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1、(10)申请公布号 CN 102061273 A (43)申请公布日 2011.05.18 CN 102061273 A *CN102061273A* (21)申请号 201010532768.5 (22)申请日 2010.11.05 CCTCC NO:M2010182 2010.07.16 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/16(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 宋存江 李保宾 王淑芳 李强 耿伟涛 曹名锋 孙秀梅 苏文萍 张伟 (54) 发明名称 一株具有解。
2、磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株具有解磷作用的枯草芽孢 杆菌及其应用。 涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182 以及利用该 菌产生中性植酸酶的方法。菌种接至 LB 培养基， 30振荡培养过夜， 以15接种量接种于产酶 培养基中， pH 5.57.5， 2537振荡培养2 4 天 ； 4， 5000rpm， 离心 15min， 取上清， 得到中性 植酸酶粗酶 ； 稀释10倍后， 测定发酵液的酶活 ； 其 中产酶培养基的碳源为麦麸， 氮源为酪蛋白胨和 (NH4)2SO4。该菌产生的中性植酸酶在 pH。
3、 7.0 时具 有很高的酶活 ； 能够应用于鱼类饲料开发， 降低 水体中磷的污染 ； 还能用于研制生物菌肥， 有效 利用土壤中有机磷， 减少磷肥施用量， 改善土壤微 环境， 提高农产品的品质。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 102061278 A1/1 页 2 1. 一 株 具 有 解 磷 作 用 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182。 2. 利用枯草芽孢杆菌 (Bacillus su。
4、btilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182 产生中性植酸 酶的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 菌种接至 LB 培养基， 30振荡培养过夜， 以 1 5 接种量接种于产酶培养基中， pH 5.5 7.5， 25 37振荡培养 2 4 天 ； 4， 5000rpm， 离 心15min， 取上清， 得到中性植酸酶粗酶 ； 稀释10倍后， 测定发酵液的酶活 ； 其中产酶培养基 的碳源为麦麸， 氮源为酪蛋白胨和 (NH4)2SO4。 权 利 要 求 书 CN 102061273 A CN 102061278 A1/3 页 3 一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用 技术领域 0。
5、001 本发明涉及枯草芽孢杆菌新菌株及其应用， 特别是涉及一株具有解磷作用的枯草 芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8 及应用此菌产生中性植酸酶的方法。 背景技术 0002 磷是动植物生长的必需元素， 在生命活动过程中发挥着重要的作用。土壤中的磷 大部分以植酸态、 核酸、 磷脂态等有机磷形式存在， 不能被植物直接吸收利用， 并且作为磷 肥原料来源的磷矿石地下储存量非常有限， 这将使磷成为制约现代农业可持续发展的一个 重要因素。另一方面， 水产养殖业中， 鱼类饲料中 40 70的磷也以植酸态形式存在， 因 鱼类消化道内缺乏水解植酸磷的酶类， 磷大部分随粪便排出， 不但不能充分。
6、利用饲料中的 磷源， 而且造成严重的水体磷污染。因此， 急需解磷菌产生出酶类物质将有机磷转化成生 物体易于吸收的磷。植酸酶就可以催化植酸及植酸盐水解成低磷酸化的肌醇衍生物和磷 酸 ( 或磷酸盐 )， 提高磷和其它微量元素的生物利用率。但目前大多植酸酶都属酸性植酸 酶 (pH2.5 5.5)。因此， 研究开发新的菌株， 使其能产生中性植酸酶， 有效 pH 作用范围在 6.5 7.5 之间， 能够提高中性条件下的解磷效果， 应用于磷细菌肥料和鱼类 ( 消化道呈 中性 ) 饲料的开发， 提高土壤或饲料中磷的利用率， 改善土壤及水体生态环境， 具有重要意 义。 发明内容 0003 本发明的目的之一是提。
