一种转录因子免疫共沉淀（ChIP）试剂配方.pdf

摘要
申请专利号：	CN201711414087.7	申请日：	20171225
公开号：	CN108220391A	公开日：	20180629
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/6804	主分类号：	C12Q1/6804
申请人：	苏州同因生物科技有限公司
发明人：	李旦
地址：	215558 江苏省苏州市常熟高新技术开发区湖山路333号同济科技广场1幢2004
优先权：	CN201711414087A
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内容摘要

本发明涉及一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，包括甲醛交联、超声波破碎，免疫沉淀，洗脱、解交联，纯化富集DNA片段。该试剂配方采用甲醛固定活细胞和组织的方法，能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，有体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的优势。

权利要求书

1.一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，其特征在于，该配方包括以下处理步骤：步骤一：甲醛交联：在收集的组织样本中加入甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1wt％；37℃孵育10min后，再加入甘氨酸终止交联，使得甘氨酸的终浓度为125mM；37℃静置10min后用PBS缓冲液洗涤两遍；所述PBS缓冲液包括：200mMNaCl、3mMKCl、1mMCaCl、1mMMgCl、10mMNaHPO、1mMKHPO，所述PBS缓冲液的PH值为7.3；加入提取缓冲液A，在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除上层清液；所述提取缓冲液A包括：10mMTris-HCl、400mM蔗糖、0.1mMβ-ME、0.1mMPMSF和蛋白酶抑制剂；所述蛋白酶抑制剂包括AEBSF、Aprotinin、Bestatin、E-64、Leupeptin、PepstatinA；加入提取缓冲液B，在4℃下匀浆10000g中离心40min，去除上层清液；所述提取缓冲液B包括：10mMTris-HCl、0.6mM蔗糖、0.1mMβ-ME、0.1mMPMSF、10mMMgCl、1wt％TritonX-100和所述蛋白酶抑制剂；加入提取缓冲液C，在4℃下匀浆15000g中离心60min，去除上层清液；所述提取缓冲液C包括：10mMTris-HCl、800mM蔗糖、0.1mMβ-ME、0.1mMPMSF、10mMMgCl、2wt％TritonX-100和所述蛋白酶抑制剂；步骤二：超声波破碎：用超声波处理步骤一的产物，将DNA剪切成200～1000bp的片段；步骤三：免疫沉淀：将蛋白A琼脂糖珠用稀释缓冲液洗涤三次后重悬于所述稀释缓冲液中得到混合液A；所述稀释缓冲液包括：15mMTris-HCl、0.1mMEDTA、0.1mMPMSF、150mMNaCl、2wt％TritonX-100和所述蛋白酶抑制剂；所述混合液A包括所述蛋白A琼脂糖珠和所述稀释缓冲液；将步骤二的产物在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质；再加入所述混合液A，在4℃下轻轻晃动2h，在4℃下匀浆10000g中离心20min，除去上层清液，收集免疫沉淀；步骤四：洗脱：用洗脱液A洗涤所述免疫沉淀10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液A包括：15mMTris-HCl、2mMEDTA、150mMNaCl、1wt％TritonX-100、1wt％SDS；用洗脱液B洗涤10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液B包括：15mMTris-HCl、2mMEDTA、500mMNaCl、1wt％TritonX-100、1wt％SDS；用洗脱液C洗涤10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液C的成分包括：15mMTris-HCl、2mMEDTA、200mMLiCl、1wt％NP-40、1wt％脱氧胆酸钠；步骤五：解交联：加入NaCl溶液，使得NaCl的终浓度为0.2mM，65℃孵育过夜；步骤六：纯化富集DNA片段：加入纯化液,65℃温育1h，所述纯化液包括：1000mMTris-HCl、500mMEDTA、10mg/ml蛋白酶K；加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液；所述氯仿醇溶液包括：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方。

背景技术

染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的ChIP-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方。

为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，该配方包括以下处理步骤：

步骤一：甲醛交联：

在收集的组织样本中加入甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1wt％；37℃孵育10min后，再加入甘氨酸终止交联，使得甘氨酸的终浓度为125mM；37℃静置10min后用PBS缓冲液洗涤两遍得到混合物A；PBS缓冲液包括：200mM NaCl、3mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4,PBS缓冲液的PH值为7.3；

在混合物A中加入提取缓冲液A，在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除上层清液后得到混合物B；提取缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、400mM蔗糖、0.1mMβ-ME、0.1mM PMSF和蛋白酶抑制剂；蛋白酶抑制剂包括AEBSF、Aprotinin、Bestatin、E-64、Leupeptin、Pepstatin A；

