技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种血清/血浆miRNA组合物及其应用。
背景技术
肝细胞癌(HepatocellμLar Carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，就全球而言，慢性HBV和HCV感染是原发性肝细胞癌(HCC)主要的危险因素，尤其是慢性HBV感染与HCC发病呈现高度的地域一致性，与全球75％的肝癌有关，在发展中国家甚至达到85％。
HBV感染后的治疗是一个长期漫长的过程，在这个过程中，病情易出现反复活动，病变常成阶段性进展，越晚越恶劣，越晚越难治，发生肝硬化后，抗病毒治疗也难完全防止其进一步发展，而HCC更是恶性程度最高的肿瘤之一，病程短、进展快、预后极差，5年生存率不到10％。因此，对HBV感染者的病情需要长期动态检测，掌握患者的疾病状态和病情严重程度，对阶段性的进展更应及早诊断以确定针对性的防治方案，最大限度地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝细胞癌及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。
目前，血清HBV标志物和甲胎蛋白(AFP)是全世界应用最广泛的HBV感染和HCC生物标志物(Biomarker)，转氨酶则是反映肝脏损伤程度的常用指标，但它们难以反映HBV感染相关疾病的动态进展情况，对相应疾病的早期诊断效果也越来越不能满足需要，如随着影像学的发展，AFP阴性的病例被确诊为肝癌，其诊断肝癌的敏感性仅为40％-60％，特异性为70％-90％；针对肝硬化的诊断和病变程度判断则尚缺乏合适的生物标志物。尽管目前国内外研究者正探索筛选新的生物标志物，以对AFP进行有效的补充，但是难以突破传统生物标志物发展和应用中的瓶颈，即抗体难以制备和定量检测困难。
综上所述，HCC起病比较隐匿，并且预后不良，要加强HBV感染者病情的监控，发现病情变化的早期指针，就需要针对HBV感染不同阶段，获得灵敏、特异、易于检测的标志物。另外，HBV感染和HCC治疗效果有限，要进行治疗效果的早期判断，发现更多有效的治疗靶标，进行靶向治疗就需要动态监测HBV感染和HCC治疗的效果，了解HBV感染的自然史，HCC发生和发展的分子机制，获得易于调控的治疗靶标。因此，寻找一类新型的特异性生物标志物是肝癌防治的当务之急。
肝癌，特别是乙型肝炎相关性肝癌在我国的发病率高，死亡率高，严重危害人们的健康，而乙型肝炎相关性肝癌目前尚无满意的治疗。国内外学者对肝癌开展了广泛而深入的研究，但乙肝病毒与肝癌发生发展的关系尚未完全阐明。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供在HBV阳性者和HBV阳性的HCC患者表达差异显著的血清miRNA组合物及其应用。
本发明的另一目的在于提供这些miRNA的引物、这些引物的应用以及含有这些引物的试剂盒，为实现肝细胞癌早期诊断提供特异性的中间结果以及迅速的无创伤性检测手段。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种血清/血浆miRNA组合物，该miRNA组合物包括下列miRNA：hsa-miR-122、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b及hsa-miR-10a中的任意两种或两种以上。其中hsa-miR-122序列为SEQ ID NO.27，hsa-miR-92a序列为SEQ ID NO.28，hsa-let-7c序列为SEQ IDNO.29，hsa-miR-23a序列为SEQ ID NO.30，hsa-miR-23b序列为SEQ ID NO.31，hsa-miR-223序列为SEQ ID NO.32，hsa-miR-342-3p序列为SEQ ID NO.33，hsa-miR-423-5p序列为SEQ ID NO.34，hsa-miR-375序列为SEQ ID NO.35，hsa-miR-99a序列为SEQ ID NO.36，hsa-miR-150序列为SEQ ID NO.37，hsa-miR-125b序列为SEQ ID NO.38，hsa-miR-10a序列为SEQ ID NO.39。
所述miRNA组合物优选包括：hsa-miR-92a、hsa-miR-223、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a及hsa-miR-10a；或者包括hsa-miR-92a、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b及hsa-miR-10a。
所述miRNA为人成熟体miRNA。
所述的miRNA组合物可在制备检测HBV阳性和/或HBV阳性肝细胞癌的试剂或工具中的应用。
所述miRNA组合物的筛选方法包括以下步骤：
(1)收集慢性乙肝患者混合血清或血浆，提取总RNA；
(2)采用Solexa测序技术，对上述总RNA中已知的人全部成熟miRNA(miRBase12.0，共692个)进行检测，与年龄、性别匹配的非HBV感染的正常对照组比对后初筛出慢性乙肝患者表达显著升高的miRNA；
