一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103614409 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103614409 A (21)申请号 201310412096.8 (22)申请日 2013.09.11 C12N 15/75(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 辽宁大学 地址 110000 辽宁省沈阳市沈北新区道义南 大街 58 号 (72)发明人 王秋雨 金莉莉 王宇 王铮 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 金春华 (54) 发明名称 一种大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达 体系的构建 (57) 摘要 本发明。

2、涉及一种大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿 梭诱导表达体系的构建。采用的技术方案是 ： (1) PCR 扩增 GST 标签蛋白序列、 SacR 调控序列以及 目的蛋白序列 ； (2)PCR产物与载体pHY300-PLK连 接， 构建重组质粒 ； (3) 重组质粒转化枯草芽孢杆 菌 WB600， 蔗糖诱导蛋白表达， 得到融合蛋白。本 发明通过 PCR 扩增、 酶切、 连接、 转化和筛选， 证实 未加蔗糖诱导之前， 仅有极低的痕量融合蛋白表 达， 诱导后 32 小时得到高效表达的融合蛋白， 该 融合蛋白通过对目的蛋白的抑菌效果检测以及针 对GST标签蛋白的Western-Blot检测实验确定两 种蛋白正。

3、确融合与表达。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图8页 (10)申请公布号 CN 103614409 A CN 103614409 A 1/1 页 2 1. 一种大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建， 其特征在于方法如下 ： 1） SacR 调控序列的制备 ： 提取枯草芽孢杆菌基因组 ； 根据 NCBI 公布的 SacB 序列， 以 提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板， 设计上下游引物 pS1 及 pS2， 在两端分别添加 Xb。

4、a I 和 Nde I 酶切位点， PCR 扩增获得 SacR 调控序列 ； 所述的上游引物 pS1 的序列为 GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC ； 所述的下游引物 pS2 的序列为 GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG ； 2） 制备 GST 标签蛋白序列 ； 3） 获得目的蛋白序列 ； 4） 各元件的连接以及与载体的连接 ： 连接经 Quick Cut Nde I 内切酶处理的 SacR 片 段与 GST 片段， 得到 SG 序列， 经 Quick Cut Vsp I 酶切后与同样经 Quick Cut Vsp I 酶酶 切的目的蛋白序列片。

5、段进行连接， 得到重组序列 ； 将重组序列和提取质粒 pHY300-PLK 分别 经 Quick Cut Hind III 和 Quick Cut Xba I 双酶切后连接， 得到重组质粒 ； 5） 重组质粒的转化 ： 将重组质粒转入枯草芽孢杆菌 WB600 感受态细胞中 ； 6） 目的蛋白在枯草芽孢杆菌 WB600 中的诱导表达 ： 选取 5） 步获得的阳性转化子接种 于含有 Tetracycline 的 LB 液体培养基中， 37、 200rpm 活化 2h， 之后以 1% 接种量接种于 含有Tetracycline的LB液体培养基中， 37、 180rpm震荡3h， 12000rpm离心。

6、10min后取上 清液， 上清液中加入 20% 蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为 2%， 持续诱导 48h， 12000rpm 离心 10min， 取上清， 得融合多肽。 2. 如权利要求 1 所述的一种大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建， 其特 征在于步骤 1） 中所述的枯草芽孢杆菌基因组是枯草芽孢杆菌 WB600 基因组。 权 利 要 求 书 CN 103614409 A 2 1/8 页 3 一种大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建 技术领域 0001 本发明涉及大肠 - 枯草穿梭诱导载体的构建和转化及表达。 背景技术 0002 近些年来， 枯草芽孢杆菌基因组的成功测。

7、序催化了枯草芽孢杆菌作为外源蛋白分 泌载体的研究， 成绩斐然。 基于全基因组的测定， 使得通过信号肽预测软件经生物信息学分 析识别信号肽并确认分泌蛋白成为可能。 结合信号肽预测结果以及已知的分泌蛋白基因结 构， 将有可能构建一个新的分泌蛋白组 (Secretome)， 其中包含各种已知的及未知的分泌蛋 白信息。通过此种方法， 预测得到的枯草芽孢杆菌蛋白质组中已含有 4107 种蛋白， 即占总 蛋白 25% 的蛋白序列含有膜定位信号。 0003 枯草芽孢杆菌表达系统的优点是 ：（1） 能将蛋白表达产物高效分泌培养基中， 在 多数情况下， 经芽孢杆菌分泌后真核生物的异源重组蛋白就是经过简单折叠的天。