在混合物B中加入提取缓冲液B，在4℃下匀浆10000g中离心40min，去除上层清液后得到混合物C；提取缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.6mM蔗糖、0.1mMβ-ME、0.1mM PMSF、10mM MgCl2、1wt％Triton X-100和蛋白酶抑制剂；

在混合物C中加入提取缓冲液C，在4℃下匀浆15000g中离心60min，去除上层清液后得到混合物D；提取缓冲液C包括：10mM Tris-HCl、800mM蔗糖、0.1mMβ-ME、0.1mM PMSF、10mM MgCl2、2wt％Triton X-100和蛋白酶抑制剂；

步骤二：超声波破碎：

用超声波处理混合物D，将DNA剪切成200～1000bp的片段；

步骤三：免疫沉淀：

将步骤三的产物在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质后得到混合物E；

将蛋白A琼脂糖珠用稀释缓冲液洗涤三次后重悬于稀释缓冲液中，再加入混合物E，在4℃下轻轻晃动2h后得到混合物F；稀释缓冲液包括：15mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.1mM PMSF、150mM NaCl、2wt％Triton X-100和蛋白酶抑制剂；

将混合物F在4℃下匀浆10000g中离心20min，除去上清，收集免疫沉淀；

步骤四：洗脱：

用洗脱液A洗涤免疫沉淀10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物A；洗脱液A包括：15mM Tris-HCl、2mM EDTA、150mM NaCl、1wt％Triton X-100、1wt％SDS；

用洗脱液B洗涤沉淀物A 10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物B；洗脱液B包括：15mM Tris-HCl、2mM EDTA、500mM NaCl、1wt％Triton X-100、1wt％SDS；

用洗脱液C洗涤沉淀物B 10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物C；洗脱液C的成分包括：15mM Tris-HCl、2mM EDTA、200mM LiCl、1wt％ NP-40、1wt％脱氧胆酸钠；

步骤五：解交联：

将沉淀物C加入NaCl溶液中使得NaCl的终浓度为0.2mM，65℃孵育过夜后得到混合物G；

步骤六：纯化富集DNA片段：

在混合物G中加入纯化液,65℃温育1h得到混合物H，纯化液包括：1000mM Tris-HCl、500mM EDTA、10mg/ml蛋白酶K；

在混合物H中加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液得到混合物H；氯仿醇溶液的成分包括：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；

在混合物H中加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。

本发明的有益成果为：本发明提供了一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，包括甲醛交联、超声波破碎，免疫沉淀，洗脱、解交联，纯化富集DNA片段。该试剂配方采用甲醛固定活细胞和组织的方法，能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，有体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的优势。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：

实施例1：本实施例具体介绍了染色质免疫沉淀技术(ChIP)的原理，如下：

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。

(1)细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1％，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

(2)染色质断裂

交联后的染色质可被超声波切成400～600bp的片段(用琼脂糖凝胶电泳检测)，以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

(3)染色质免疫沉淀

Input对照：在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。

Beads选择：利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。

抗体选择：染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。

阳性与阴性对照：阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。

(4)交联反应的逆转和DNA的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高，有利于下一步PCR等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质，还交联蛋白质-蛋白质，所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有机相中的蛋白质，进行分析。

(5)DNA的鉴定

最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点，所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同。而且启动子区域多富含CG的序列，其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果。

实施例2：本实施例具体说明了转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方的处理步骤，如下：

步骤一：甲醛交联：

步骤二：超声波破碎：

用超声波处理混合物D，将DNA剪切成200～1000bp的片段；

步骤三：免疫沉淀：

将步骤三的产物在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质后得到混合物E；

将混合物F在4℃下匀浆10000g中离心20min，除去上清，收集免疫沉淀；

步骤四：洗脱：

用洗脱液A洗涤免疫沉淀10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物A；洗脱液A包括：15mM Tris-HCl、2mM EDTA、150mM NaCl、1wt％Triton X-100、1wt％SDS；

用洗脱液B洗涤沉淀物A 10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物B；洗脱液B包括：15mM Tris-HCl、2mM EDTA、500mM NaCl、1wt％Triton X-100、1wt％SDS；

用洗脱液C洗涤沉淀物B 10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物C；洗脱液C的成分包括：15mM Tris-HCl、2mM EDTA、200mM LiCl、1wt％NP-40、1wt％脱氧胆酸钠；

