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1、(10)授权公告号 CN 102051349 B (45)授权公告日 2012.07.25 CN 102051349 B *CN102051349B* (21)申请号 200910209607.X (22)申请日 2009.10.30 C12N 9/22(2006.01) (73)专利权人 安琪酵母股份有限公司 地址 443003 湖北省宜昌市城东大道 168 号 (72)发明人 俞学锋 李知洪 余明华 姚鹃 赵劼 朱昌雄 邓怡熹 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 张英 US 2007031957 A,2007.02.08, 说明书全 文 . CN 。
2、101012469 A,2007.08.08, 说明书全文 . 李德莹 . 麦芽根中 5 - 磷酸二酯酶的制备 及性质. 华东理工大学学报 .2002, 第 28 卷 ( 第 4 期 ),376-379 页 . 苏庆辉等 .5 - 磷酸二酯酶的提取 .酿 酒 .2004, 第 31 卷 ( 第 1 期 ),88-90 页 . 冯芳等.麦芽根中5- 磷酸二酯酶的高效提 取 . 酿酒 .2008, 第 35 卷 ( 第 6 期 ),87-90 页 . 冯芳等.麦芽根中5- 磷酸二酯酶的高效提 取 . 酿酒 .2008, 第 35 卷 ( 第 6 期 ),87-90 页 . (54) 发明名称 核酸。
3、酶 P1 的制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种用于制备核酸酶 P1 的方法， 包括以下步骤 ： (1) 将麦芽根粉碎过筛， 向过筛 后的麦芽根粉末中添加水， 并在混匀后加入无机 盐， 将 pH 值调至 5.5-6.0， 在 33-37下搅拌提取 8-16 小时 ； (2) 对上述提取液进行压滤以除去大 颗粒滤渣， 收集滤过液 ； (3) 离心所述滤过液， 收 集上清液， 以得到核酸酶 P1 提取液。通过本发明 的方法， 能够获得活性显著提高的核酸酶 P1。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张林 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
4、12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种从麦芽根中提取核酸酶 P1 的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： (1) 将麦芽根粉碎过筛， 向过筛后的麦芽根粉末中添加水， 并在混匀后加入无机盐， 将 pH 调至 5.5-6.0， 在 33-37下搅拌提取 8-16 小时 ； (2) 对上述提取液进行压滤以除去大颗粒滤渣， 收集滤过液 ； (3) 离心所述滤过液， 收集上清液， 以得到核酸酶 P1 提取液 ； 其中， 所述方法在步骤 (3) 后还包括以下步骤 ： (4) 使所述上清液经 0.5 微米膜除去大分子杂质， 收集透过液 ； (5) 使所述透过液经截留分子。
5、量为 5-10KD 的膜进行超滤浓缩， 收集截留液， 得到浓缩 的核酸酶 P1 提取液 ； 并且所述方法在步骤 (5) 后还包括以下步骤 ： (6) 向所述截留液中加入 1-6g/L 的 ZnSO4， 在 30-45、 真空度 -0.08 -0.12MPa 条件 下进行浓缩， 以得到高度浓缩的核酸酶 P1 提取液。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 步骤 (1) 是在 34-36下搅拌提取 8-16 小时。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 步骤 (1) 是在 35下搅拌提取 8-16 小时。 4. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的方法， 其中， 所述无机盐为 4-。
