧微生物优选干 酪乳杆菌Lactobacillus casei FY-04， CGMCC NO。
14、.3269。 所述的干酪乳杆菌Lactobacillus casei FY-04 是抚顺石油化工研究院筛选培养的一种兼性厌氧菌， 其保藏号为 CGMCC NO.3269， 具有如下性质 ： 0015 (1) 形态特征 ： 杆状细菌， 不运动， 无芽孢， 常排列为短链 ； 0016 (2) 生理特征 ： 过氧化氢酶阴性， 乳酸消旋酶阴性， 格兰氏染色显阴性， 兼性好氧。 0017 本发明方法优选采用兼性厌氧微生物作为发酵菌种， 并在发酵过程中通入空气， 可选择发酵菌种对数生长期间通入空气， 或发酵全程通入空气， 空气体积空速为 2.0h-1 60.0h-1。 0018 与现有技术相比较， 本发明。
15、方法具有如下特点 ： 0019 本发明方法以橡实粉为原料进行乳酸的发酵生产， 既将橡实粉应用于乳酸发酵生 产中， 使橡实资源得到了充分利用， 创造可了观的经济效益 ； 又利用了橡实为非粮食作物的 特点， 为解决生产原料与人争粮的矛盾进行了有益的尝试。 0020 本发明方法在发酵过程中， 采用并行发酵模式。将橡实粉的糖化过程与菌种发酵 同时进行， 或可选择将橡实粉加入淀粉酶及糖化酶后保温 1 4h， 进行预糖化， 当葡萄糖浓 度达到一定范围时， 再加入发酵菌液进行并行发酵。在预糖化过程中橡实粉并没有完全糖 化， 加入发酵菌液后， 在橡实粉不断被糖化的同时， 糖化出的单糖不断被乳酸菌利用发酵生 产。
16、乳酸， 是一个动态连续的过程。 由于在发酵过程中采用了并行发酵模式， 所以简化了乳酸 的生产过程， 提高了乳酸的生产效率。 0021 本发明方法选择兼性厌氧微生物作为发酵菌种时， 利用发酵微生物的兼性厌氧特 说 明 书 CN 102051385 B 4 3/4 页 5 性， 在发酵过程中通入空气， 一方面有利于菌体生长， 增加菌种浓度 ； 另一方面通过空气流 动带走发酵过程中产生的CO2， 确保发酵体系中pH值的稳定有利于菌种生长， 与现有技术厌 氧菌种 ( 需要向发酵体系中通入惰性气体如氮气置换氧气 ) 发酵工艺相比 pH 值更稳定， 产 酸效率高。 附图说明 0022 图 1 为本发明实施。
17、例 1 用干酪乳杆菌发酵试验中， 糖和乳酸浓度随发酵时间变化 的情况， 该试验在发酵过程中全程未通入空气。 0023 图 2 为本发明实施例 2 用干酪乳杆菌发酵橡实粉试验中， 糖和乳酸浓度随发酵时 间变化的情况， 该试验在发酵前期通入空气 6h。 0024 图 3 为本发明实施例 3 用干酪乳杆菌发酵橡实粉试验中， 糖和乳酸浓度随发酵时 间变化的情况， 该试验在发酵过程中全程通入空气。 0025 图 4 为本发明实施例 4 用干凝结芽孢杆菌发酵橡实粉试验中， 糖和乳酸浓度随发 酵时间变化的情况， 该发酵过程为厌氧。 具体实施方式 0026 下面通过具体实施例对本发明的方法作进一步说明。 00。
18、27 实施例 1 3 中使用的干酪乳杆菌为抚顺石油化工研究院筛选培养的 Lactobacillus casei FY-04 菌株， 现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心 (CGMCC) ； 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所 ； 保藏编号 ： CGMCC No.3269 ； 保藏日期 ： 2009 年 9 月 11 日。 0028 实施例 1 0029 干酪乳杆菌发酵试验 ( 发酵全程未通入空气 ) 0030 2kg 橡实粉 ( 橡实粉目数 100， 单宁含量 0.5wt ) 加入 7L 自来水， 加入轻质碳酸 钙 1kg， 2.0mL 高温淀粉酶 (400。
