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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410184021.3 (22)申请日 2014.05.04 (73)专利权人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇 金山学区 (72)发明人 许莉萍林庆良高世武陈晓英 (74)专利代理机构 福州市众韬专利代理事务所 (普通合伙) 35220 代理人 陈智雄黄秀婷 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102604986 A,201。
2、2.07.25,全文. CN 102559748 A,2012.07.11, 邱立明.利用烟草高效转化功能基因体系的 建立. 新疆大学学报 .2008,第25卷(第1期),第 23-27页. 审查员 姜岚 (54)发明名称 烟草遗传转化后的抑菌培养方法 (57)摘要 本发明涉及一种烟草遗传转化后的抑菌培 养方法， 包括抑菌剂的配制、 培养容器消毒、 农杆 菌转化、 培养基配制、 共培养、 筛选培养、 生根培 养和抗性苗检测。 采用本发明的烟草遗传转化后 的抑菌培养方法， 培养容器和培养基都无需进行 高温高压灭菌， 减少了工作量和能源消耗， 简化 了烟草遗传转化后的培养环节， 降低了烟草遗传 转。
3、化后的培养成本； 本发明的烟草遗传转化后的 抑菌培养方法， 操作简单， 只要按不同的培养基 配方配制后， 再加上抑菌剂即可， 实用性强， 推广 性好； 本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法 与常规方法比较， 可以降低成本10以上。 权利要求书1页 说明书5页 CN 103952438 B 2016.08.17 CN 103952438 B 1.一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 包括抑菌剂的配制、 培养容器消毒、 农杆菌转 化、 培养基配制、 共培养、 筛选培养、 生根培养、 抗性苗检测， 其特征在于： (1)抑菌剂的配制： 称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后， 加20的次氯酸钠。
4、 溶液100ml， 加20g山梨酸钾， 再加2g乳酸链球菌素， 用蒸馏水定容到200ml； (2)培养容器消毒： 将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为12的水溶液中浸 泡不少于10h， 保存备用； (3)农杆菌转化： 选择携带hyg基因的植物表达载体， 导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中， 制成转化菌液， 用转化菌液侵染烟草叶片； (4)培养基配制： 共培养培养基为MS+0.5mg/LBA+100 mol/L乙酰丁香酮+0.40.5ml/ L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8； 筛选培养基为MS+0.10.5mg/L。
5、6-BA+30mg/L 潮霉素+0.40.5ml/L抑菌剂+300mg/LTimentin+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8； 生 根培养基为1/2MS+0.40.5ml/L抑菌剂+300mg/LTimentin+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8； 所述MS培养基为1962年， Murashige和Skoog公开的MS培养基； 所述6-BA， 指6-苄氨基 嘌吟； 配制培养基时， 先不加抑菌剂， 按各培养基配方配齐其他原料后， 定容、 加热至琼脂粉 完全溶解， 等温度降到4050时， 再按各培养基配方添加抑菌剂， 用1mol/L的NaOH或 1mol/L的H。
6、Cl调pH值至5.8， 分装到消毒处理的培养容器中， 封口， 冷却凝固后备用； (5)共培养： 将侵染后的材料从转化菌液中取出， 用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液， 然 后转至共培养培养基中， 在22黑暗条件下共培养3d； (6)筛选培养： 将共培养后的材料移至筛选培养基中， 培养室温度为28， 光照12h， 光 照强度为1200lx； 15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗； 选取高于2cm的小苗转生根 培养； (7)生根培养： 将筛选培养获得高于2cm的小苗， 分成单株接种至生根培养基中， 20 30d可形成完整植株， 即抑菌培养苗； 培养室温度为28， 光照12h， 光照强度为1500lx。