(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，用实时荧光定量PCR方法(EvaGreen染料法)对正常人、HBV清除者、HBV携带者、慢性乙肝患者、慢性丙肝患者进行逐个检测，从Solexa方法初筛出的miRNA中进一步筛选出稳定的表达差异显著的一组miRNA；
(4)进一步用定量PCR方法对正常对照组(包括正常人、HBV清除者)、HBV阳性者、慢性丙肝患者进行逐个验证，并对筛选出的miRNA在HBV阳性确诊过程中的应用及临床价值进行评估；
(5)进一步对HBV阳性者、HBV阳性的HCC患者进行逐个验证，并对筛选出的miRNA在HBV阳性的肝细胞癌中的检测过程中的应用及临床价值评进行估。
本发明使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、Solexa测序技术(Solexasequencing technology)、Real-time PCR方法中的一种或几种。例如，血清中miRNA分子的检测方法包括以下步骤：
(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA；
(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；
(3)根据要检测的成熟体miRNA序列设计引物SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.26进行PCR反应；
(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(5)EB染色后在紫外灯下观察结果。
在所述步骤(5)之后还可以包括下列步骤：用EvaGreen染料法检测并比较各组血清中miRNA的量的变化。
本发明还提供了一种用于检测HBV阳性者、HBV阳性的肝细胞癌患者的miRNA引物组合物，包括本发明所述血清/血浆miRNA的引物。
所述的引物优选miR-122正向引物SEQ ID NO.1、miR-122反向引物SEQID NO.2；hsa-miR-92a正向引物SEQ ID NO.3、hsa-miR-92a反向引物SEQ IDNO.4；hsa-let-7c正向引物SEQ ID NO.5、hsa-let-7c反向引物SEQ ID NO.6；hsa-miR-23a正向引物SEQ ID NO.7、hsa-miR-23a反向引物SEQ ID NO.8；hsa-miR-23b正向引物SEQ ID NO.9、hsa-miR-23b反向引物SEQ ID NO.10；hsa-miR-223正向引物SEQ ID NO.11、hsa-miR-223反向引物SEQ ID NO.12；hsa-miR-342-3p正向引物SEQ ID NO.13、hsa-miR-342-3p反向引物SEQ ID NO.14；hsa-miR-423-5p正向引物SEQ ID NO.15、hsa-miR-423-5p反向引物SEQ IDNO.16；hsa-miR-375正向引物SEQ ID NO.17、hsa-miR-375反向引物SEQ IDNO.18；hsa-miR-99a正向引物SEQ ID NO.19、hsa-miR-99a反向引物SEQ ID NO.20；hsa-miR-150正向引物SEQ ID NO.21、hsa-miR-150反向引物SEQ ID NO.22；hsa-miR-125b正向引物SEQ ID NO.23、hsa-miR-125b反向引物SEQ ID NO.24；及hsa-miR-10a正向引物SEQ ID NO.25、hsa-miR-10a反向引物SEQ ID NO.26中的任意两组或两组以上。
或者，所述引物组合物优选包括：hsa-miR-92a、hsa-miR-223、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a及hsa-miR-10a 6种miRNA的引物对，进一步优选包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20；及SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26。
亦或者，所述引物组合物优选包括：hsa-miR-92a、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b及hsa-miR-10a；进一步优选包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.7、SEQID NO.8；SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14；SEQID NO.15、SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26。
本发明所述的miRNA的引物组合物可在制备检测HBV阳性和/或HBV阳性肝细胞癌的试剂或工具中的应用。
一种用于HBV阳性、HBV阳性肝细胞癌检测的试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的miRNA引物组合物。