8、然构并且 具备原有的生物活性 ；（2） 许多芽孢杆菌在传统发酵工业中已经有几十年的历史， 它们无 致病性而且不产生内毒素 ；（3） 芽孢杆菌的分子遗传背景清楚， 生长迅速， 培养条件简单。 但是由于膜定位能力的缺乏、 转移前折叠、 转移折叠缓慢、 低效转移以及错误折叠和蛋白酶 水解等因素， 外源蛋白的表达进展受限。 0004 外源蛋白的高效表达对于真核蛋白对枯草杆菌表达系统来说并不理想， 主要的影 响因素是外源蛋白与枯草杆菌的分泌元件不协调。 为了达到高表达水平和更广的表达范围 的目的， 须对其分泌机制进行完整且深入的研究， 并通过基因工程等手段加以解决。 这方面 已有成功的报告， 如吴青等构。

9、建的枯草杆菌诱导型高效 - 表达分泌系统， 在原有诱导系统 上添加正调控基因 degU 及 degQ， 获得了 296 倍表达的调控基因 sacB， 并使地衣杆菌 - 淀 粉酶的表达量达到原有的 140 倍。 0005 枯草芽孢杆菌所承载的质粒的结构和分离上的不稳定性直接影响该表达系统在 工业生产中的应用， 在大规模生产中， 质粒容易发生丢失或结构改变的情况， 对目的蛋白的 产率造成影响。 为了解决这一问题， 目前的研究方向集中于 ： 添加多个正调控基因并使用 诱导系统调控外源蛋白的表达 ； 采取整合表达的方式， 将外源基因整合到枯草芽孢杆菌 染色体， 以保证质粒的稳定性。 发明内容 0006。

10、 本发明目的在于构建一种使用无毒物质进行诱导的大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿 梭载体， 通过该载体进行蛋白的表达。 0007 1、 穿梭质粒的构建 0008 根据上述目的及载体的克隆位点， 利用引物设计软件 Primer Premier5 设计引 物， 扩增调控序列 SacR、 标签蛋白 GST 序列以及目的蛋白序列， 连接为重组序列后连入 pHY300-PLK 空载体， 构建重组质粒， 重组质粒转化入枯草芽孢杆菌 WB600 后提取质粒进行 双酶切鉴定并对载体进行测序验证。 说 明 书 CN 103614409 A 3 2/8 页 4 0009 2、 目的蛋白的表达 0010 使用枯草芽孢杆菌。

11、 WB600 进行蛋白表达检测， 得到融合蛋白。通过 SDS-PAGE 进 行初步验证并获得最优表达时间， 对表达产物进行目的蛋白的抑菌效果和 GST 标签蛋白的 Western-Blot 验证， 证实该载体能够正确表达融合蛋白。 0011 本发明采用的技术方案是 ： 一种大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构 建， 方法如下 ： 0012 1） SacR调控序列的制备 ： 提取枯草芽孢杆菌基因组 ； 根据NCBI公布的SacB序列， 以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板， 设计上下游引物 pS1 及 pS2， 在两端分别添加 Xba I 和 NdeI 酶切位点， PCR 扩增获得 Sac。

12、R 调控序列 ； 0013 所述的上游引物 pS1 的序列为 GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC ； 0014 所述的下游引物 pS2 的序列为 GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG ； 0015 2） 制备 GST 标签蛋白序列 ； 0016 3） 获得目的蛋白序列 ； 0017 4） 各元件的连接以及与载体的连接 ： 连接经 Quick Cut Nde I 内切酶处理的 SacR 片段与 GST 片段， 得到 SG 序列， 经 Quick Cut Vsp I 酶切后与同样经该酶酶切的目的蛋白 序列片段进行连接， 得到重组序列 ； 将重组序列和。

13、提取质粒 pHY300-PLK 分别经 Quick Cut Hind III 和 Quick Cut Xba I 双酶切后连接， 得到重组质粒 ； 0018 5） 重组质粒的转化 ： 将重组质粒转入枯草芽孢杆菌 WB600 感受态细胞中 ； 0019 6） 目的蛋白在枯草芽孢杆菌 WB600 中的诱导表达 ： 选取 5） 步获得的阳性转化子 接种于含有 Tetracycline 的 LB 液体培养基中， 37、 200rpm 活化 2h， 之后以 1% 接种量接 种于Tetracycline的LB液体培养基中， 37、 180rpm震荡3h， 12000rpm离心10min后取上 清 液， 上。

