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1、(10)申请公布号 CN 102558363 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102558363 A *CN102558363A* (21)申请号 201210047186.7 (22)申请日 2012.02.28 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/87(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院生物医学工程研究 所 地址 300192 天津市南开区白堤路 236 号 (72)发明人 冷希。
2、岗 刘兰霞 朱琳 宋丽萍 董霞 朱敦皖 张海玲 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 陆艺 (54) 发明名称 提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多 肽载体及用途 (57) 摘要 本发明公开了一种提高药物 / 基因肿瘤靶向 性和转染效率的多肽载体， 所述多肽载体具有式 (I) 的结构 ： LHRHp-MPGNLSp(I)所述多肽载体的 氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.3 所示。本发明 的多肽载体， 其带有大量的正电荷， 具有良好的水 溶性， 具有很强的针对性激素依赖性肿瘤及肝癌 的靶向性， 可直接携带带负电荷的核酸或药物并 介导其进入细胞，。
3、 也可修饰其它基因或药物载体 提高其肿瘤靶向性和转染效率。为基因 / 药物输 送提供了一种新型载体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体， 其特征是所述多肽载体具 有式 (I) 的结构 ： LHRHp-MPGNLSp(I) 所述多肽载体的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.3 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的多肽载体， 其特征是所述。
4、 LHRHp 的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.1 所示 ； 所述 MPGNLSp 的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.2 所示。 3. 权利要求 1 或 2 所述多肽载体的用途。 权 利 要 求 书 CN 102558363 A 2 1/4 页 3 提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体及用途 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种提高药物 / 基因靶向性和转染效率的多 肽载体及用途。 背景技术 0002 近年来， 恶性肿瘤已经成为最常见的发病和死亡原因之一， 全世界每年新增病例 1000 多万， 最新的世界卫生组织报告称其中 20发生在中国。传统。
5、的抗癌化疗药物缺乏 靶向性， 在杀死癌细胞的同时也导致正常细胞死亡， 毒副作用大， 使患者的生存质量严重下 降。因此研制高效且具有靶向性的基因 / 药物载体在恶性肿瘤的治疗中有着至关重要的作 用。 0003 细胞穿膜肽 (Cell-penetrating peptides， CPPs) 是一类具有细胞穿透功能的 短肽 ( 少于 30 个氨基酸 )， 能够有效地将蛋白质、 多肽、 核酸片段等以多种方式导入多种 哺乳动物细胞， 其转导效率高且不会造成细胞损伤， 是一种良好的基因 / 药物载体。其中， MPGp( 由 M.C.Morris， P.vidal， G.Divita 最先公开发表， 并以三。
6、人名字的首字母命名的多 肽 ) 就是一种高效安全的细胞穿膜肽， 它由人自身免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 的 gp41 蛋白 的融合蛋白结构域和猿猴空泡病毒 (simian vacuolating virus 40， SV40) 大 T 抗原的核 定位序列(nuclear localization sequence， NLS)区域组成。 MPGp含有较多的碱性氨基酸， 可与带负电荷的 DNA 或 RNA 通过静电作用形成纳米级颗粒， 并保护其免受核酸酶的降解。 MPGNLSp 通过将 MPGp 的 NLS 区域中一个氨基酸进行突变 ( 序列为 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQ P。
7、KSKRKV)， 从而使其携带的 DNA 或 RNA 在细胞质中大量释放， 因此适合作为 siRNA 递送载 体。由于 MPGNLSp 为直接穿膜进入细胞而非依赖受体， 因此缺乏组织细胞靶向性。 0004 提高载体肿瘤靶向性的主要策略是用对肿瘤细胞具有特异性识别的分子对载 体进行修饰， 使其对肿瘤细胞具有更高的选择性并借此提高肿瘤细胞对基因 / 药物的摄 入。研究发现， 促黄体生成素释放激素受体 (luteinizing hormone-releasing hormone receptor， LHRHR) 在肝癌及多数性激素依赖肿瘤如乳腺癌、 卵巢癌和前列腺癌等细胞膜上 过量表达， 明显高于在。