6、10g/L 的 MgSO4和 1-3g/L 的 ZnSO4。 5. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述膜为有机卷式膜。 6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法在步骤(6)后还包括 以下步骤 ： (7) 将所述高度浓缩的核酸酶 P1 提取液在 60-70条件下处理 10-15 分钟， 以灭除所 述核酸酶 P1 提取液中的杂酶。 权 利 要 求 书 CN 102051349 B 2 1/5 页 3 核酸酶 P1 的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于制备核酸酶 P1 的方法， 具体而言， 本发明涉及从麦芽根中提 取核酸酶 P1 的。
7、方法。 背景技术 0002 核酸酶 P1(5 - 磷酸二酯酶 ) 是一种重要的特种酶制剂， 其主要应用于两个领域， 一是分子生物学领域， 在该领域中要求使用高纯度的核酸酶 P1， 其在国内外很多试剂公 司都能买到 ； 另一个重要领域就是医药核苷酸及食品呈味核苷酸的生产， 即将核酸降解为 5 - 核苷酸。一方面， 5 - 核苷酸具有调节机体机能的功效， 可作为医药的辅助添加剂使用 ； 另一方面， 在呈味食品的生产中， 核酸酶 P1 水解核酸产生的 5 - 核苷酸是食物鲜味的主要 成分， 特别是鸟苷一磷酸 (GMP) 和肌苷一磷酸 (IMP) 可以显著增加食品的鲜味。目前， 全球 仅有阿玛诺天野特。
8、种酶制剂一家公司可以生产食品级核酸酶 P1， 并且该公司生产的核酸酶 P1 价格昂贵。 0003 从目前已有文献来看， 核酸酶 P1 主要通过两种方式生产 ： 一是利用微生物发酵生 产， 这种方式工艺复杂， 产品容易被霉菌孢子污染 ； 二是从啤酒大麦芽生产的副产物麦芽根 中提取， 但从麦芽根中提取的粗酶液中除了核酸酶 P1(5 - 磷酸二酯酶 ) 以外， 还含有磷酸 单酯酶及 3 - 磷酸二酯酶， 因而在实际应用中造成产物杂质较多的缺陷。 0004 现有技术中， 从麦芽根提取核酸酶 P1 的工艺路线基本一致， 通常为 ： 以新鲜麦芽 根为原料， 经过粉碎过筛、 浸提、 压滤除渣、 以及离心分离。
9、等步骤获得核酸酶P1。 虽然目前已 有多篇文献报道了对核酸酶 P1 提取工艺参数 ( 例如， 筛目大小、 浸提温度、 pH 值等 ) 的优 化选择， 但目前所能获得的核酸酶 P1 的酶活最高只能达到 474U/ml( 麦芽根中 5 - 磷酸二 酯酶的制备及性质， 华东理工大学学报， 2002， 8)。在将通过现有技术获得的核酸酶 P1 用于 生产呈味核苷酸时， 酵母抽提物中呈味核苷酸的含量最高仅为 16000mg/kg， 这导致在呈味 核苷酸实际生产过程中核酸酶P1的用量较大， 通常在30-50(体积浓度)以上， 很难被生 产企业所接受。 0005 因此， 需要对现有技术中从麦芽根提取核酸酶 。
10、P1 的方法进行改进， 找到一种制备 核酸酶 P1 的新方法， 以生产出活性显著提高的核酸酶 P1。 发明内容 0006 针对上述问题， 本发明提供一种用于制备核酸酶 P1 的方法， 具体而言， 提供一种 从麦芽根中提取核酸酶 P1 的方法。通过本发明方法所获得的核酸酶， 与现有技术相比， 酶 活性显著提高， 因而能够用于高效生产呈味核苷酸。 0007 根据本发明用于制备核酸酶 P1 的方法， 包括以下步骤 ： (1) 将麦芽根粉碎过筛， 向 过筛后的麦芽根粉末中添加水， 并在混匀后加入无机盐， 将 pH 值调至 5.5-6.0， 在 33-37 下搅拌提取 8-16 小时 ； (2) 对上述。