7、； (8)抗性苗检测： 取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料， 进行DNA提取、 PCR检测， 呈现阳 性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。 2.根据权利要求1所述的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 其特征在于共培养的 培养基为MS+0.5mg/LBA+100 mol/L乙酰丁香酮+0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼 脂粉， pH5.8。 3.根据权利要求1所述的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 其特征在于筛选培养 的培养基为MS+0.2mg/L6-BA+30mg/L潮霉素+0.5ml/L抑菌剂+300mg/LTimentin+30.0g/L 蔗糖+3.5g/L琼脂。
8、粉， pH5.8。 4.根据权利要求1所述的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 其特征在于生根培养 的培养基为1/2MS+0.5ml/L抑菌剂+300mg/LTimentin+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103952438 B 2 烟草遗传转化后的抑菌培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种植物组培方法， 具体涉及一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 属生物技术领域。 背景技术 0002 随着生物技术和分子生物学的快速发展， 烟草转基因的研究越来越深入和完善。 目前， 转基因烟草的研究提高了烟草抵抗病害、 虫害、 逆境、 除草剂、 重。
9、金属污染的能力， 在 提高烟草品质和安全上也发挥了重要作用。 由于烟草易于进行组织培养、 容易得到再生转 化烟株， 作为模式植物， 烟草在生物功能基因组研究中， 占有举足轻重的地位。 0003 植物组织、 细胞或原生质体经遗传转化后需进行筛选， 将转化子和非转化子区分 开来， 并将非转化子淘汰。 目前对烟草转化子的筛选主要采用抗生素筛选法。 即在目的基因 旁边融合一个编码转化或分解某种抗生素酶的报告基因。 这种报告基因表达的产物 (Enzyme)可使被转化的细胞或植株能抵抗某一特定的抗生素.而非转化细胞团不具有抗性 基因而在筛选培养基中死亡。 0004 在烟草遗传转化过程中， 大量的工作都集中。
10、在培养基的配制和接种上， 尤其是培 养基的配制。 在常规的农杆菌介导烟草转基因过程中， 需要添加一些能抑制农杆菌生长的 抗生素， 这些抗生素不耐高温高压， 只能通过过滤灭菌后才能加入培养基中。 常规情况下 是， 培养容器和培养基经过高温高压灭菌后， 冷却到40-50， 再加入经过滤灭菌后的抗 生素， 然后分装到培养容器中， 冷却凝固后备用。 以上工作程序繁锁、 工作量大。 如果能找到 一种无需高温高压、 又能抑制农杆菌生长、 同时还不影响烟草正常生长的培养基， 就可以解 决以上问题。 因此， 本发明将简化烟草由农杆菌介导后的筛选培养环节， 人工操作的效率将 大幅度提高， 从而大幅度降低人工成本。
11、。 不仅如此， 由于培养基自身具有杀菌、 抗菌或抑菌 作用， 后期的组织培养过程的污染问题还能得到有效控制。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法。 0006 本发明的目的是通过以下方法实现的。 0007 本发明的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 包括抑菌剂的配制、 培养容器消 毒、 农杆菌转化、 培养基配制、 共培养、 筛选培养、 生根培养、 抗性苗检测， 其特征在于： 0008 1、 抑菌剂的配制： 称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后， 加20的次氯 酸钠溶液100ml， 加20g山梨酸钾， 再加2g乳酸链球菌素， 用蒸馏水定容到200ml。
12、， 即为抑菌 剂； 0009 2.培养容器消毒： 将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为12(/)的 水溶液中浸泡不少于10h， 保存备用； 0010 3 .农杆 菌 转 化 ： 选 择 携带 hyg 基因的 植 物 表达 载体 ， 导 入 根 癌农杆 菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中， 制成转化菌液， 用转化菌液侵染烟草叶片； 说明书 1/5 页 3 CN 103952438 B 3 0011 4.培养基配制： 共培养培养基为MS+0.5mg/LBA+100 mol/L乙酰丁香酮+0.4 0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， 。