8、相应组织正常细胞膜上的表达， 且在正常的肝、 肾、 脾、 心、 肺、 脑、 胸 腺和骨骼肌组织的细胞膜上未有可检测到的表达。 促黄体生成素释放激素(LHRHp)是由10 个氨基酸组成的短肽 ( 序列 ： EHWSYGLRPG)。已有体外细胞实验证明， LHRHp 修饰可明显提 高所载药物对乳腺癌、 卵巢癌细胞的靶向性。 0005 鉴于以上讨论的问题， 期望提供一种针对肿瘤的具有靶向性且高效的载体。 发明内容 0006 本发明的目的是克服现有技术存在的基因 / 药物载体靶向性差及转染效率低的 难题， 提供一种提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体。 0007 本发明的第二个目的是提供一。
9、种提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽 载体的用途。 说 明 书 CN 102558363 A 3 2/4 页 4 0008 本发明的技术方案概述如下 ： 0009 一种提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体， 所述多肽载体具有式 (I) 的结构 ： 0010 LHRHp-MPGNLSp(I) 0011 所述多肽载体的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.3 所示。 0012 所述 LHRHp 的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.1 所示 ； 所述 MPGNLSp 的氨基酸序 列是序列表 SEQ ID NO.2 所示。 0013 上述多肽载体的用途。 0014 与现有。
10、技术相比， 本发明的优点如下 ： 0015 本发明涉及的一种提高药物 / 基因的靶向性和转染效率的多肽载体， 其带有大量 的正电荷， 具有良好的水溶性， 具有很强的针对性激素依赖性肿瘤及肝癌的靶向性， 可直接 携带带负电荷的核酸或药物并介导其进入细胞， 也可修饰其它基因或药物载体提高其肿瘤 靶向性和转染效率。为基因 / 药物输送提供了一种新型载体。 附图说明 0016 图 1. 多肽载 siRNA 复合物粒径变化情况。 0017 图 2. 细胞转染 siRNA48 小时后进行 RT-PCR 后琼脂糖凝胶电泳结果。 具体实施方式 0018 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。 0019 实。
11、施例 1 0020 一种提高药物 / 基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体， 所述多肽载体具有式 (I) 的结构 ： 0021 LHRHp-MPGNLSp(I) 0022 所述多肽载体的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.3 所示。 0023 SEQ ID NO.3 0024 N端-Gly-Arg-Leu-Trp(D型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly -Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-L ys-Val ； 0025 。
12、所述 LHRHp 的氨基酸序列是序列表 SEQ ID NO.1 所示 ； 所述 MPGNLSp 的氨基酸序 列是序列表 SEQ ID NO.2 所示。 0026 SEQ ID NO.2 0027 N 端 0028 -Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala- Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-Lys-Val 0029 SEQ ID NO.3 0030 N端-Gly-Arg-Leu-Trp(D型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu-Gly-Ala-Leu-Phe-Le。
13、u-Gly -Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-L ys-Val ； 说 明 书 CN 102558363 A 4 3/4 页 5 0031 实施例 2 0032 LHRHp-MPGNLSp 载 siRNA 纳米粒子的制备及稳定性测定 0033 将多肽载体 (LHRHp-MPGNLSp) 和 siRNA 分别溶于水中制得水溶液， 然后分别将两 种水溶液于 37水浴 10 分钟 ； 按 LHRHp-MPGNLSp 中的氨基所带正电荷与 siRNA 中的磷酸 根所带的负电荷的摩尔比。
14、分别为 20 1、 15 1 和 10 1 将两种溶液混匀并漩涡震荡 50 秒， 即得 LHRHp-MPGNLSp 载 siRNA 纳米粒子。 0034 图 1 为 pH 7.0 时不同 N/P 的 LHRH-MPGNLSp 载 siRNA 形成的纳米复合物的粒径 检测， 其中 ： 0035 代表按 LHRHp-MPGNLSp 中氨基所带的正电荷与 siRNA 中磷酸根所带的负电荷 的摩尔比为 20 1 混合后形成的纳米复合物 ； 0036 代表按 LHRHp-MPGNLSp 中氨基所带的正电荷与 siRNA 中磷酸根所带的负电荷 的摩尔比为 15 1 混合后形成的纳米复合物 ； 0037 代。