11、提取液进行压滤以除去大颗粒滤渣， 收集滤过液 ； (3) 离 心所述滤过液， 收集上清液， 以得到核酸酶 P1 提取液。 说 明 书 CN 102051349 B 3 2/5 页 4 0008 根据本发明用于制备核酸酶 P1 的方法， 在一种实施方式中， 向麦芽根水溶液中同 时加入MgSO4和ZnSO4两种无机盐， 并且MgSO4和ZnSO4的添加浓度分别为4-10g/L和1-3g/ L。 0009 根据本发明用于制备核酸酶 P1 的方法， 在一种实施方式中， 在离心收集上清液后 还包括以下步骤 ： (4) 使上清液经 0.5 微米膜除去大分子杂质， 收集透过液 ； (5) 使透过液 经截留分。
12、子量为 5-10KD 的膜进行超滤浓缩， 收集截留液， 得到浓缩的核酸酶 P1 提取液。 0010 根据上述制备核酸酶 P1 的方法， 其中， 所使用的膜为有机卷式膜。 0011 根据本发明用于制备核酸酶 P1 的方法， 在一种实施方式中， 在经膜浓缩后还包 括 ： (6) 向截留液中加入 1-6g/L 的 ZnSO4， 在 30-45、 真空度 -0.08 -0.12MPa 条件下进 行浓缩， 以得到高度浓缩的核酸酶 P1 提取液。 0012 根据本发明用于制备核酸酶 P1 的方法， 在一种实施方式中， 还包括 ： (7) 将高度浓 缩的核酸酶 P1 提取液在 60-70条件下处理 10-1。
13、5 分钟， 以灭除核酸酶 P1 提取液中的杂 酶。 0013 在本发明的方法中， 采用 33-37， 优选 34-36， 更优选 35温度对核酸酶 P1 进 行浸提， 这与现有技术中优化选择的 40浸提温度 (“5 - 核苷酸制备工艺的优化” ， 杨 翠竹， 中国优秀硕士学位论文全文数据库， 2008 年 01 期， B016-97， 2008-01-15) 相比， 能够 出乎预料地提高核酸酶 P1 的得率 ； 本发明同时添加两种无机盐， MgSO4和 ZnSO4， 对核酸酶 P1进行浸提， 与现有技术中仅使用MgSO4相比， 能够显著改善浸提效果， 提高核酸酶P1的得 率 ； 此外， 现有技。
14、术中因考虑到核酸酶 P1 在高温下容易失活而多采用冷冻干燥、 喷雾干燥 方式对核酸酶 P1 进行浓缩， 此种方法耗能较大， 产品成本较高， 本发明首次采用真空条件 下浓缩的方式对核酸酶 P1 进行纯化， 经实验证明， 能够获得高活性的核酸酶 P1 产品， 这为 核酸酶 P1 的生产开辟了新途径。 0014 综上所述， 本发明通过添加无机盐进行浸提而得到核酸酶 P1 粗酶液， 通过膜微 滤、 超滤和真空浓缩得到活性单位较高的浓缩酶液， 并利用核酸酶 P1 本身的特点， 对杂酶 进行灭除， 解决了常规技术提取核酸酶 P1 单位酶活较低的问题。并且， 将通过本发明得到 的核酸酶产品应用于高呈味核苷酸。
15、酵母抽提物的生产中， 能够显著提高酵母抽提物中的呈 味核苷酸含量。 因此， 本发明通过一种低成本工艺生产高活性的核酸酶P1， 并将其用于酵母 抽提物的生产中， 可大大提高经济效益， 具有广阔的应用前景和市场需求。 具体实施方式 0015 本发明以麦芽根为原料， 通过粉碎过筛、 添加无机离子、 水浸提后离心、 微滤膜除 杂、 超滤膜浓缩、 蒸发浓缩、 灭除杂酶等工艺得到活性显著提高的浓缩酶液。本发明的核酸 酶 P1 的提取浓缩工艺可简要表示为 ： 0016 新鲜麦芽根 - 粉碎过筛 - 浸提 - 压滤除渣 - 离心分离 - 微 滤除杂 - 超滤浓缩 - 蒸发浓缩 - 灭除杂酶 - 浓缩酶液。 0。
16、017 以下对提取浓缩工艺中的各个步骤进行详细描述， 本领域技术人员应当明了， 以 下详细描述仅为说明本发明， 而非限制本发明的保护范围， 在不违反本发明的精神的情况 下对其做出的各种修改和变化均应包括在本发明的范围内 ： 0018 1、 粉碎过筛 ： 挑选新鲜去壳的啤酒大麦麦芽根， 颜色偏黄最佳， 用粉碎机进行粉 说 明 书 CN 102051349 B 4 3/5 页 5 碎， 过 60-100 目筛备用。通过粉碎能够破坏麦芽根的组织结构、 增大麦芽根的比表面积， 使 麦芽根充分与以下浸提液接触， 以利于麦芽根中酶的溶出。本发明选择过 60-100 目筛， 可 改善浸提效果， 进而提高浸提。