19、00U/mL)， 92液化 1h， 降温到 50， 加入 7.0mL 淀粉糖化酶 (30000U/mL)， 保温 3h， 测定葡萄糖浓度为 55g/L。 0031 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) 经 MRS 培养基培养至对数期， 取 1.2L 种子培 养液加入发酵罐。42， 100rpm， pH 值 5.0， 发酵 48h， 乳酸浓度达到最大值为 120g/L。 0032 实施例 2 0033 干酪乳杆菌发酵试验 ( 发酵前期通空气 ) 0034 2kg橡实粉(橡实粉目数100， 单宁含量0.5wt)加入7L自来水， 加入轻质碳酸钙 1kg， 豆粕粉 0.36kg， 2。
20、.0mL 高温淀粉酶 (40000U/mL)， 92液化 1h， 降温到 50， 加入 7.0mL 淀粉糖化酶 (30000U/mL)， 保温 3h， 测定葡萄糖浓度为 55g/L。 0035 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)经MRS培养基培养至对数期， 加入发酵罐。 接 种后通入空气， 体积空速为 15h-1， 维持 6h。42， 100rpm， pH 值 5.0， 共发酵 48h， 乳酸浓度 达到最大值为 125g/L。 0036 实施例 3 0037 干酪乳杆菌发酵试验 ( 发酵全程通空气 ) 0038 2kg 橡实粉 ( 橡实粉目数 100， 单宁含量 0.5wt 。
21、) 加入 7L 自来水， 加入轻质碳酸 说 明 书 CN 102051385 B 5 4/4 页 6 钙 1kg， 2.0mL 高温淀粉酶 (40000U/mL)， 92液化 1h， 降温到 50， 加入 7.0mL 淀粉糖化酶 (30000U/mL)， 保温 3h， 测定葡萄糖浓度为 55g/L。 0039 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) 经 MRS 培养基培养至对数期， 取 1.2L 种子培 养液加入发酵罐。接种后通入空气， 体积空速为 15h-1， 42， 100rpm， pH 值 5.0， 发酵 48h， 乳 酸浓度达到最大值为 125g/L。 0040 实施例。
22、 4 0041 凝结芽孢杆菌发酵试验 ( 发酵过程中未通入空气 ) 0042 凝结芽孢杆菌 ( 厌氧菌 ) 抚顺石油化工研究院筛选并保藏。 0043 2kg 橡实粉 ( 橡实粉目数 100， 单宁含量 0.5 ) 加入 7L 自来水， 加入轻质碳酸 钙 1kg， 2.0mL 高温淀粉酶 (40000U/mL)， 92液化 1h， 降温到 50， 加入 3.0mL 淀粉糖化酶 (30000U/mL)， 保温 3h， 测定葡萄糖浓度为 55g/L。 0044 凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans) 经 MRS 培养基培养至对数期， 加入发酵罐。 50， 100rpm， 发酵 48h。
23、 时乳酸浓度达到 110g/L， 发酵 56h 时乳酸浓度达到最大值为 113g/ L。 0045 通过实施例14可以看出 ： 橡实粉经过糖化得到的糖含量较高， 可以保证发酵过 程中的碳源供应。 0046 通过实施例 1 4 可以看出 ： 应用所选择的橡实粉， 进行发酵生产乳酸过程中， 微 生物对这种具有较低单宁含量的橡实粉有较高的耐受能力。因此， 这种具有一定目数及较 低单宁含量的橡实粉完全可以应用于发酵生产中。 0047 通过实施例14可以看出 ： 采用兼性厌氧微生物作为发酵菌种时， 在发酵的过程 中通入空气， 可使得乳酸的生产速度明显加快， 从而提高了转化效率， 因此在发酵中增加通 气环节， 适用于兼性厌氧菌发酵生产 L- 乳酸的过程。 说 明 书 CN 102051385 B 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102051385 B 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102051385 B 8 。