15、表按LHRHp-MPGNLSp中氨基所带的正电荷与siRNA中磷酸根所带的负电荷 的摩尔比为 10 1 混合后形成的纳米复合物。 0038 实验表明LHRHp-MPGNLSp中的氨基所带正电荷与siRNA中的磷酸根所带的负电荷 的摩尔比可以在 2 1 20 1 中选择 ； 0039 震荡时间可以在 40 60 秒中选择， 得到的 LHRHp-MPGNLSp 载 siRNA 纳米粒子， 其 平均粒径约为 80 110nm。 0040 实施例 3 0041 LHRHp-MPGNLSp 载 siRNA 纳米粒子的细胞转染实验 0042 按 照 实 施 例 2 的 LHRHp-MPGNLSp 载 si。
16、RNA 纳 米 粒 子 的 制 备 方 法，制 备 LHRHp-MPGNLSp载针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的siRNA的纳米粒子 ； 以上述siRNA含 量为 30nmol/L、 50nmol/L、 100nmol/L 或 200nmol/L 的纳米粒子分别转染人肝癌细胞 HepG2 和人正常肝细胞LO2， 阴性对照为单纯的200nmol/L的针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的 siRNA， 空白对照中只加入培养基而不加入任何纳米粒子或多肽或 siRNA， 阳性对照为脂质 体(lipo)载浓度为200nmol/L针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因siRNA。 转染48小时后提 取两种细胞的。
17、总RNA进行RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)。 0043 结果如图 2 所示， 图 2A 为 LHRHp-MPGNLSp 载针对人甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因的 siRNA纳米粒子转染人正常肝细胞48小时后， 进行RT-PCR的电泳结果图， 其中 ： 1为阳性对 照组 ； 2 为含 siRNA 200nmol/L 的纳米粒子转染组 ； 3 为含 siRNA 100nmol/L 的纳米粒子转 染组 ； 4 为含 siRNA 50nmol/L 的纳米粒子转染组 ； 5 为含 siRNA 30nmol/L 的纳米粒子转染。
18、 组 ； 6 阴性对照组 ； 7 为空白对照组。 0044 图2B为LHRHp-MPGNLSp载针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的siRNA纳米粒子转 染人肝癌细胞 48 小时后， 进行 RT-PCR 的电泳结果图， 其中 ： 8 为阳性对照组 ； 9 为含 siRNA 200nmol/L的纳米粒子转染组 ； 10为含siRNA 100nmol/L的纳米粒子转染组 ； 11为含siRNA 50nmol/L的纳米粒子转染组 ； 12为含siRNA 30nmol/L的纳米粒子转染组 ； 13阴性对照组 ； 14 为空白对照组。 0045 用天能图像处理软件测定图 2 中各个条带的净光值， 即亮度，。
19、 反应该条带经 RT-PCR后的基因表达量的多少。 将上述各实验组的净光值与空白对照的净光值分别进行除 说 明 书 CN 102558363 A 5 4/4 页 6 法计算得到百分数值 ( 表 1 所示 )， 即得到该实验组相对于空白组的基因表达的多少， 可反 映转染进入细胞的 siRNA 数量 ： 进入细胞的 siRNA 越多， 相应基因沉默的数量越多， 表达的 量越少， 该比值越低。 0046 表 1 0047 条带号 1 2 3 4 5 6 7 净光值比值 67.1 59.2 81.3 87.6 89.3 90 100 条带号 8 9 10 11 12 13 14 净光值比值 64.0 。
20、0 47.6 81.4 83.3 96.7 100 0048 表 1 可以说明 ： 条带 1-5 和条带 8-12 逐一比较， 应用没有靶向性的脂质体 ( 阳性 对照， 条带 1 和条带 8) 对人正常肝细胞和人肝癌细胞造成的基因沉默效果基本一致， 应用 LHRHp-MPGNLSp/siRNA 纳米粒子在不同 siRNA 浓度下 ( 条带 2-5 和条带 9-12 对比 ) 对人肝 癌细胞的基因沉默效果要好于人正常肝细胞， 说明应用 LHRHp-MPGNLSp 载体可以使其携带 的 siRNA 更多的进入肝癌细胞， 而较少的进入正常肝细胞， 达到靶向肿瘤的目的。 0049 表 1 中应用 LH。
21、RHp-MPGNLSp 携带 200nmol/L 的 siRNA( 条带 9) 与携带相同浓度的 siRNA 脂质体 ( 条带 8) 的数值对比， 前者已经可以将肝癌细胞中甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基 因完全沉默， 而后者的该基因仍有表达， 说明应用 LHRHp-MPGNLSp 携带 siRNA 进入肝癌细 胞中的数量高于目前公认转染效率较高的脂质体， 该多肽载体提高了对肝癌细胞的转染效 率。 0050 本发明的多肽 LHRHp-MPGNLSp 中的 LHRHp 和 MPGNLSp， 可发挥他们各自的作用， 前 者的肿瘤特异靶向识别作用和后者携带药物或基因进入细胞并定向将其释放于细胞质中 的功能， 可使其携带的药物或基因定向的进入并释放于肿瘤细胞中， 达到靶向治疗的目的。 说 明 书 CN 102558363 A 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 102558363 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102558363 A 8 。