步骤五：解交联：

将沉淀物C加入NaCl溶液中使得NaCl的终浓度为0.2mM，65℃孵育过夜后得到混合物G；

步骤六：纯化富集DNA片段：

在混合物G中加入纯化液,65℃温育1h得到混合物H，纯化液包括：1000mMTris-HCl、500mM EDTA、10mg/ml蛋白酶K；

在混合物H中加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。

以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711414087.7 (22)申请日 2017.12.25 (71)申请人苏州同因生物科技有限公司地址 215558 江苏省苏州市常熟高新技术开发区湖山路333号同济科技广场1幢 2004 (72)发明人李旦 (51)Int.Cl. C12Q 1/6804(2018.01) (54)发明名称一种转录因子免疫共沉淀（ChIP）试剂配方 (57)摘要本发明涉及一种转录因子免疫共沉淀 (ChIP)试剂配方，包括甲醛交联、超声波破碎，免疫沉淀，洗脱、解。

2、交联，纯化富集DNA片段。该试剂配方采用甲醛固定活细胞和组织的方法，能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，有体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的优势。权利要求书1页说明书5页 CN 108220391 A 2018.06.29 CN 108220391 A 1.一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，其特征在于，该配方包括以下处理步骤：步骤一：甲醛交联：在收集的组织样本中加入甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1wt； 37孵育10min后，再加入甘氨酸终止交联，使得甘氨酸的终浓度为125mM； 37静置10min后用PBS缓冲液。

3、洗涤两遍；所述PBS缓冲液包括： 200mM NaCl、 3mM KCl、 1mM CaCl2、 1mM MgCl2、 10mM Na2HPO4、 1mM KH2PO4，所述PBS缓冲液的PH值为7.3；加入提取缓冲液A，在4下匀浆10000g中离心20min，去除上层清液；所述提取缓冲液A 包括： 10mM Tris-HCl、 400mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF和蛋白酶抑制剂；所述蛋白酶抑制剂包括AEBSF、 Aprotinin、 Bestatin、 E-64、 Leupeptin、 Pepstatin A；加入提取缓冲液B，在4下匀浆1000。

4、0g中离心40min，去除上层清液；所述提取缓冲液B 包括： 10mM Tris-HCl、 0.6mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF、 10mM MgCl2、 1wtTritonX-100 和所述蛋白酶抑制剂；加入提取缓冲液C，在4下匀浆15000g中离心60min，去除上层清液；所述提取缓冲液C 包括： 10mM Tris-HCl、 800mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF、 10mM MgCl2、 2wtTriton X- 100和所述蛋白酶抑制剂；步骤二：超声波破碎：用超声波处理步骤一的产物，将DNA剪切成2001000bp的片。

5、段；步骤三：免疫沉淀：将蛋白A琼脂糖珠用稀释缓冲液洗涤三次后重悬于所述稀释缓冲液中得到混合液A；所述稀释缓冲液包括： 15mM Tris-HCl、 0.1mM EDTA、 0.1mM PMSF、 150mM NaCl、 2wtTriton X-100和所述蛋白酶抑制剂；所述混合液A包括所述蛋白A琼脂糖珠和所述稀释缓冲液；将步骤二的产物在4下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质；再加入所述混合液 A，在4下轻轻晃动2h，在4下匀浆10000g中离心20min，除去上层清液，收集免疫沉淀；步骤四：洗脱：用洗脱液A洗涤所述免疫沉淀10min，在4下匀浆15。

6、000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液A包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 150mM NaCl、 1wtTriton X-100、 1wtSDS；用洗脱液B洗涤10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液B包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 500mM NaCl、 1wtTriton X-100、 1wtSDS；用洗脱液C洗涤10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液C的成分包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 200mM LiCl、 1w。

7、tNP-40、 1wt脱氧胆酸钠；步骤五：解交联：加入NaCl溶液，使得NaCl的终浓度为0.2mM， 65孵育过夜；步骤六：纯化富集DNA片段：加入纯化液,65温育1h，所述纯化液包括： 1000mM Tris-HCl、 500mM EDTA、 10mg/ml蛋白酶K；加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液；所述氯仿醇溶液包括： Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。权利要求书 1/1 页 2 CN 108220391 A 2 一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方技术。

8、领域 0001 本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方。背景技术 0002 染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种。

9、共价修饰与基因表达的关系。而且， CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与基因芯片相结合建立的ChIP-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点； RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。发明内容 0003 有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的一种转录因子免疫共沉淀 (ChIP)试剂配方。 0004 为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：一种转录因子免疫共沉淀。