14、清液中加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%， 持续诱导48h， 12000rpm离心 10min， 取上清液。 0020 本发明中， 步骤 1） 中所述的 SacR 序列对其后的蛋白表达起到受诱导的调控作用， 可控制蛋白是否表达， 在表达后自动切断与后续蛋白的连接 ； 步骤 2） 中所述的 GST 标签蛋 白序列与目的蛋白序列中间以肠激酶酶切位点连接， 在动物肠道中可以自行切割， 标签蛋 白在方便纯化的同时可以起到催化亲核性的谷胱甘肽与各种亲电子性的外源化学物质的 结合， 从而阻止它们与细胞生物大分子重要成分的共价结合， 起到解毒作用。 0021 本发明的有益效果是 ： 蔗糖诱导系统归属。

15、于枯草芽孢杆菌 Tat（twin-arginine translocation） 分泌途径， 与另一分泌途径 Sec （Secratory-type） 不同， 突破了 Sec 途径中 不能转移在细胞质中折叠完的蛋白以及外源蛋白转移至膜外折叠缓慢易被降解的瓶颈。 通 过蔗糖果聚糖酶 （Levansucrase） 的启动子 - 信号肽序列 （SacB p.s.,SacR） 的调控和引导， 可以使外源蛋白受控表达并分泌至胞外。本发明通过 PCR 扩增、 酶切、 连接、 转化和筛选， 证 实在添加诱导剂蔗糖之前， 只有极低的痕量融合蛋白得以表达， 蔗糖诱导 32 小时候得到最 高产量的融合蛋白。经抑菌。

16、对比试验证实目的蛋白的抑菌效果良好。 附图说明 0022 图 1 质粒 pHY300-PLK 结构图。 0023 图 2 琼脂糖凝胶电泳鉴定调控序列 SacR 的 PCR 结果。 说 明 书 CN 103614409 A 4 3/8 页 5 0024 图 3 琼脂糖凝胶电泳鉴定标签蛋白序列 GST 的 PCR 结果。 0025 图 4 琼脂糖凝胶电泳鉴定检测 AWRK6 序列的 PCR 结果。 0026 图 5 琼脂糖凝胶电泳鉴定元件拼接的 PCR 结果。 0027 图 6 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒 pHY300-PLK Hind III 单酶切结果。 0028 图 7 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒 。

17、pHYSGA Hind III/Xba I 双酶切结果。 0029 图 8 SacR 序列 pcr 产物测序部分结果。 0030 图 9 GST 标签序列 pcr 产物测序部分结果。 0031 图 10 AWRK6 序列测序部分结果。 0032 图 11 SGA 序列连接产物测序部分结果。 0033 图 12 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子 PCR 验证。 0034 图 13 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果。 0035 图 14 SDS-PAGE 鉴定 AWRK6 在枯草芽孢杆菌 WB600 中诱导表达结果。 0036 其中， M ： Premixed Protein Marker(Br。

18、oad) ； 1 ： 诱导前上清 ； 2 ： 诱导后 8h 上清 ； 3 ： 诱导后 16h 上清 ； 4 ： 诱导后 24h 上清 ； 5 ： 诱导后 32h 上清 ； 6 ： 诱导后 40h 上清 ； 7 ： 诱导后 48h 上清 ； 8 ： 菌体。 0037 图 15 Western-Blot 鉴定 AWRK6 在枯草芽孢杆菌 WB600 中诱导表达结果。 0038 1 ： 未诱导 ； 2 ： 诱导 8h 上清 ； 3 ： 诱导 16h 上清 ； 4 ： 诱导 24h 上清 ； 5 ： 诱导 32h 上清 ； 6 ： 诱导 40h 上清 ； 7 ： 诱导 48h 上清 ； 8 ： 菌体。。

19、 具体实施方式 0039 下面结合实施例进一步阐述。应当理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不是 限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook 等人的 分子克隆实验手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 下面实施例中蛋白质的表达以 抗菌肽 AWRK6 为例， 但是并不限制本发明， 任何想要表达的目的蛋白都可以按照下述方法 实现。 0040 实施例 1 大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建 0041 1.SacR 调。