17、后核酸酶 P1 的得率。 0019 2、 提取 ： 将上述过筛后的麦芽根粉末以原料与水的比例为 1 10 1 6 添加工 艺水， 搅拌使之混合均匀， 然后添加 4-10g/L 的硫酸镁和 1-3g/L 的硫酸锌， 调 pH 为 5.5 6.0， 在 33-37， 优选 34-36， 更优选在约 35条件下搅拌提取 8-16 小时。在该步骤中， 本发明选择在 33-37， 优选 34-36， 更优选在约 35温度下， 同时采用两种无机盐， 硫酸 镁和硫酸锌， 对核酸酶 P1 进行浸提， 这与现有技术中在 40、 单一添加硫酸镁的浸提工艺 相比， 能够出乎预料地提高核酸酶 P1 的得率。 0020。
18、 3、 压滤 ： 将核酸酶 P1 提取液用单层滤布压滤以除去大部分大颗粒滤渣， 直至滤渣 较为干燥即可， 收集滤过液。 0021 4、 离心 ： 将上述收集的滤过液经离心机在 14000-16000rpm 离心分离 10-30min， 收 集上清液。 0022 5、 微滤、 超滤 ： 将上述离心分离得到的上清液经 0.5 微米的有机卷式膜除去大分 子颗粒杂质， 收集透过液 ； 再经截留分子量为 5-10KD 的有机卷式膜进行超滤浓缩， 收集截 留液。通过该步骤， 核酸酶 P1 的浓缩倍数可达 5-6 倍。 0023 6、 蒸发浓缩 ： 向上述超滤截留液添加 1-6g/L 的硫酸锌， 在 30-。
19、45、 真空 度 -0.08 -0.12MPa 条件下浓缩至膏状， 至固形物含量达到 35以上。 0024 7、 灭除杂酶 ： 将上述已高度浓缩的核酸酶 P1 提取液在 60-70条件下处理 10-15 分钟， 以灭除其中的杂酶。 由于麦芽根中除了含有核酸酶P1外， 还含有磷酸单酯酶及3 -磷 酸二酯酶， 有必要对其进行灭除以提高核酸酶 P1 的纯度。 0025 现有文献中并没有报道对杂酶的有效去除， 而经典的离子交换树脂分离纯化法成 本高， 工艺复杂， 酶损失也较大。本发明在制备核酸酶 P1 的方法中增加高温处理灭除杂酶 的步骤， 该步骤对于核酸酶 P1 的活性没有影响， 不仅可提高核酸酶 。
20、P1 的酶纯度和作用效 果， 同时能够节省成本。 0026 以下以示例性方式列举本发明方法的实验例， 以具体说明本发明的有益效果。 0027 实验例 1 0028 采用 34-36浸提温度对核酸酶 P1 提取的影响 0029 将粉碎过 60 目筛的啤酒大麦麦芽根以原料与水的比例为 1 10 添加工艺水， 混 匀后加入 6g/L 的硫酸镁和 2g/L 的硫酸锌， 调 pH 值为 5.5， 分别在约 30、 约 35、 约 40 条件下搅拌提取 16h。每种温度下进行三次重复试验。对各种处理获得的酶提取液进行酶 活力的测定。 0030 核酸酶 P1 活力的测定方法 ： 0031 热变性 RNA 底。
21、物的制备 ： 称取 1.500g 酵母核酸， 加适量双蒸水溶解， 微沸 20min 使核酸变性， 调 pH 至 6.5 左右， 用 pH 为 6.5 的磷酸缓冲溶液定容至 50ml。 0032 测定方法 ： 离心管中加入 1.9ml 上述热变性底物， 68下保温 10min， 加酶液 0.1ml， 保温 15min 后取出离心管， 在冰水浴中振荡， 并迅速加入 2.0ml 预冷的核酸沉淀剂 (0.25钼酸铵 +2.5高氯酸 )。冰水浴中冷却 20min， 离心分离。取 0.2ml 上清液加双蒸 水定容于 50ml 容量瓶中， 在 260nm 处测定吸光度值 A。 说 明 书 CN 102051。
22、349 B 5 4/5 页 6 0033 空白对照 ： 离心管中加入 1.9ml 上述热变性底物， 在 68下保温 25min， 加入预冷 核酸沉淀剂 2.0ml， 再加酶液 0.1ml， 余下步骤相同。测定吸光度值 A0。 0034 酶活的计算 ： 在一定的测定条件下， 每分钟所生成的核苷酸量使其在 260nm 处 的光密度差为 1.0 时定义为一个活力单位。 0035 活力 (U/min) (A-A0)(4/0.1)(50/0.2)15 0036 具体结果如表 1 所示。 0037 表 1 0038 0039 由上表可以发现， 在其他条件完全相同的情况下， 采用约 35浸提温度提取得到 的。
