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1、(10)申请公布号 CN 102051398 A (43)申请公布日 2011.05.11 CN 102051398 A *CN102051398A* (21)申请号 200910154494.8 (22)申请日 2009.10.29 C12P 21/06(2006.01) (71)申请人 浙江海洋学院 地址 316004 浙江省舟山市定海区气象台路 51 号浙江海洋学院食品与药学学院、 医学院 (72)发明人 宋茹 韦荣编 (74)专利代理机构 宁波诚源专利事务所有限公 司 33102 代理人 袁忠卫 (54) 发明名称 一种黄鲫蛋白抗菌肽的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种黄鲫蛋白抗。
2、菌肽的制备方 法， 将鱼肉匀浆制成鱼肉糜， 在保持 pH 值 1.5 2.5 的条件下加入 1000 1300U/g 鱼肉糜的胃 蛋白酶， 升温至 35 45酶解 2 3 小时， 再将 酶解液 95 100加热 5 15min 灭酶， 冷却至 3 5， 6000-8000r/min 离心处理 5 15 分钟， 过滤， 取中间滤液至少在 -20以下冻藏或冻干 保藏。本发明是以纯天然的海产低值鱼黄鲫为原 料来制备抗菌肽， 黄鲫蛋白抗菌肽富含人体必需 氨基酸， 理化性能稳定， 以食物源蛋白酶解所得的 抗菌肽安全性高、 吸收性好、 抑菌效果好， 可以在 食品中作为营养和功能型添加剂或开发为耐药菌 抗生。
3、素， 本制备方法简单、 经济、 易于操作， 可以在 普通实验室进行， 也适用于工业化扩大生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 CN 102051404 A1/1 页 2 1. 一种黄鲫蛋白抗菌肽的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1) 将黄鲫鱼肉洗净切小块， 用组织捣碎机搅碎均匀， 制成鱼肉糜， 按照鱼肉糜质量的 3 5 倍比例加入去离子水 ； 2) 调节鱼肉糜与水混合液的 pH 值至 1.5 2.5， 并保持恒定 ； 3) 根据鱼肉糜的质量， 胃蛋白酶以 1000 1300U/g 的。
4、比例加入到混合液中， 在保持酶 解温度 35 45的条件下， 酶解 2 3 小时 ； 4) 加热， 升温至 95 100进行钝化灭酶， 灭酶时间 5 15 分钟 ； 5) 冷却至 3 5以下， 进行离心处理 5 15 分钟， 离心速度 6000-8000r/min ； 6) 过滤， 取中间滤液至少在 -20以下冻藏或冻干保藏。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于所述的水与鱼肉糜质量比值优选为 4 1。 3. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于所述的 pH 值是用 6mol/L 的盐酸与 6mol/L 氢氧化钠来调节的， pH 值优选为 2.0。 4.根据权利要求1。
5、所述的制备方法， 其特征在于所述的胃蛋白酶使用量优选为1100U/ g。 5. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于所述的酶解温度优选 37， 时间 2.4 小时。 权 利 要 求 书 CN 102051398 A CN 102051404 A1/6 页 3 一种黄鲫蛋白抗菌肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白抗菌肽的制备方法， 尤其是一种黄鲫蛋白抗菌肽的制备方法。 背景技术 0002 在抗生素滥用， 耐药菌株不断产生的今天， 抗菌肽的研究吸引着国内外 学者的目光， 人们在不断寻找新的抗菌肽， 探索抗菌肽新的作用机制。抗菌肽 (antibacterialpeptide， 。
6、ABP) 又称抗微生物肽 (antimicrobial peptide， AMP) 广泛分 布于细菌、 病毒和各种动植物体内， 是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。AMP 多数 是一类分子量小于 10kDa 小分子肽， 在链长、 序列及结构有多样性的阳离子型两亲性肽类 (Boman H G.Antibactericidal peptides ： key components needed in immunityJ. Cell， 1991， 65 ： 205-207 ； Hultmark D.Drosophila immunity ： paths and pattemsJ. Current O。