20、控序列的制备 0042 (1) 枯草芽孢杆菌基因组提取 0043 以接种环沾取少量冻存的枯草芽孢杆菌 WB600， 于 20mL 固体 LB 培养基上划 线， 37过夜培养。次日挑取单菌落接种于 10mL 液体 LB 培养基， 37、 220rpm 震荡 2h， 分装保留 5mL 种子液， 其余全部加入 95mL 液体 LB 培养基中， 37、 180rpm 震荡 4h 至 OD600nm 1.2。依照说明书使用 Axygen 细菌基因组 DNA 小量制备试剂盒提取枯草芽孢杆 菌 WB600 的基因组。 0044 (2) 以 WB600 基因组为模板 PCR 获得 SacB 启动子和信号肽序列。

21、 0045 根据 NCBI 公布的 SacB 序列 ： 0046 1 GATCCTTTTT AACCCATCAC ATATACCTGC CGTTCACTAT TATTTAGTGA AATGAGATAT 0047 61 TATGATATTT TCTGAATTGT GATTAAAAAG GCAACTTTAT GCCCATGCAA CAGAAACTAT 0048 121 AAAAAATACA GAGAATGAAA AGAAACAGAT AGATTTTTTA GTTCTTTAGG CCCGTAGTCT 说 明 书 CN 103614409 A 5 4/8 页 6 0049 181 GCAAATCCTT。

22、 TTATGATTTT CTATCAAACA AAAGAGGAAA ATAGACCAGTCCAA 0050 241 ACGAGAGTCT AATAGAATGA GGTCGAAAAG TAAATCGCGC GGGTTTGTTA CTG 0051 301 CAAGACC TAAAATGTGT AAAGGGCAAA GTGTATACTT TGGCGTCACC CCTTACATAT 0052 361 TTTAGGTCTT TTTTTATTGT GCGTAACTAA CTTGCCATCT TCAAACAGGA GGGCTGGAAG 0053 421 AAGCAGACCG CTAACACAGT ACATA。

23、AAAAA GGAGACATGA ACGATGAACA TCAAAAAGTT 0054 481 TGCAAAACAA GCAACAGTAT TAACCTTTAC TACCGCACTG CTGGCAGGAG GCGCAACTCA 0055 541 AGCGTTTGCG AAAGAAACGA ACCAAAAGCC ATATAAGGAA ACATACGGCA TTTCCCATAT 0056 序列中以框线表示启动子元件， 阴影表示核糖体结合位点 （RBS） ， 下划线指示的是 蔗糖果聚糖酶的信号肽序列。以上述序列为模板， 设计上下游引物 pS1 及 pS2， 在两端分别 添加 Xba I， Nde I。

24、 酶切位点， 引物序列见表 1 ： 0057 表 1 0058 0059 以在 (1) 中得到的枯草芽孢杆菌 WB600 基因组为模板， 建立以下 PCR 体系 ： 0060 说 明 书 CN 103614409 A 6 5/8 页 7 0061 PCR 条件 ： 采用三步法， 98 10s， 55 15s， 72 40s， 共 30 循环后结束反应， 获得 SacR 调控序列。Axygen PCR Cleanup Kit 清洁反应产物并测序。SacR 调控序列 PCR 扩增 的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图 2 所示， 由图 2 可见片段大小符合 NCBI 数据库描述。SacR 序列 pcr 产物测。

25、序结果如图 8 所示， 从图 8 可见， 测序结果与目的序列完全符合。 0062 2.GST 标签蛋白序列的制备 0063 以接种环沾取少量冻存的大肠杆菌 BL21-GEX， 于 20mLAmpicillin 浓度 50g/ mL 的固体 LB 培养基上划线， 37过夜培养。次日挑取单菌落接种于 10mLAmpicillin 浓度 50g/mL液体LB培养基， 37、 180rpm震荡4h至OD600nm1.2。 依照说明书使用Axygen 质粒小量制备试剂盒提取质粒 pGEX-4T-2， 以其为模板进行 PCR， 体系如下 0064 0065 PCR 条件 ： 采用三步法， 98 10s， 。

26、55 15s， 72 50s， 共 30 循环后结束反应， 获得 GST标签蛋白序列。 Axygen PCR Cleanup Kit清洁反应产物并测序。 标签蛋白GST序列PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图 3 所示， 由图 3 可见片段大小符合 NCBI 数据库描述。GST 标签序列 pcr 产物测序结果如图 9 所示， 从图 9 可见测序结果与目的序列完全符合。 0066 3.AWRK6 序列的制备 0067 根据已知的 AWRK6 序列 （SWVGKHGKKFGLKKHKKH） ， 设计 6 条长引物 pA1-pA6（引物 pA1-pA6 的序列见表 1） 进行 PCR， 获得 AWR。