所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP、氯化镁、PCR缓冲液(不含Mg2+)和EvaGreen荧光染料。
本发明的有益效果：
本发明所筛选出的miRNA组合物及其引物对HBV阳性者以及HBV阳性的肝细胞癌患者检测的特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用的蛋白标志物，大大提高了诊断的准确性。本发明血清/血浆miRNA检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态，并为HBV阳性的肝细胞癌的治疗提供了潜在靶点。此外，血清相对容易获得，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为HBV相关的肝癌和HBV感染的检测开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
本发明所筛选出的血清miRNA组合物与至今已报道的其他几种肿瘤患者血清中特异变化的miRNA不尽相同，提示本发明的miRNA组合物不仅可以将正常对照、HBV阳性以及HBV阳性的肝细胞癌区分开来，同时也与其他肿瘤区分开来。
本发明miRNA的引物同样是基于Solexa技术、定量PCR技术筛选出的在HBV阳性、HBV阳性的肝细胞癌以及正常状态下表达差异显著的一组血清miRNA引物，这样可以增加检测的灵敏度和特异性，提高检测水平。
本发明血清miRNA检测试剂盒是一种系统、全面的试剂盒，血清miRNA检测试剂盒能够明确HBV相关的肝癌患者疾病进展情况，全面的反映患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约了成本和时间，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
综上所述，本发明提供的特异的miRNA组合物作为检测HBV阳性以及HBV阳性的肝细胞癌的中间结果，有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行HBV感染和HBV阳性的肝细胞癌的诊断。检测血清中的miRNA简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测血清miRNA的试剂盒投入实践使用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织，通过最精简的引物库来检测血清miRNA水平能拓展肝细胞癌的检测指标，提高检测的灵敏度，丰富检测肝细胞癌的手段，具有极重要的临床应用潜力和价值。
附图说明
图1显示以hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个miRNA作为markers时对健康对照者(A)和病毒清除者(B)进行聚类分析的结果。
图2显示以hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个miRNA作为markers时对无症状HBV携带者(C)和慢性乙肝患者(D)进行聚类分析的结果。
图3显示以hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个miRNA作为markers时对健康对照者(A)、病毒清除者(B)、慢性丙肝患者(HCV)、无症状HBV感染者(C)和慢性乙肝患者(D)进行聚类分析的结果。
图4显示以hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个miRNA作为markers时对正常对照组(N)、慢性丙肝病人组(HCV)和HBV组(HBV)进行聚类分析的结果。
图5显示正常对照组和HBV组之间的ROC曲线。
图6显示正常对照组和HCV组之间的ROC曲线。
图7显示以hsa-miR-375、hsa-miR-92a、hsa-miR-10a、hsa-miR-223、hsa-miR-423-5p和hsa-miR-99a 6个miRNA作为markers时对正常对照组(N)、慢性丙肝病人组(HCV)和HBV组(HBV)进行聚类分析的结果。
图8显示正常对照组和HBV-HCC组之间的ROC曲线。
图9显示HBV组和HBV-HCC组之间的ROC曲线。
图10显示以hsa-miR-23b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-23a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-10a、hsa-miR-125b和hsa-miR-92a 8个miRNA作为markers时对正常对照组(N)、HBV阳性的肝癌组(HBV-HCC)和HBV组(HBV)进行聚类分析的结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
