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1、(10)申请公布号 CN 102031281 A (43)申请公布日 2011.04.27 CN 102031281 A *CN102031281A* (21)申请号 201010550372.3 (22)申请日 2010.11.19 C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 上海市疾病预防控制中心 地址 200336 上海市长宁区中山西路 1380 号 (72)发明人 金汇明 许学斌 (74)专利代理机构 上海浦东良风专利代理有限 责任公司 31113 代理人 张劲风 (54) 发明名称 沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒、 制 备和应用 (57) 摘要 本发明涉及肠道病原菌。
2、中沙门菌与志贺菌的 同步分离和鉴定方法， 主要解决现有沙门菌和志 贺菌分离方法存在的漏检率高、 鉴定步骤繁复且 成本较高、 筛选结果不够直观的技术难题。 试剂盒 包括 ： 1） 通用型非选择性增菌液 ： 胰酪胨大豆胨 肉汤 ； 2） 10 倍浓缩通用型非选择性增菌液 ： 10 倍 浓缩胰酪胨大豆胨肉汤 ； 3） 沙门菌增菌液 ： 亚硒 酸盐磺绿 - 磺胺增菌液 ； 4） 志贺菌增菌液 ； 5） 木 糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 ； 6） 沙门菌显色琼 脂平板 ； 7） 沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管 ： 包括 第一试管和第二试管 ； 8） 硫化氢滤纸条 ； 9） 吲哚 滤纸条。利用选择性分离培养基。
3、生长相应的典型 菌落形态、 简易生化和特异性酶 - 底物反应组合 试验鉴定 2 种肠道病原菌。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 6 页 CN 102031284 A1/3 页 2 1. 沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 包括 ： 1） 、 通用型非选择性增菌液 ： 胰酪胨大豆胨肉汤 ； 2） 、 10 倍浓缩通用型非选择性增菌液 ： 10 倍浓缩胰酪胨大豆胨肉汤 ； 3） 、 沙门菌增菌液 ： 亚硒酸盐磺绿 - 磺胺增菌液 ； 4） 、 志贺菌增菌液 ； 5） 、 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 ； 6） 、。
4、 沙门菌显色琼脂平板 ； 7） 、 沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管 ： 包括第一试管和第二试管 ； 8） 、 硫化氢滤纸条 ； 9） 、 吲哚滤纸条。 2. 根据权利要求 1 所述的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 其特征是 ： 所述的 胰酪胨大豆胨肉汤为 ： 胰化酪蛋白胨 17.0g， 植物蛋白胨 3.0g， 氯化钠 5.0g， K2HPO4 2.5g， 葡 萄糖 2.5g， 蒸馏水 1000ml。 3. 根据权利要求 1 所述的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 其特征是 ： 所述 的亚硒酸盐磺绿 - 磺胺增菌液 ： 酵母浸出物 5.0g， 蛋白胨 5.0g， D- 甘露醇。
5、 5.0g， 牛磺酸 钠 1.0g， 磺胺抑制剂 0.5g， 亚硒酸钠 4.0g， KH2PO42.65g， K2HPO41.02g， 磺绿 5.0mg， 蒸馏水 1000ml。 4. 根据权利要求 1 所述的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 其特征是 ： 所述 的志贺菌增菌液配方 ： 胰化酪蛋白胨 20.0g， 氯化钠 5.0g， KH2PO42.0g， K2HPO42.0g， 葡萄糖 1.0g， 新生霉素 0.05g， 吐温 -80 1.5mL， 蒸馏水 1000ml。 5. 根据权利要求 1 所述的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 其特征是 ： 所述的 沙门菌显色琼脂平板。
6、 ： 琼脂 17.0g， 胰化酪蛋白胨 10.0g， 蛋白胨 10.0g， 酵母浸出物 3.0g， 氯化钠 5.0g， 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 吡喃半乳糖苷 250mg， 辛酸盐 250mg， 磺胺抑制剂 0.5g， 蒸馏水 1000ml。 6. 根据权利要求 1 所述的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 其特征是 ： 所述 的第一试管 ： 琼脂 14g， 牛肉膏 2g， 酵母浸出粉 2g， 葡萄糖 1g， 蛋白胨 15g， 甘露醇 10g， 尿素 10g， 重量百分浓度为 0.2% 麝香草酚蓝溶液 10ml， 重量百分浓度为 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12.5ml。