13、pH5.8； 筛选培养基为MS+0.10.5mg/L6-BA+ 30mg/L潮霉素+0.40.5ml/L抑菌剂+300mg/LTimentin+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8； 生根培养基为1/2MS+0.40.5ml/L抑菌剂+300mg/LTimentin+30g/L蔗糖+3.5g/L 琼脂粉， pH5.8； 所述MS培养基为1962年， Murashige和Skoog公开的MS培养基； 所述6-BA， 指 6-苄氨基嘌吟； 配制培养基时， 先不加抑菌剂， 按各培养基配方配齐其他原料后， 定容、 加热 至琼脂粉完全溶解， 等温度降到4050时， 再按各培养基配方添加抑。
14、菌剂， 用1mol/L的 NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8， 分装到消毒处理的培养容器中， 封口， 冷却凝固后备用； 0012 5.共培养： 将侵染后的材料从转化菌液中取出， 用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液， 然后转至共培养培养基中， 在22黑暗条件下共培养3d； 0013 6.筛选培养： 将共培养后的材料移至筛选培养基中， 培养室温度为28， 光照12h， 光照强度为1200lx； 15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗； 选取高于2cm的小苗转生 根培养； 0014 7.生根培养： 将筛选培养获得高于2cm的小苗， 分成单株接种至生根培养基中， 20 30d可形成完整植株， 。
15、即抑菌培养苗； 培养室温度为28， 光照12h， 光照强度为1500lx； 0015 8.抗性苗检测： 取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料， 进行DNA提取、 PCR检测， 呈 现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。 0016 本发明的应用效果： 0017 1、 本发明培养基中不同抑菌剂浓度对农杆菌侵染后愈伤组织污染的影响： 我们设 计了7种抑菌剂浓度的对比试验， 结果如表1所示。 试验结果表明， 以抑菌剂浓度0.4 1.0ml/L为佳， 当抑菌剂浓度为0.4ml/L以上时， 农杆菌污染率均为0； 抑菌剂浓度大于 1.0ml/L时， 愈伤组织长势变弱， 部分愈伤组织出现褐化现象。 001。
16、8 表1本发明筛选培养基中不同抑菌剂浓度对农杆菌侵染后愈伤组织污染的影响 0019 抑菌剂浓度(ml/L)愈伤组织块数污染块数污染率() 03030100 0.2302790 0.3301240 0.43000 0.53000 13000 1.23000 0020 2.本发明的筛选培养基对农杆菌侵染后的烟草愈伤组织生长的影响： 由于本发明 配制的培养基是无需高温高压的， 所以在增殖过程中， 除了要考虑愈伤组织生长状况外， 还 要考虑污染的问题。 表2试验结果表明， 本发明一种烟草遗传转化后的筛选培养方法与常规 的烟草遗传转化后的筛选培养方法相比， 在愈伤组织生长状况和污染率方面都没有差异。 0。
17、021 表2本发明筛选培养基对农杆菌侵染后的烟草愈伤组织生长的影响 0022 培养基制备污染率()愈伤组织生长状况 说明书 2/5 页 4 CN 103952438 B 4 高温高压后+潮霉素和Timentin0长出新的愈伤组织 本发明的筛选培养基0长出新的愈伤组织 0023 3.本发明的筛选培养基对农杆菌侵染后的烟草愈伤组织分化的影响： 表3试验结 果表明， 利用本发明制备的筛选培养基与高温高压后再加潮霉素和Timentin的常规制备培 养基比较， 对烟草叶片农杆菌侵染后愈伤组织的分化没有影响， 分化率都在99以上。 0024 表3本发明筛选培养基对农杆菌侵染后的烟草愈伤组织分化的影响 00。
18、25 培养基制备污染率()愈伤组织分化率() 高温高压+潮霉素和Timentin0100 本发明筛选培养基099 0026 4.本发明的生根培养基对农杆菌侵染后获得的烟草瓶苗生根的影响： 为了验证本 发明制备的生根培养基对烟草瓶苗生根是否有影响， 我们做了对比试验， 结果见表4。 试验 结果表明， 这二种培养基的制备方法对烟草瓶苗的生根率没有太大的差异， 污染率比使用 常规的培养基更低， 说明本发明的生根培养基可以应用到烟草瓶苗的生根阶段。 0027 表4本发明的生根培养基对农杆菌侵染后获得的烟草瓶苗生根的影响 0028 培养基制备污染率()生根率()生长状况 高温高压后+Timentin59。
19、7苗绿、 壮， 根长 本发明的生根培养基095苗绿、 壮， 根长 0029 5.抗性苗分子检测： 取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料， 进行DNA提取、 PCR检 测， 呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。 0030 本发明具有以下优点： 0031 1.本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 培养基的配制无需高温高压灭菌， 这在以农杆菌介导的烟草转基因的培养基配制上， 大大地减少了工作量和能源消耗， 简化 了组培环节， 降低了组培成本。 0032 2.本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 操作简单， 只要按不同的培养基配 方配制后， 再加上抑菌剂即可， 实用性强， 推广性好。 00。