本发明所用的标本是本发明人于2007年3月到2008年7月间从南京医科大学第一附属医院和南京市传染病医院搜集了大量的血清样品，通过对样品资料的整理，本发明人从中选择了80例健康对照者(平均年龄：37.52±12.09，年龄跨度：20-75，男性：37，女性：43)、80例病毒清除者(平均年龄：37.2±9.85，年龄跨度：25-52，男性：48，女性：32)、55例长期无症状HBV感染者(平均年龄：35.80±11.40，年龄跨度：21-67，男性：33，女性：22)、80例慢性乙肝病人(平均年龄：36.22±12.18，年龄跨度：20-86，男性：55，女性：25)、65例HBV相关的HCC患者(平均年龄：53.43±9.10，年龄跨度：40-83，男性：59，女性：6)和48例慢性丙肝患者(平均年龄：35.96±7.15，年龄跨度：24-58，男性：39，女性：9)作为Solexa测序和后续一系列q-PCR验证的实验样品。具体的样品归类标准如下：
健康对照组(A)：
1.乙肝表面抗体、乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阴性；2.丙肝抗体和/或丙肝RNA阴性；3.ALT＜40IU/L，AST＜45IU/L；4.没有其它系统性疾病；5.年龄≥20。病毒清除者(B)：
1.乙肝表面抗原阴性和/或HBV-DNA阴性，乙肝表面抗体和乙肝核心抗体阳性并且没有疫苗注射历史；2.丙肝抗体和/或丙肝RNA阴性；3.ALT＜40IU/L，AST＜45IU/L；4.没有其它系统性疾病；5.年龄≥20。对照组：
健康对照组和病毒清除者组的整合(N)。
持续性无症状HBV携带者(C)：
1.乙肝表面抗原和核心抗体阳性；2.丙肝抗体和/或丙肝RNA阴性；3.ALT＜40IU/L，AST＜45IU/L；4.没有肝炎临床症状；5.没有肝硬化临床迹象；6.没有其它系统性疾病；7.年龄≥20。
慢性乙肝患者(D)：
1.乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性至少6个月；2.丙肝抗体和/或丙肝RNA阴性；3.ALT和/或AST水平高于正常值的两倍；4.没有肝硬化临床迹象；5.没有其它系统性疾病；6.年龄≥20；
HBV阳性组(HBV)：
持续性无症状HBV携带者组和慢性乙肝患者组的整合。
HBV阳性的肝细胞癌(HBV-HCC)：
1.乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性；2.丙肝抗体和/或丙肝RNA阴性；3.组织切片检查确诊为肝细胞癌；4.年龄≥40。
慢性丙肝患者(HCV)：
1.丙肝抗体和/或丙肝RNA阳性；2.乙肝表面抗原阴性；3.ALT和/或AST水平高于正常值的两倍；4.没有肝硬化临床迹象；5.没有其它系统性疾病；6.年龄≥20。
实施例1慢性乙肝患者特异性miRNA表达谱初筛(Solexa测序委托深圳华大基因研究院完成)
使用Solexa测序技术发现并证明30个健康对照者和30个慢性乙肝患者血清/血浆中稳定存在88种差异表达的微小核糖核酸。具体步骤为：
(1)收集健康对照者和慢性乙肝病人的血清/血浆；
(2)分别取80-100ml的血清，加入等体积的Trizol Reagent；
(3)相分离：室温放置15min，然后按0.2ml了氯仿/1ml Trizol Reagent的体积比加入氯仿，教育列震荡15s，室温15min，12,000g，4℃，离心15min；
(4)将水相转移到新的50ml的离心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；
(5)RNA沉淀：将水相转移到新的离心管中，按0.5ml异丙醇/1ml Trizol Reagent体积加入异丙醇，-20℃保存60min，12,000g，4C，离心60min；
(6)用1ml Trizol重悬沉淀，将悬液转移到新的1.5ml的离心管中；
(7)重复2，4步(第四步离心改为15min)；
(9)RNA洗涤：去掉上清，加入75％乙醇，12,000g，4℃离心5min；
(10)测量浓度：通常能得到5～10μgRNA/50～100ml血清；
(11)总RNA进行PAGE电泳回收17-27nt的RNA分子；
(12)将adaptor primer酶联在步骤(11)所得RNA分子的3′与5′端；
(13)进行RT-PCR反应后并进行测序；
(14)数据分析与处理：
具体实验结果见表1。根据表中的Solexa结果，我们选择在慢性乙肝病人中的拷贝数是健康对照者中拷贝数的20倍的microRNAs作为本发明中初步筛查的血清markers，并且这些microRNAs在慢性乙肝病人中的拷贝数都大于50拷贝，由于技术操作问题，我们舍弃了miR-221和miR-629。通过筛选，选择了hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个microRNAs作为初步筛查的markers。
表1健康对照者和慢性乙肝病人血清Solexa测序结果
实施例2对Solexa技术初筛出的miRNA进行real-time PCR验证，筛选出表达存在稳定显著差异的一组miRNA
对30例健康对照者(Solexa测序样品)、30例病毒清除者、30例无症状HBV感染者、30例慢性乙肝患者(Solexa测序样品)和30例慢性丙肝患者的血清进行微小核糖核酸的qRT-PCR检验。