7、pinion in Immunology， 2003， 15 ： 12-19.)。第一个抗菌肽 Cecropin 是瑞典科 学家 Steiner 等在 1981 年从惜古比天蚕 (Hyatophora cecropia) 蛹中诱导分离得到一 种杀菌肽 (Steiner H， Hultmark D，.， et al.Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunityJ.Nature， 1981， 292 ： 246-248.)。 目前抗菌肽的制备方法有 ： 从动植物组织中直接提取法、。
8、 化学合成法、 基因工程 法、 酶解法。 从天然动植物组织直接提取抗菌肽目前局限于几种主要动植物， 且需要大量溶 剂， 分离提纯困难较大 ； 化学合成法随着氨基酸数的增加， 出错率及副反应也增加， 而且成 本高 ； 基因工程法由于抗菌肽分子小、 易被蛋白酶降解， 而且表达产物可能对宿主有害， 从 而影响了基因的高水平表达 ( 布冠好， 李宏基， 杨国宇， 等 . 抗菌肽的作用特点及应用前景 J.动物医学进展， 2005， 26(3) ： 26-28.)。 Bolscher等认为采用酶解蛋白质法生产抗菌肽 可能是大批量生产抗菌肽最有前途的方法 (Bolscher J GM， Van der Kr。
9、aan M I A， Nazmi K.， et al.A one-enzyme strategy to release an antimicrobialpeptide from the LFampin-domain of bovine lactoferrinJ.peptides， 2006， 27 ： 1-9.)。酶解法有反应 条件温和、 反应过程容易控制等优点。本身无抗菌作用的蛋白质可以通过改变蛋白质构型 或者通过酶解方式获得抗菌活性， 而具有抗菌作用的蛋白可以作为具有新功能作用和更强 抗菌作用的前体物质 (Lpez Expsito I， Recio I.Antibacterial acti。
10、vity ofpeptides and folding variants from milk proteinsJ.International Dairy Journal， 2006， (16) ： 1294-1305.)。 0003 以食物源蛋白为原料制备抗菌肽研究， 国内外主要集中在乳源蛋白方面， 而有关 其他食物源蛋白为基质直接通过酶切方式获得具有抗菌活性肽的研究报道很少。 本研究以 大宗海产低值鱼黄鲫为原料， 通过响应面优化法 (RSM) 确定出抗菌肽制备的最佳条件， 并 对抗菌液的营养成分和理化稳定性进行测定， 结果表明黄鲫蛋白抗菌肽中必需氨基酸含量 丰富、 理化性质稳定。因为食物源蛋。
11、白酶解所得的抗菌肽安全性高、 吸收性好， 所以黄鲫蛋 白抗菌肽在食品中有作为营养和功能型添加剂的应用前景。 说 明 书 CN 102051398 A CN 102051404 A2/6 页 4 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种黄鲫蛋白抗菌肽的制备方法， 所制得的抗 菌肽安全性高、 吸收性好， 制备方法科学合理。 0005 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ： 一种黄鲫蛋白抗菌肽的制备方 法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0006 1) 将鱼肉洗净切小块， 用组织捣碎机搅碎均匀， 制成鱼肉糜， 按照鱼肉糜质量的 3 5 倍比例加入去离子水 ； 0007 2) 调节鱼。
12、肉糜与水混合液的 pH 值至 1.5 2.5， 并保持恒定 ； 0008 3) 根据鱼肉糜的质量， 胃蛋白酶以 1000 1300U/g 的比例加入到混合液中， 在保 持酶解温度 35 45的条件下， 酶解 2 3 小时 ； 0009 4) 加热升温至 95 100进行钝化灭酶， 灭酶时间 5 15 分钟 ； 0010 5) 冷却至 3 5以下， 进行离心处理 5 15 分钟， 离心速度 6000-8000r/min ； 0011 6) 过滤， 取中间滤液至少在 -20以下冻藏或冻干保藏。 0012 所述的水与鱼肉糜质量比值优选为 4 1。 0013 所述的制备方法中 pH 值是用 6mol/。
13、L 的盐酸与 6mol/L 氢氧化钠来调节的， pH 值 优选为 2.0。 0014 所述的胃蛋白酶使用量优选为 1100U/g。 0015 所述的酶解温度优选 37， 时间 2.4 小时。 0016 与现有技术相比， 本发明的优点在于 ： 是以纯天然的海产低值鱼黄鲫为原料来 制备抗菌肽， 黄鲫蛋白抗菌肽富含人体必需亮氨酸、 异亮氨酸、 赖氨酸、 苯丙氨酸、 甲硫氨 酸、 苏氨酸、 缬氨酸， 对热、 酸碱和消化道蛋白酶理化性能稳定， 对革兰氏阴性菌 (G-) 大 肠杆菌 (Escherichia coli)、 荧光假单孢菌 (Pseudomonas fluorescens)、 普通变形 (Pr。