7、供一株能产生中性植酸酶的具有解磷作用的枯草芽孢杆 菌 (Bacillus subtilis)XF-8。 0004 本发明的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8 分离自山东省济宁市田间土 壤， 在筛选平板上产生水解圈， 菌落边缘整起， 湿润， 革兰氏阳性， 并结合 16SrDNA 和 BIOLOG 微生物鉴定系统进行鉴定， 确定该菌株为枯草芽孢杆菌， 命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8。该菌已于 2010 年 7 月 16 日保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏 中心， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2010182。 0005。
8、 本发明的第二个目的是提供利用枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8 CCTCC NO ： M 2010182 产生中性植酸酶的方法。 0006 为实现这目的， 本发明采取以下技术方案 ： 菌种接至 LB 培养基， 30振荡培养过 夜， 以 1 5接种量接种于产酶培养基中， pH 5.5 7.5， 25 37振荡培养 2 4 天。 4， 5000rpm， 离心15min， 取上清， 得到中性植酸酶粗酶 ； 稀释10倍后， 测定发酵液的酶活。 0007 利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8CCTCC NO ： M 2010182发酵产生植酸 酶的培。
9、养基碳源为麦麸， 氮源为酪蛋白胨和 (NH4)2SO4， 其中的酪蛋白胨有利于诱导植酸酶 的产生。 0008 由本发明所得到的中性植酸酶具有良好的热稳定性， 其 pH 作用范围在 6.5 7.5 之间， 可以有效弥补酸性植酸酶的不足， 能够应用于鱼类饲料开发， 降低水体中磷的污染 ； 还能用于研制生物菌肥， 有效利用土壤中有机磷， 减少磷肥施用量， 改善土壤微环境， 提高 农产品的品质。 说 明 书 CN 102061273 A CN 102061278 A2/3 页 4 具体实施方式 0009 图 1 为植酸酶标准曲线。 0010 在 下 面 的 实 施 例 中 所 用 菌 种 均 为 枯 。
10、草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) XF-8CCTCCNO ： M 2010182， 实施例中不同培养基及溶液配方如下 ： 0011 1.LB 培养基 ： 1000ml 水， 10.0g 蛋白胨， 5.0g 酵母浸粉， 5.0gNaCl， pH 7.0-7.2。 0012 2.筛选培养基 ： 1000ml水， 20.00g葡萄糖， 2.00g CaCl2， 5.00g NH4NO3， 0.50g KCl， 0.50gMgSO47H2O， 0.01g FeSO47H2O， 0.01g MnSO4， 3.00g 植酸钙， 15.00g 琼脂。 0013 3.产酶培养基 ： 。
11、称取100g麦麸加入900ml H2O中， 121下60min， 6层纱布过滤， 滤 液定容至 1L， 加入 0.4g(NH4)2SO4， 0.2g MgSO47H2O， 0.5g KH2PO4， 0.4g K2HPO4， 2.0g CaCl2， 10.0g 酪蛋白胨。 0014 4. 酶活测定溶液 ： 0015 酶稀释液 ： 2mmol/L CaCl2， 50mmol/L Tris-HCl， pH 7.0， 10甘油 ； 0016 底物溶液 ： 2mmol/L 植酸钠 (100mmol/LTris-HCl pH 7.0， 2mmol/L CaCl2) 0017 终止液 ： 20三氯乙酸 (T。
12、CA) ； 0018 硫酸亚铁 硫酸铵显色液 ： (1.5钼酸铵 5.5硫酸 ) (2.7硫酸亚铁 ) 4 1， v/v 0019 1.5g 钼酸铵溶于水， 加入 98浓硫酸 5.6mL， 定容至 100mL ； 0.68g 硫酸亚铁溶于 25mL 水， 两部分混匀， 存放于 4。 0020 5. 磷标准液 ( 用于计算直线回归方程 ) ： 0021 A、 50mM 磷酸盐母液 ： 1.3609g KH2PO4( 干燥 ) 溶于 200ml 重蒸水中 ( 定容 )。 0022 B、 磷标准液 ： 将母液按一定比例， 分别稀释成 0.2mM， 0.4mM， 0.8mM， 1.6mM， 3.2mM。
13、 的工作液。 0023 实施例1、 分离鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182 0024 实验材料来自山东省济宁市田间土壤。 0025 具体实施步骤如下 ： 在无菌操作下， 称取 1.0g 土样溶于 9ml 无菌生理盐水中， 充 分振荡后， 置于 85水浴锅中 15min， 并梯度稀释后， 涂布于已制好的筛选平板上。倒放于 28 30恒温箱中培养 2 3 天， 用接种针挑起有透明圈的菌落， 进一步分离、 纯化。再 将菌株接于产酶培养基中， 进行复筛， 以确定产植酸酶的菌株。经过革兰氏染色、 16S rDNA 基因序列分析及 BI。