(1)制备cDNA样品：a)取500μL血清；b)加等体积的水饱和酚，振荡混匀，4℃，13200rpm离心3分钟，取上清；c)上清+1/2体积(250μL)酚+1/2体积(250μL)氯仿，振荡混匀，4℃，13200rpm离心3分钟，取上清；d)加与上清等体积的氯仿震荡混匀，4℃，13200rpm离心3分钟，取上清作为RNA样品；e)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV buffer、2μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)、0.5μlRNase Inhibitor(Takara公司)、2μl AMV(Takara公司)以及1.5μl基因特异性反向引物混和物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24及SEQ ID NO.26的混合物)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。
(2)qRT-PCR：将cDNA按1/5稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μlTaq酶(Takara公司)，1μl 20×EVAGREEN荧光染料，0.2μl 10μM正向引物(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.25中的一条)，0.2μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM each dNTP mixture(Takara公司)，2μl 10×PCR buffer，13.5μlH20，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。两组样品血清miRNA的表达量比值可用方程2-ΔG表示，其中ΔG＝CT group1-CT group2。以hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个miRNA作为markers对数据结果用Cluster 3.0进行聚类分析，可以看出健康对照者和病毒清除者聚类分不开(图1)，可见健康对照者和病毒清除者之间hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 这13个miRNA的表达无显著性区别；从图2可以看出用上述的13个miRNA进行聚类，HBV携带者和慢性乙肝患者聚类也分不开，可见HBV携带者和慢性乙肝病人之间这13个miRNA的表达也无显著性区别；从图3中可以看出用上述的13个miRNA进行聚类分析，健康对照者和病毒清除者、HBV携带者和慢性乙肝患者都能和慢性丙肝患者分开。因此将健康对照者和病毒清除者整合为对照组(N)，将HBV携带者和慢性乙肝患者整合为HBV组(HBV)。
实施例3样品重新整合并扩大样品量后用定量PCR方法验证实施例2中筛选出的一组miRNA并对这组miRNA在HBV阳性确诊过程中的应用及临床价值进行评估。
对100例对照组(50例健康对照者和50例病毒清除者)、75例HBV组(25例HBV携带者和50例慢性乙肝患者)和18例慢性丙肝组患者的血清进行微小核糖核酸的qRT-PCR检验。实验方法、qRT-PCR结果处理方法和聚类方法与实施例2相同。
qRT-PCR结果进一步证明健康对照者和病毒清除者之间、HBV携带者和慢性乙肝病人之间确实无明显区别。以hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个miRNA作为markers对数据结果用Cluster 3.0进行聚类分析，聚类结果见图4。从图4中可以看出，实验所用的193例血清样品可以被明显地分为3组：对照组(N)、慢性丙肝组(HCV)和HBV组(HBV)。
为了评估这13个miRNA在HBV疾病早期诊断中的诊断能力，本发明人又对对照组、HBV组、HCV组的real-time PCR结果进行风险评分，以每个miRNA表达量的5％或95％的参考区间为风险值，通过绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性。ROC分析结果见表2、3、4和图5、6。
表2显示，hsa-miR-375、hsa-miR-10a、hsa-miR-223(hsa-miR-122或hsa-miR-342-3p)、hsa-miR-423-5p以100％的AUC(ROC曲线下面积)将对照组和HBV组分开，表3显示hsa-miR-92a和hsa-miR-423-5p以99.6％的AUC将对照组和HCV组分开，而表4显示hsa-miR-375和hsa-miR-92a就可以将HBV组和HCV组分开。当用hsa-miR-375、hsa-miR-10a、hsa-miR-223和hsa-miR-423-5p 4个markers来区分对照组和HBV组时，AUC为99.9±0.1％，灵敏度为99.3％，特异性为98.8％(图5)。当用hsa-miR-92a、hsa-miR-423-5p 2个markers来区分对照组和HCV组时，AUC为99.6±0.4％，灵敏度为97.9％，特异性为99.4％(图6)。
表2区分对照组和HBV组的单个或多个miRNA的AUCs
表3区分对照组和HCV组的单个或多个miRNA的AUCs