10、 (ChIP)试剂配方，该配方包括以下处理步骤： 0005 步骤一：甲醛交联： 0006 在收集的组织样本中加入甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1wt； 37孵育10min 后，再加入甘氨酸终止交联，使得甘氨酸的终浓度为125mM； 37静置10min后用PBS缓冲液洗涤两遍得到混合物A； PBS缓冲液包括： 200mM NaCl、 3mM KCl、 1mM CaCl2、 1mM MgCl2、 10mM Na2HPO4、 1mM KH2PO4,PBS缓冲液的PH值为7.3； 0007 在混合物A中加入提取缓冲液A，在4下匀浆10000g中离心20min，去除上层清液后得到混合物B。

11、；提取缓冲液A包括： 10mM Tris-HCl、 400mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF和蛋白酶抑制剂；蛋白酶抑制剂包括AEBSF、 Aprotinin、 Bestatin、 E-64、 Leupeptin、 Pepstatin A； 0008 在混合物B中加入提取缓冲液B，在4下匀浆10000g中离心40min，去除上层清液后得到混合物C；提取缓冲液B包括： 10mM Tris-HCl、 0.6mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF、 10mM MgCl2、 1wtTriton X-100和蛋白酶抑制剂； 0009 在混合物C中加入提取缓。

12、冲液C，在4下匀浆15000g中离心60min，去除上层清液后得到混合物D；提取缓冲液C包括： 10mM Tris-HCl、 800mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF、 10mM MgCl2、 2wtTriton X-100和蛋白酶抑制剂；说明书 1/5 页 3 CN 108220391 A 3 0010 步骤二：超声波破碎： 0011 用超声波处理混合物D，将DNA剪切成2001000bp的片段； 0012 步骤三：免疫沉淀： 0013 将步骤三的产物在4下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质后得到混合物E； 0014 将蛋白A琼脂糖珠用稀释缓。

13、冲液洗涤三次后重悬于稀释缓冲液中，再加入混合物 E，在4下轻轻晃动2h后得到混合物F；稀释缓冲液包括： 15mM Tris-HCl、 0.1mM EDTA、 0.1mM PMSF、 150mM NaCl、 2wtTriton X-100和蛋白酶抑制剂； 0015 将混合物F在4下匀浆10000g中离心20min，除去上清，收集免疫沉淀； 0016 步骤四：洗脱： 0017 用洗脱液A洗涤免疫沉淀10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物A；洗脱液A包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 150mM NaCl、 1wtTriton X-10。

14、0、 1wtSDS； 0018 用洗脱液B洗涤沉淀物A 10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物B；洗脱液B包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 500mM NaCl、 1wtTriton X-100、 1wtSDS； 0019 用洗脱液C洗涤沉淀物B 10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物C；洗脱液C的成分包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 200mM LiCl、 1wt NP-40、 1wt脱氧胆酸钠； 0020 步骤五：解交联： 0021 将沉淀物C加入NaCl溶液中使得NaCl的终浓。

15、度为0.2mM， 65孵育过夜后得到混合物G； 0022 步骤六：纯化富集DNA片段： 0023 在混合物G中加入纯化液,65温育1h得到混合物H，纯化液包括： 1000mM Tris- HCl、 500mM EDTA、 10mg/ml蛋白酶K； 0024 在混合物H中加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液得到混合物H；氯仿醇溶液的成分包括： Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1； 0025 在混合物H中加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。 0026 本发明的有益成果为：本发明提供了一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，。

16、包括甲醛交联、超声波破碎，免疫沉淀，洗脱、解交联，纯化富集DNA片段。该试剂配方采用甲醛固定活细胞和组织的方法，能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，有体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的优势。具体实施方式 0027 为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下： 0028 实施例1：本实施例具体介绍了。

17、染色质免疫沉淀技术(ChIP)的原理，如下： 0029 染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染说明书 2/5 页 4 CN 108220391 A 4 色质免疫沉淀，交联反应的逆转， DNA的纯化以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。 0030 (1)细胞。

18、固定 0031 甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响 ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。 0032 (2)染色质断裂 0033 交联后的染色质可被超声波切成400600bp的片。

19、段(用琼脂糖凝胶电泳检测)，以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 0034 (3)染色质免疫沉淀 0035 Input对照：在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联， DNA纯化，。

20、以及最后的PCR或其他方法检测。 0036 Beads选择：利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。 0037 抗体选择：染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的。