14、oteusvulgaris)、 绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa) ； 革兰氏阳性菌 (G+) 金黄色 葡萄球 (Staphylococcus aureus)、 巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)、 八叠球菌 (Sarcina)、 藤黄八叠球菌 (Sarcina lutea) 均有抑菌作用。以食物源蛋白酶解所得的抗菌 肽具有安全性高、 吸收性好、 抑菌效果好的优点， 可以在食品中作为营养和功能型添加剂或 开发为耐药菌抗生素， 具有广阔的应用前景。 本制备方法简单、 经济、 易于操作， 可以在普通 实验室进行， 也适用于工业化扩大生产。 附图说明 0。
15、017 图 1 为工艺流程图。 具体实施方式 0018 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0019 实施例 1 0020 1) 将黄鲫去内脏洗净切小块， 用组织捣碎机搅碎均匀， 制成鱼肉糜， 取鱼肉糜 50 克， 加入 200 克去离子水 ； 0021 2) 用 6mol/L 的盐酸与 6mol/L 氢氧化钠来调节鱼肉糜与水混合液的 pH 值至 2.0， 并保持恒定 ； 说 明 书 CN 102051398 A CN 102051404 A3/6 页 5 0022 3) 将 55000U 的胃蛋白酶加入到混合液中， 在保持酶解温度 37的条件下， 酶解 2.4 小时 ； 0023 4)。
16、 升温至 95 100加热进行钝化灭酶， 灭酶时间 10 分钟 ； 0024 5) 冷却至 4以下， 进行离心处理 10 分钟， 速度 7000r/min ； 0025 6) 过滤， 取中间滤液在 -20冻藏或冻干保藏。 0026 三氯乙酸沉淀 (TCA) 结合凯氏定氮法测定黄鲫蛋白的胃蛋白酶抗菌液中可溶 性肽提取率达到 (81.780.04)， 茚三酮结合凯氏定氮法测定抗菌酶解液的水解度为 (18.120.39)。 酶解液的双缩脲反应、 茚三酮反应均为阳性， 说明是肽类混合物， 其中混 合肽含量为 25mg/ml。 0027 响应面分析 (RSM) 优选条件下， 30l 黄鲫蛋白抗菌肽对大肠。
17、杆菌的抑菌圈直径 为(20.31.9)mm与理论值20.2mm无显著性差异(P0.05)， 说明优选条件下确定的参数 准确可靠， 具有实用价值。 0028 下面对优选条件下黄鲫胃蛋白酶酶解液的营养成分与性能做进一步测试分析。 0029 一、 氨基酸分析结果 0030 表 1 黄鲫胃蛋白酶酶解液氨基酸分析 0031 Table 1Amino acid composition of half-fin anchovy pepsin hydrolysates 0032 0033 注 ： 色氨酸在强酸水解条件下被破坏， 所以检测结果不包括色氨酸， * 表示必需氨 基酸。 0034 氨基酸分析表明黄鲫胃蛋。
18、白酶酶解液含有 16 种氨基酸 ( 色氨酸水解过程中被破 坏未能测出 )， 其中 7 种必需氨基酸相对含量为 37.91。具有抗菌作用的蛋白和肽类一级 结构比较相似， N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸， C 端富含丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨 酸等非极性氨基酸， 中间部分则富含脯氨酸 (Boman H G， Hultmark D.Cell-freeimmunity in insectsJ.Annual Review ofMicrobiology， 1987， 41(2) ： 103-126 ； Jaynes J M， 说 明 书 CN 102051398 A CN 102051404 A4。
19、/6 页 6 Burton C A， Barr S B.， et al.In vitro cytocidal effect of novel lytic peptides on plasmodiumfalciparum and trypanosom a cruzfiJ.The FASEB Journal， 1989， 2(12) ： 2878-2883.)， 黄鲫蛋白抗菌液含有与抗菌作用相关氨基酸且相对含量较高。 0035 二、 抗菌液的分子量分布 0036 以牛血清白蛋白 (68000Da)、 抑肽酶 (6512Da)、 维生素 B12(1355Da)、 氧化型谷胱甘 肽 (612.63Da。
20、)、 L- 肌肽 (226.23Da) 为标准物质， 经 SuperdexTM-75HR 10/300 分离 ( 280mm)， 根据洗脱体积 (ml) 和标准物质相对分子量对数 (lgMt) 关系确定分子量标准曲线。 黄鲫胃蛋白酶酶解液在相同的洗脱条件下进行分离， 依据分子量标准曲线得出其抗菌蛋白 液中相对分子量10003000Da组分所占比例最高， 接近70。 三、 体外抑菌谱及抑菌效力 0037 表 2 黄鲫胃蛋白酶酶解液的抑菌谱 (n 3)Table 2Antibacterial-spectrum of half-fin anchovy pepsin hydrolysates(n 3)。