表4区分HBV和HCV组的单个或多个miRNA的AUCs
在上述结果的基础上用miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423-5p和miR-99a 6个markers进行聚类分析，聚类分析结果见图7。图7显示，当用miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423-5p和miR-99a 6个markers进行聚类时，本发明人就能将对照组(N)、HBV组(HBV)和HCV组(HCV)3个组区分开来，160个对照组只有2个、135个HBV组中只有1个被错误的归类，而HCV组中没有一个被错误归类。
实施例4用定量PCR方法检测实施例3中筛选出的一组miRNA在HBV阳性的肝细胞癌样本中表达并对这组miRNA在HBV阳性的肝细胞癌检测过程中的应用及临床价值进行评估。
对65例HBV阳性的肝癌病人的血清进行微小核糖核酸的qRT-PCR检验。实验方法、qRT-PCR结果处理方法和聚类方法与实施例2、3相同。
对对照组、HBV组、HCV组和HBV-HCC组样品的real-time PCR结果也进行风险评分，以每个miRNA表达量的5％或95％的参考区间为风险值，通过绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性。ROC分析结果见表5、6和图8、9。
表5显示，miR-23b、miR-423-5p、miR-375、miR-23a和miR-342-3p以99.9％的AUC将对照组和HCC组分开，表6显示miR-10a和miR-92a将HBV组和HCC组分开。当用miR-23b、miR-423-5p、miR-375、miR-23a和miR-342-3p5个markers来区分对照组和HBV-HCC组时，AUC为99.9％±0.1％，灵敏度为96.9％，特异性为99.4％(图8)，而当用miR-10a和miR-125b区分HBV组和HBV-HCC组时，AUC为99.2％，灵敏度为98.5％，特异性为98.5％(图9)。
在上述结果的基础上对miR-23b、miR-423-5p、miR-375、miR-23a、miR-342-3p、miR-10a、miR-125b和miR-92a 8个markers进行聚类分析，聚类分析结果见图10。图10显示，当用miR-23b、miR-423-5p、miR-375、miR-23a、miR-342-3p、miR-10a、miR-125b和miR-92a 8个markers时，本发明人就能将HBV-HCC、HBV和对照组(N)3个组分开，160个对照组中只有4个、135个HBV组中只有2个被错误归类，而HBV-HCC组中没有一个被错误归类。
表5区分对照组和HBV阳性肝癌组的单个或多个miRNA的AUCs
表6区分HBV和HBV阳性肝癌组的单个或多个miRNA的AUCs
实施例5：用于检测血清miRNA的试剂盒的制备
用于检测HBV阳性及HBV阳性的肝细胞癌的血清miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程是基于Solexa技术和定量PCR技术所测结果，将下述引物组合：SEQ ID NO：1～26收集到PCR试剂盒(RT-PCR或Real-time PCR)中制备特定引物组合的HBV阳性及HBV阳性的肝细胞癌检测试剂盒。
所述试剂盒的具体组成(每份标本)如下：
PCR水13.9μl，10×buffer 2μl，MgCl2 1.2μl，dNTP 0.4μl，EvaGreen1μl，Taq酶0.3μl，正向引物0.1μl，反向引物0.1μl，cDNA 1μl。
所制备试剂盒的具体操作流程如下：
(1)收集受试者的血清样本，提取RNA后逆转录制备cDNA样品；(2)按照上述配方加样；(3)进行PCR反应，条件为95℃5min，95℃15s，60℃1min，40个循环。
所述试剂盒的价值在于以特定的miRNA引物组合检测血清miRNA表达量，可提高HBV阳性以及HBV阳性肝细胞癌检测的特异性、准确性，有助于该病的早期发现。因此该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治疗推上一个新高度。
实施例6：血清miRNA检测试剂盒的临床应用的验证
用制备的血清miRNA检测试剂盒对临床标本进行测定。临床研究的受试者HBV阳性30例、HBV阳性的肝细胞癌30例、对照组30例。
试剂盒的临床标本检测结果：
本发明所制备的试剂盒可同时测定hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13种miRNA的表达量。对临床标本测定结果见表7，从结果看出利用本发明所制备的试剂盒进行检测，能够显著性的检测出HBV阳性以及HBV阳性的肝细胞癌。
表7试剂盒的测定结果
说明书中出现的miR-122、miR-423-5p、miR-92a、let-7c、miR-23a、miR-23b、miR-223、miR-342-3p、miR-375、miR-99a、miR-150、miR-125b、miR-10a分别为hsa-miR-122、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a的简写。