7、， 重量百分浓度为 0.2% 甲酚红溶液 4ml， 蒸馏水 1000ml ； 第 二 试 管 ： 琼 脂 3g， 胰 蛋 白 胨 10g， 蛋 白 胨 10g， 氯 化 钠 5g， 重 量 百 分 浓 度 为 10%Na2HPO42.5ml， 蔗糖 10g， 重量百分浓度为 1% 硫代硫酸钠溶液 2.5ml， 重量百分浓度为 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 5ml， 蒸馏水 1000ml。 7. 权利要求 1 所述的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒的制备方法， 其特征是 ： 通用型非选择性增菌液制备 ： 将胰化酪蛋白胨 17.0g， 植物蛋白胨 3.0g， 氯化钠 5.0g， K2HPO4 。
8、2.5g， 葡萄糖2.5g， 蒸馏水1000ml， 加热溶解后矫正pH至7.30.2， 经加热加压灭菌 后备用 ； 10 倍浓缩通用型非选择性增菌液制备 ： 将胰化酪蛋白胨 17.0g， 植物蛋白胨 3.0g， 氯化 钠 5.0g， K2HPO4 2.5g， 葡萄糖 2.5g， 蒸馏水 100ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.30.2， 经加热 加压灭菌后备用 ； 沙门菌增菌液的制备 ： 将酵母浸出物 5.0g， 蛋白胨 5.0g， D- 甘露醇 5.0g， 牛磺酸钠 权 利 要 求 书 CN 102031281 A CN 102031284 A2/3 页 3 1.0g， 磺胺抑制剂 0.。
9、5g， 亚硒酸钠 4.0g， KH2PO42.65g， K2HPO41.02g， 磺绿 5.0mg， 蒸馏水 1000ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.20.2， 煮沸 3 次后分装无菌试管备用 ； 志贺菌增菌液制备 ： 将胰化酪蛋白胨 20.0g， 氯化钠 5.0g， KH2PO42.0g， K2HPO42.0g， 葡萄 糖1.0g， 新生霉素0.05g， 吐温-80 1.5mL， 蒸馏水1000ml， 加热溶解后矫正pH至7.00.2， 经加热加压灭菌后冷却至 45 -50添加新生霉素溶液后混匀分装无菌试管备用 ； 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板制备 ： 将琼脂 13.5g， 乳糖 7.。
10、5g， 蔗糖 7.5g， 硫代硫酸 钠 6.8g， L- 赖氨酸 5.0g， 氯化钠 5.0g， 木糖 3.5g， 酵母浸出物 3.0g， 脱氧胆酸钠 2.5g， 枸橼 酸铁铵 0.8g， 酚红 0.08g， 蒸馏水 1000ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.50.2， 经加温加压灭菌 后倾注无菌平皿置冰箱中备用 ； 沙门菌显色琼脂平板制备 ： 取琼脂粉 17.0g， 胰化酪蛋白胨 10.0g， 蛋白胨 10.0g， 酵母 浸出物 3.0g， 氯化钠 5.0g 置 990ml 蒸馏水中加热溶解煮沸 2 次后， 称取 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 -D- 吡喃半乳糖苷 250mg 溶。
11、解于 4mlTri.HCl （pH8.0） ， 继续称取辛酸盐 250mg 溶解于 4ml 蒸馏水中， 再称取磺胺吡啶 0.5g 溶解于 2ml0.01 摩尔浓度 NaOH 中， 待加热培养基冷却 至 50一并加入后混匀， 调整 pH 至 7.2 （按冷却至 25后测量值为标准） ， 倾注无菌平板置 冰箱中， 备用 ； 沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管制备 ： 第一试管配制 ： 1） 、 取琼脂14.0g、 牛肉膏2.0g及蒸馏水1000ml， 混合后加热溶解， 并用数层纱布过滤， 2） 、 再取酵母浸出粉 2.0g、 葡萄糖 1.0g、 蛋白胨 15.0g、 甘露醇 10.0g 及尿素 10。
12、.0g， 混 入已溶解的琼脂中， 充分摇匀， 使全部溶解， 再加入重量百分浓度为 15% 氢氧化钠 1.5ml， 矫 正 pH 至 7.1， 3） 、 然后加入指示剂重量百分浓度为 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12.5ml、 重量百分浓度为 0.2% 甲酚红溶液 4ml、 重量百分浓度为 0.2% 麝香草酚蓝溶液 10ml， 4） 、 混合后， 充分摇匀， 分装于 13100mm 的试管内， 5） 、 置高压灭菌器内灭菌， 6） 、 灭菌后， 制成斜面， 待凝固后， 置于冰箱中备用 ； 第二试管配制 ： 1） 、 取琼脂 3.0g， 加入 1000ml 的蒸馏水中， 加热溶解， 并用数层纱布过。