21、结果。 0038 阳性与阴性对照：阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。 0039 (4)交联反应的逆转和DNA的纯化 0040 用不含DNase的RNase和Proteinase K， 65保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。 DNA纯化柱纯化DNA的质量高，有利于下一步PCR 等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质，还交联蛋白质-蛋白质，所以还可以。

22、对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有机相中的蛋白质，进行分析。 0041 (5)DNA的鉴定 0042 最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点，所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能说明书 3/5 页 5 CN 108220391 A 5 不同。而且启动子区域多富含CG的序列，其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果。 0043 实施例2：本实施例具体说明了转录因子免疫共沉淀(。

23、ChIP)试剂配方的处理步骤，如下： 0044 步骤一：甲醛交联： 0045 在收集的组织样本中加入甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1wt； 37孵育10min 后，再加入甘氨酸终止交联，使得甘氨酸的终浓度为125mM； 37静置10min后用PBS缓冲液洗涤两遍得到混合物A； PBS缓冲液包括： 200mM NaCl、 3mM KCl、 1mM CaCl2、 1mM MgCl2、 10mM Na2HPO4、 1mM KH2PO4,PBS缓冲液的PH值为7.3； 0046 在混合物A中加入提取缓冲液A，在4下匀浆10000g中离心20min，去除上层清液后得到混合物B；提取缓冲。

24、液A包括： 10mM Tris-HCl、 400mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF和蛋白酶抑制剂；蛋白酶抑制剂包括AEBSF、 Aprotinin、 Bestatin、 E-64、 Leupeptin、 Pepstatin A； 0047 在混合物B中加入提取缓冲液B，在4下匀浆10000g中离心40min，去除上层清液后得到混合物C；提取缓冲液B包括： 10mM Tris-HCl、 0.6mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF、 10mM MgCl2、 1wtTriton X-100和蛋白酶抑制剂； 0048 在混合物C中加入提取缓冲液C，在。

25、4下匀浆15000g中离心60min，去除上层清液后得到混合物D；提取缓冲液C包括： 10mM Tris-HCl、 800mM蔗糖、 0.1mM -ME、 0.1mM PMSF、 10mM MgCl2、 2wtTriton X-100和蛋白酶抑制剂； 0049 步骤二：超声波破碎： 0050 用超声波处理混合物D，将DNA剪切成2001000bp的片段； 0051 步骤三：免疫沉淀： 0052 将步骤三的产物在4下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质后得到混合物E； 0053 将蛋白A琼脂糖珠用稀释缓冲液洗涤三次后重悬于稀释缓冲液中，再加入混合物 E，在4下轻轻晃动。

26、2h后得到混合物F；稀释缓冲液包括： 15mM Tris-HCl、 0.1mM EDTA、 0.1mM PMSF、 150mM NaCl、 2wtTriton X-100和蛋白酶抑制剂； 0054 将混合物F在4下匀浆10000g中离心20min，除去上清，收集免疫沉淀； 0055 步骤四：洗脱： 0056 用洗脱液A洗涤免疫沉淀10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物A；洗脱液A包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 150mM NaCl、 1wtTriton X-100、 1wtSDS； 0057 用洗脱液B洗涤沉淀物A 10min，。

27、在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物B；洗脱液B包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 500mM NaCl、 1wtTriton X-100、 1wtSDS； 0058 用洗脱液C洗涤沉淀物B 10min，在4下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物C；洗脱液C的成分包括： 15mM Tris-HCl、 2mM EDTA、 200mM LiCl、 1wtNP-40、 1wt脱氧胆酸钠； 0059 步骤五：解交联： 0060 将沉淀物C加入NaCl溶液中使得NaCl的终浓度为0.2mM， 65孵育过夜后得到混合物G； 0061 步骤六：纯化。

28、富集DNA片段： 0062 在混合物G中加入纯化液,65温育1h得到混合物H，纯化液包括： 1000mMTris- 说明书 4/5 页 6 CN 108220391 A 6 HCl、 500mM EDTA、 10mg/ml蛋白酶K； 0063 在混合物H中加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液得到混合物H；氯仿醇溶液的成分包括： Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1； 0064 在混合物H中加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。 0065 本发明的有益成果为：本发明提供了一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，包括甲醛交联、超声波破碎，免疫沉淀，洗脱、解交联，纯化富集DNA片段。该试剂配方采用甲醛固定活细胞和组织的方法，能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，有体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的优势。 0066 以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。说明书 5/5 页 7 CN 108220391 A 7 。

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