27、K6 序列。扩增后通过 Axygen PCR Cleanup Kit 说 明 书 CN 103614409 A 7 6/8 页 8 清洁反应产物并测序。AWRK6 序列的 PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图 4 所示， 从图 4 可 见片段大小符合预期。AWRK6 序列 pcr 产物测序结果如图 10 所示， 从图 10 可见测序结果与 目的序列完全符合。 0068 4. 各元件的连接以及与载体的连接 0069 依据 Takara DNA Ligation Kit Ver.2.1 说明， 连接经 Quick Cut Nde I 内切酶 处理的 SacR 片段与 GST 片段， 将 GST 片。

28、段去磷酸化后加入下列反应体系 ： 0070 0071 0072 16处理 30min 后将产物 SG 序列清洁回收， 经 Quick Cut Vsp I 酶切后与同样经 Quick CutVsp I 酶酶切的 AWRK6 序列片段进行连接， 体系如下 0073 0074 16处理 30min 后得到重组序列 SGA， 以 SGA 片段为模板， SacR 上游引物 PS1 及 AWRK6 下游引物 PA6 为模板， 扩增 SGA 序列， 反应体系如下 ： 0075 0076 PCR 条件 ： 采用三步法， 98 10s， 55 15s， 72 90s， 共 30 循环后结束反应， 获得 说 明 。

29、书 CN 103614409 A 8 7/8 页 9 重组序列 SGA。Axygen PCR Cleanup Kit 清洁反应产物并测序。SGA 序列 PCR 扩增的琼脂 糖凝胶电泳鉴定如图5所示， 从图5可见片段大小符合预期。 SGA序列连接产物测序结果如 图 11 所示， 从图 11 可见， 测序结果与目的序列完全符合。 0077 以 接 种 环 沾 取 少 量 冻 存 的 大 肠 杆 菌 JM109-HY，于 20mLAmpicillin 及 Tetracycline 浓度 50g/mL 的固体 LB 培养基上划线， 37过夜培养。次日挑取单菌落接 种于 10mL 同样抗生素浓度的液体 。

30、LB 培养基， 37、 180rpm 震荡 4h 至 OD600nm 1.2。依 照说明书使用 Axygen 质粒小量制备试剂盒提取质粒 pHY300-PLK。质粒 pHY300-PLK Hind III 单酶切结果的琼脂糖 凝胶电泳鉴定如图 6 所示， 从图 6 可见片段大小符合预期。 0078 将经过Quick Cut Hind III单酶切并切胶回收的pHY300-PLK质粒片段与测序后 的SGA片段分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I双酶切的片段使用In-Fusion HD Cloning Kit 进行克隆连接。体系如下 ： 0079 0080 反。

31、应条件 50 15min， 获得重组质粒 pHYSGA。琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒 pHYSGAHind III/Xba I 双酶切结果如图 7 所示， 从图 7 可见片段大小符合预期。 0081 5. 质粒的转化 0082 (1)取冻存的枯草芽孢杆菌WB600菌种于添加10L chloromycetin的20mLLB固 体培养基上划线， 37过夜培养。 0083 (2) 挑取单菌落在含有 25g/mL chloromycetin 的 5mLLB 液体培养基中进行活 化。 37、 180rpm培养4h后挑取活化菌种一环接入内含5mLGM1培养基的试管， 37、 200rpm 过夜培养。 008。

32、4 (3) 取 500L 过夜培养的菌液转接入 5mL 新的 GM1 培养基中， 37、 200rpm 培养 3h， 此时菌体生长达到对数期末期。 取0.75mL以GM1培养的菌液接入装有5mLGM2培养基的 试管， 37、 125pm 培养 1.5h， 5000rpm 离心 10min 收集菌体并用 mL 元培养液上清轻轻悬浮 菌体， 得到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞， 预留待用细胞后加30%灭菌甘油至终浓度10%， 混匀后每 0.5mL 菌液分装一管， -70冻存备用。 0085 (4) 将 5L 含有 80ng/L 重组质粒 pHYSGA 的溶液与 1mLWB600 感受态细胞轻轻 。

33、震荡混匀， 37、 120rpm 培养 0.5h， 提高震荡速度至 200rpm 继续培养 1.5h， 吸取 100L 菌 液涂布于含有 50ug/mL Tetracycline 的固体 LB 培养基上 37培养过夜。 0086 (5) 转化子验证 0087 以接菌环挑取少量转化子菌体稀释于0.04mL无菌水， 沸水浴5min后置于-20冰 箱中静置 5min， 于室温溶解后 12000rpm 离心 2min， 取 1L 上清液为模板， 使用引物 pS1、 pA6 为引物进行 PCR 验证。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子 PCR 验证结果如图 12 所示， 从 说 明 书 CN 10361440。