20、33 3.本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法与常规的农杆菌介导烟草转基因方 法对比， 可以降低成本10以上。 具体实施方式 0034 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明， 以下结合实例加以说明。 本实施例的 实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所述试剂和材料， 如无特殊说明， 均可从商业途径 获得。 0035 实施例一： 一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法 0036 一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法， 包括以下步骤： 0037 1、 抑菌剂的筛选和配制： 选用4种药剂各3种浓度， 采用L9(3)4正交表进行排列， 配 制培养基， 接种侵染后的烟草叶片， 15天后统计污染率和材料坏死率。
21、， 结果表明次氯酸钠是 影响培养基的污染和材料坏死的主要因子， 低浓度主要是造成培养基的污染， 高浓度主要 说明书 3/5 页 5 CN 103952438 B 5 是造成材料的坏死； 其它3个因素的各水平之间的差异经显著性测验均未达到显著性水平， 见表5。 0038 表5不同药剂和浓度对组培的影响 0039 0040 根据表5中的K值和R值的大小， 找出的主次因子分别依次为： 次氯酸钠、 乳酸链球 菌素、 山梨酸钾、 富马酸二甲酯； 0041 其最佳组合为： 50ppm次氯酸钠+5ppm乳酸链球菌素+50ppm山梨酸钾+6ppm富马酸 二甲酯。 0042 表5中序号19表示处理组合， K1K。
22、3表示在每个因素下对应水平的实验结果的 平均数， R表示每个因素下K的最大值减最小值的差。 0043 按照最佳组合的配方配制抑菌剂： 称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解 后， 加20的次氯酸钠溶液100ml， 加20g山梨酸钾， 再加2g乳酸链球菌素， 用蒸馏水定容到 200ml， 即为抑菌剂； 0044 2.培养容器消毒： 将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1(/)的水溶液 中浸泡10h， 保存备用； 0045 3 .农杆 菌 转 化 ： 选 择 携带 hyg 基因的 植 物 表达 载体 ， 导 入 根 癌农杆 菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA。
23、105中， 制成OD6000.8的转化菌液。 取事先培养的 无菌烟草苗嫩叶， 切成1cm1cm， 放入转化菌液中， 侵染10min； 所述导入方法、 转化菌液制 备方法参照申请号为201110435405.4的发明专利 “一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表 说明书 4/5 页 6 CN 103952438 B 6 达率方法” 。 0046 4.共培养： 将侵染后的材料从转化菌液中取出， 用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液， 然后转至MS+0.5mg/LBA+100 mol/L乙酰丁香酮+0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼 脂粉， pH5.8共培养培养基中， 在22黑暗条件下共。
24、培养3d； 0047 5.筛选培养： 将共培养后的材料移至MS+0.2mg/L6-BA+30mg/L潮霉素+0.5ml/L抑 菌剂+300mg/LTimentin+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8筛选培养基中， 培养温度28 ， 光照12h， 光照强度为1200lx； 15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗， 选取高于2cm 的小苗转生根培养； 0048 6.生根培养： 将筛选培养获得高于2cm的小苗， 分成单株接种至1/2MS+0.5ml/L抑 菌剂+300mg/LTimentin+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉， pH5.8生根培养基中， 培养温度28， 光照12h， 光照强度为1500lx， 2030d可形成完整植株， 即抑菌培养苗； 0049 7.抗性苗检测： 取98株移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料， 通过PCR检测结果共有 85株呈阳性， 扩增出的条带与目的条带一致， 说明HYG基因成功导入烟草中。 0050 本实施例使用的化学试剂为分析纯。 说明书 5/5 页 7 CN 103952438 B 7 。