14、OLOG 鉴定确定该菌株为枯草芽孢杆菌， 命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8， 经保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2010182。 0026 实施例 2、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M 2010182 的产酶 培养实验 1 0027 采用产酶培养基， 具体步骤如下 ： 菌种接至 LB 培养基， 30振荡培养过夜， 以 1.0接种量接种于产酶培养基中， 25， pH 5.5， 160rpm 振荡培养 2 天。4， 5000rpm， 离 心 15min， 取上清， 得到中性植酸酶粗酶 ； 稀释 1。
15、0 倍后， 测定发酵液的酶活。 0028 磷标准曲线的绘制 0029 采用溶液 4、 5 制作磷标准曲线。具体步骤如下 ： 用不同浓度的磷标准溶液 250l 加入 1ml 底物溶液， 37水浴 30min 后， 加入 1.25ml 终止液 ； 对照组为 250l 双蒸水中加 入 1.25ml 终止液， 37水浴 30min 后， 加入 1ml 底物溶液， 实验组和对照组均加入 2.5ml 显 说 明 书 CN 102061273 A CN 102061278 A3/3 页 5 色液， 生成磷钼酸盐在 700nm 下测定 OD 值。得到的磷标准曲线如说明书附图 1 所示。 0030 枯草芽孢杆菌。
16、(Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182产生的中性植酸酶 酶活测定 0031 酶活定义为 ： 在 pH 7.0 时， 每分钟释放 1M 磷所需的酶的量。 0032 将样品用缓冲液做适当稀释后， 取250l酶液加入1ml底物溶液， 37水浴30min 后， 加入 1.25ml 终止液， 终止酶反应 ； 对照组 250l 酶液加入 1.25ml 终止液终止酶反应， 37水浴 30min 后， 加入 1ml 底物溶液， 实验组和对照组均加入 2.5ml 显色液， 生成磷钼酸 盐在 700nm 下测定 OD 值。根据标准曲线所得方程及酶活定义代入酶活计算。
17、公式 ： 0033 酶活性 (U/ml) (1.8149x-0.0166)4n/t 0034 x ： OD700 的值 ； 0035 4 ： 250l 稀释酶液中的酶活换算成 1ml 酶液的酶活 ； 0036 n ： 酶液稀释倍数 ； 0037 t ： 反应时间 0038 计算枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活为 0.32U/ml。 0039 实施例 3、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182 的产酶 培养实验 1 0040 采用产酶培养基， 具体步骤如下 ： 菌种接至 LB 培养基，。
18、 30振荡培养过夜， 以 2.5接种量接种于产酶培养基中， 30， pH 6.5， 160rpm 振荡培养 3 天， 4， 5000rpm， 离心 15min， 取上清， 得到中性植酸酶粗酶 ； 稀释 10 倍后， 测定发酵液的酶活。 0041 磷标准曲线的绘制和中性植酸酶酶活测定方法同实施例 2。 0042 根据标准曲线所得方程及酶活定义计算枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活为 0.51U/ml。 0043 实施例 4、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8， CCTCC NO ： M2010182 的产酶 培养实验 3 0。
19、044 采用产酶培养基， 具体步骤如下 ： 菌种接至 LB 培养基， 30振荡培养过夜， 以 5.0接种量接种于产酶培养基中， 37， pH 7.5， 160rpm 振荡培养 4 天。4， 5000rpm， 离 心 15min， 取上清， 得到中性植酸酶粗酶 ； 稀释 10 倍后， 测定发酵液的酶活。 0045 磷标准曲线的绘制和中性植酸酶酶活测定方法同实施例 2。 0046 根据标准曲线所得方程及酶活定义计算枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活为 0.40U/ml。 说 明 书 CN 102061273 A CN 102061278 A1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102061273 A 。