21、 0038 0039 注 ： 灭菌打孔器(直径4mm)打孔， 每孔加入抗菌液25l ； 表中数据为抑菌圈直 径平均值 标准差， +- 表示未形成明显抑菌圈。 0040 抑菌圈法测定黄鲫胃蛋白酶酶解液对革兰氏阴性菌 (G-) 和革兰氏阳性菌 (G+) 均 有抑菌作用， 具有广谱抑菌性， 其中对 G-菌抑菌效果总体强于 G+菌， 由于大多数抗菌肽属 于中性或偏碱性蛋白， 能通过与 G-菌外膜上的脂多糖等负电物质相互作用， 从而破坏膜 结构以发挥抗菌作用， 而 G+菌无脂多糖膜， 只能通过表面肽聚糖中的胞壁酸、 糖醛酸等带 少量负电荷与抗菌肽发生作用 (Hancock R E W， Chapple 。
22、D S.PeptideantibioticsJ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 1999， 43(6) ： 1317-1323.)。 黄鲫胃蛋白酶酶解 液中的中性和碱性氨基酸相对含量占 50.75， 有利于形成阳离子型抗菌肽类抑制 G- 菌。 0041 黄鲫胃蛋白酶酶解液对大肠杆菌的抑制作用与不同稀释倍数的氨苄青霉素和硫 说 明 书 CN 102051398 A CN 102051404 A5/6 页 7 酸链霉素的抑菌效果比较见表 3。 0042 表 3 黄鲫胃蛋白酶酶解液的抑菌效力与对照药物比较 (n 3)Table 3Comparing t。
23、he antibacterial effectiveness of half-fin anchovy pepsin hydrolysates(HAH) andcontrols(n 3) 0043 0044 注 ： 灭菌打孔器(直径4mm)打孔， 每孔加入样品液25l ； 表中数据为抑菌圈直 径平均值 标准差， 表示与氨苄青霉素抑菌圈大小比较无显著性差异 (P 0.05)， 表 示与硫酸链霉素抑菌圈大小比较无显著性差异 (P 0.05)。 0045 由表3可知黄鲫胃蛋白酶酶解液对大肠杆菌的抑菌结果与稀释128倍的氨苄青霉 素 (13.21 15.44mcg/ml) 和稀释 4 倍的硫酸链霉素 (。
24、325.00 340.00U/ml) 抑菌效力相 当， 0.05)。 0046 理化性质研究表明黄鲫蛋白抗菌肽对热稳定， 在80、 90、 100和121分别加热15、 30min 后， 对大肠杆菌的抑菌作用与对照 ( 未加热 ) 比较无显著性差异 (P 0.05)。在 pH 2.4， 3.4， 4.4， 5.4， 6.4， 7.4， 8.4 和 9.4 条件下对大肠杆菌均有抑菌作用， 其中在弱酸条件 下 (pH 5.4) 抑菌性最强。黄鲫蛋白抗菌肽耐受胰蛋白酶处理， 经过 0.25胰蛋白酶作用 15h后对大肠杆菌的抑制作用无显著性改变(P0.05)， 经内酰胺酶作用后仍保 留抑菌作用， 表明。
25、黄鲫蛋白抗菌肽的有效抑菌成分不含有 内酰胺环结构， 对一些耐 药菌可以发挥作用， 有进一步开发为耐药菌抗生素的价值。 0047 实施例 2 0048 1) 将黄鲫去内脏洗净切小块， 用组织捣碎机搅碎均匀， 制成鱼肉糜， 取鱼肉糜 50 克， 加入 150 克去离子水 ； 0049 2) 用 6mol/L 的盐酸与 6mol/L 氢氧化钠来调节鱼肉糜与水混合液的 pH 值至 2.0， 并保持恒定 ； 0050 3) 将 65000U 的胃蛋白酶加入到混合液中， 在保持酶解温度 35的条件下， 酶解 3 小时 ； 0051 4) 升温至 100加热进行钝化灭酶， 灭酶时间 5 分钟 ； 0052 。
26、5) 冷却至 5以下， 进行离心处理 15 分钟， 速度 6000r/min ； 0053 6) 过滤， 取中间滤液在 -22冻藏或冻干保藏。 0054 实施例 3 0055 1) 将黄鲫去内脏洗净切小块， 用组织捣碎机搅碎均匀， 制成鱼肉糜， 取鱼肉糜 50 克， 加入 250 克去离子水 ； 0056 2) 用 6mol/L 的盐酸与 6mol/L 氢氧化钠来调节鱼肉糜与水混合液的 pH 值至 2.0， 并保持恒定 ； 0057 3) 将 50000U 的胃蛋白酶加入到混合液中， 在保持酶解温度 45的条件下， 酶解 2 小时 ； 说 明 书 CN 102051398 A CN 102051404 A6/6 页 8 0058 4) 升温至 95加热进行钝化灭酶， 灭酶时间 15 分钟 ； 0059 5) 冷却至 4以下， 进行离心处理 5 分钟， 速度 8000r/min ； 0060 6) 过滤， 取中间滤液在 -25冻藏或冻干保藏。 说 明 书 CN 102051398 A CN 102051404 A1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102051398 A 。