34、9 A 9 8/8 页 10 图 12 可见片段大小与预期 SGA 片段一致。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果如 图 13 所示， 从图 13 可见双酶切获得的两条片段大小符合预期。 0088 6.AWRK6 在枯草芽孢杆菌 WB600 中的诱导表达及检测 0089 (1) 诱导表达 0090 选取阳性转化子接种于 5mL 含有 50ug/mL Tetracycline 的 LB 液体培养基中， 37、 200rpm 活化 2h， 之后以 1% 量接种于 100mL 含 50ug/mL Tetracycline 的 LB 液体培养 基中， 37、 180rpm 震荡 3h， 取样并 12。

35、000rpm 离心 10min 后， 留少量上清及菌体用于检测， 其余通过旋涡混合器重悬并用相同的LB补全体积， 而后加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终 浓度为 2%， 持续诱导 48h， 并于诱导 8h、 16h、 24h、 32h、 40h、 48h 时分别取样， 12000rpm 离心 10min， 再分别保存上清和菌体。 0091 (2) 诱导结果 SDS-PAGE 检测 0092 取诱导表达前后不同时间段的菌液以及未诱导菌体各 10L， 加入等体积 2 上 样缓冲液混匀， 沸水浴5min， 冷却至室温吸取10L上样。 电泳仪设置80V待条带进入分离 胶后调高至100V电泳1.5h， 至。

36、指示条带电泳至高于分离胶下沿1cm时终止电泳。 将胶置于 考马斯亮蓝R250染色液中染色0.5h， 脱色至条带清晰并观察。 抗菌肽AWRK6在枯草芽孢杆 菌 WB600 中诱导表达的 SDS-PAGE 鉴定结果如图 14 所示， 从图 14 可见， 在 32h 的发酵液中 AWRK6 的条带最显著， 说明此刻浓度最高， 为最优表达时间。未诱导的菌液中有微量 AWRK6 存在， 为痕量表达。菌体中有相应条带存在， 为尚未分泌到菌液中的抗菌肽 AWRK6。 0093 (3) 诱导结果 Western Blot 鉴定 0094 依 (2) 步骤使用预染蛋白质分子质量标准 Prestained Pro。

37、tein Molecular Weight Marker 进行 SDS-PAGE 进行电泳， 取消染色步骤。将 0.22um 孔径的聚偏二氟乙烯 膜 （polyvinylidenefluoride） 放在去离子水中， 毛细作用去除气泡， 在转移缓冲液中平衡 15 分钟。采用半干法进行转膜， 以 1V/cm2膜的条件转膜 2h。取出膜后以 PBST 漂洗， 封闭液 于室温轻摇 1h。将膜用滤纸铁脚喜感， 正面朝下置于一抗稀释液中， 4静置过夜。而后勇 PBST 浸洗 3 次， 每次 10min。取出膜后正面向下置于二抗稀释液中室温轻摇 1h。再次使用 PBST 漂洗后浸洗 3 次， 每次 10m。

38、in。 0095 依据辣根过氧化物酶 HRP-ECL 发光法， 混合发光液 A、 B 备用。将膜用去离子水漂 洗并吸干后加上发光混合液覆盖， 熄灯至可见绿色荧光后吸干并与暗盒中盖加胶片曝光。 曝光15s 后立即放入显影液中1min， 去离子清洗， 置于定影液中并再次清洗晾干。 AWRK6在 枯草芽孢杆菌 WB600 中诱导表达的 Western-Blot 鉴定结果如图 15 所示， 从图 15 可见， 在 诱导后标签蛋白GST及抗菌肽AWRK6得以成功表达， 而未诱导的菌液中只有痕量存在， 说明 诱导调控系统有效控制了蛋白的表达， 避免了对宿主菌有杀伤作用的蛋白的毒害， 同时能 够使得在菌体最。

39、优生长阶段表达蛋白成为可能， 从而获得较高蛋白表达量。 说 明 书 CN 103614409 A 10 1/1 页 11 0001 序 列 表 CN 103614409 A 11 1/8 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 12 2/8 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 13 3/8 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 14 4/8 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 15 5/8 页 16 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 16 6/8 页 17 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 17 7/8 页 18 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 18 8/8 页 19 图 15 说 明 书 附 图 CN 103614409 A 19 。