23、核酸酶 P1 活性， 显著高于约 30、 约 40条件下获得的核酸酶 P1 的活性。 0040 实验例 2 0041 同时采用硫酸镁和硫酸锌两种无机盐对核酸酶 P1 提取的影响 0042 将粉碎过 60 目筛的啤酒大麦麦芽根以原料与水的比例为 1 10 添加工艺水， 混 匀后分别加入 (1)6g/L MgSO4、 (2)2g/L ZnSO4、 (3)6g/L MgSO4+2g/L ZnSO4， 调 pH 值为 5.5， 在 35条件下搅拌提取 16h。以上每种情况分别进行三次重复试验。对获得的核酸酶 P1 提取液分别进行酶活测定 ( 酶活测定方法同实验例 1)， 具体结果如表 2 所示。 00。
24、43 表 2 0044 说 明 书 CN 102051349 B 6 5/5 页 7 0045 由上表可以发现， 在其他条件完全相同的情况下， 同时采用 MgSO4+ZnSO4两种无机 盐浸提核酸酶 P1， 与单独采用其中任一种无机盐进行浸提相比， 所获得的核酸酶 P1 的活性 显著提高。 0046 实验例 3 0047 通过本发明的方法生产核酸酶 P1 0048 挑选新鲜去壳的啤酒大麦麦芽根， 颜色偏黄最佳， 用粉碎机粉碎到一定粒径， 过 60 目筛备用。用上述过 60 目筛后的麦芽根粉末按料液比 1 10 添加工艺水， 混匀， 添加 6g/ L 的硫酸镁和 2g/L 的硫酸锌， 调初始 p。
25、H 为 5.5， 约 35条件下搅拌提取 12 小时。将提取液 用单层滤布经板框压滤渣， 收集滤过液， 经离心机 16000rpm 离心， 分离得到上清酶液。 0049 将离心分离得到的上清液经孔径为 0.5 微米的有机卷式膜除去大分子颗粒， 收集 透过液， 经截留分子量 10KD 的有机卷式膜进行超滤浓缩， 浓缩体积倍数约 5 倍。收集截留 液， 添加2g/L的硫酸锌， 混匀后在36-40、 真空度为-0.1MPa条件下浓缩， 浓缩体积倍数约 10 倍。 0050 将上述酶产品以与实验例 1 相同的方法进行酶活测定， 酶活测定值达到 2600U/ ml， 远远高于通过现有技术获得的核酸酶 P。
26、1 的活性值。 0051 另外， 通过本发明方法所得的核酸酶 P1 产品达到规模生产中核酸水解的要求， 因 而， 本发明的方法完全能够用于核酸酶 P1 的生产。 0052 实验例 4 0053 将本发明方法获得的核酸酶 P1 用于生产富含呈味核苷酸的酵母抽提物。 0054 将 20酵母自溶液升温至 65， 调 pH 值为 6.5， 保温备用。将实验例 3 得到的核 酸酶 P1 以 10ml/L(1 ) 的量加入上述 65保温的酵母自溶液中， 搅拌， 保温 4.5 小时后升 温至 90灭酶， 然后降温至 55， 添加 5 - 腺苷转氨酶反应 3 小时， 反应后的酶解液升温 至 90灭酶。灭酶后，。
27、 将酵母自溶液酶解液通过离心机离心， 分离上清液， 并在 80浓缩至 干物质含量为40左右， 测定其中两种呈味核苷酸， 鸟苷一磷酸(GMP)和肌苷一磷酸(IMP) 的含量。实验重复三次。实验结果如表 3 所示。 0055 表 3 0056 处理 GMP(g/1000g) IMP(g/1000g) a 18.33 17.80 b 16.53 15.24 c 17.21 15.70 0057 由上表可以发现， 采用本发明的方法提取的核酸酶 P1 对酵母抽提物进行水解， 酵 母抽提物中两种呈味核苷酸含量可达到 30000mg/kg 以上， 远远高于用现有技术提取的核 酸酶 P1 水解酵母抽提物获得的呈味核苷酸的含量。所得高呈味酵母抽提物完全达到产品 的各项标准。 0058 以上实验例仅以示例性方式来说明本发明的效果， 并不用来限制本发明的范围。 在不违背本发明权利要求的精神和范围的情况下， 本发明可以进行各种修改。 说 明 书 CN 102051349 B 7 。