13、滤， 2） 、 再取胰化酪蛋白胨 10.0g、 蛋白胨 10.0g、 氯化钠 5.0g、 重量百分浓度为 10% Na2HPO42.5ml、 蔗糖 10.0g 及硫代硫酸钠溶液 2.5ml， 混合后， 加入已溶解的琼脂中， 充分摇 匀， 使全部溶解， 再加入重量百分浓度为 15% 氢氧化钠溶液 1.5ml， 矫正 pH 至 7.6， 3） 、 溴麝香草酚蓝的配制 ： 取溴麝香草酚蓝 0.2g、 N/10 氢氧化钠溶液 5ml 及蒸馏水 95ml， 混合后放在棕色瓶中备用， 4） 、 加重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝5ml， 充分摇匀， 分装于13100mm的试管内， 5） 、 置高压灭菌器。
14、内灭菌， 取出后， 置于冰箱中备用 ； 硫化氢滤纸条的制备 ： 选取细薄的滤纸剪成 350mm 的长条， 浸在饱和的醋酸铅溶液 中， 取出后放于平皿中， 置 56烘箱中烤干备用 ； 吲哚滤纸条的制备 ： 选取细薄的滤纸剪成 350mm 的长条浸于对二甲氨基苯甲醛 5.0g、 甲醇50ml和磷酸10ml的混合液中， 取出后放于平皿中， 置56烘箱中烤干即取出， 冷 权 利 要 求 书 CN 102031281 A CN 102031284 A3/3 页 4 却至室温备用。 8. 权利要求 1 所述试剂盒用于血液中沙门菌和志贺菌的筛选。 9. 权利要求 1 所述试剂盒用于粪便中沙门菌和志贺菌的筛选。
15、。 10. 权利要求 1 所述试剂盒用于水中沙门菌和志贺菌的筛选。 11. 权利要求 1 所述试剂盒用于食品中沙门菌和志贺菌的筛选。 权 利 要 求 书 CN 102031281 A CN 102031284 A1/6 页 5 沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒、 制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及肠道病原菌中沙门菌与志贺菌的同步分离和鉴定方法， 特别涉及利用 选择性分离培养基生长相应的典型菌落形态、 简易生化和特异性酶 - 底物反应组合试验鉴 定 2 种肠道病原菌的试剂盒和使用方法。 背景技术 0002 现阶段使用的沙门菌、 志贺菌常规分离方法在实际工作中使用传统分离培养基的 批。
16、间质控要求繁琐、 敏感性和特异性低， 对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂 材料的费用昂贵。中国专利申请 200810047994.7 公开了 “一种同时快速检测沙门菌和志 贺菌的方法” ， 该发明属于食源性致病菌的快速检测技术， 具体说是一种对沙门菌和志贺菌 同时进行检测的环介导等温 DNA 扩增 （LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION， LAMP） 检测方法。包括由样品处理试剂、 LAMP 反应试剂、 BST DNA 聚合酶的大片段、 琼脂糖、 溴酚 蓝上样缓冲溶液、 溴化乙锭溶液组成的试剂的配制， 以及扩增产物的检测和沉淀产生的检 测程序。其。
17、步骤是 ： 首先设计特异性引物 ； 其次是提取样品 DNA ； 第三是配制反应体系。该 法较之目前采用的传统细菌培养方法、 免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简 单、 快速且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检 测。但是该方法筛选病原菌还存在一定局限性， 即筛选到的阳性结果可能无法通过细菌学 方法分离到 ； 也可能因为存在死菌而获得假阳性结果 ； 另外， 需设计特异性引物及提取 DNA 步骤较为复杂， 筛选结果判断还不够直观。本发明是基于传统细菌学技术简化， 经提炼、 加 入创新材料组合成的检测程序， 包括对样品的预处理和增值， 使用专一性、 选择性平板分离。
18、 出沙门菌和志贺菌的典型菌落， 结合简易生化和特异性酶 - 底物反应组合试验同时鉴定沙 门菌和志贺菌的试剂盒和筛选方法， 较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖 生化鉴定为主的方法更具有综合成本低、 操作简单、 快速、 无需依赖特殊仪器且有特异性、 准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便 （或者粪便拭子） 、 食品、 环境水样等多种增菌标 本中沙门菌、 志贺菌的同步分离和鉴定。更在原理设计、 操作人员与实验室要求方面和分 子生物学方法有本质的区别， 且筛检的方位更为广泛、 针对性更强， 所以与中国专利申请 200810047994.7 不存在相似性与可比性。 发明内容 0003 本发明的。
19、目的是提供一种一次可同步分离沙门菌和志贺菌并利用生化和酶反应 试验鉴定的沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒、 制备和应用。 主要解决现有沙门菌和 志贺菌分离方法存在的漏检率高、 鉴定步骤繁复且成本较高、 筛选结果不够直观的技术难 题。本发明用 2 种不同选择性增菌液及专一性的选择性分离平板配合简单的糖生化发酵反 应模式和细菌特异性酶 - 底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验， 达到 对沙门菌和志贺菌同步筛选分离和简易鉴定的效果。 0004 本发明的技术方案为 ： 沙门菌和志贺菌同步分离、 鉴定的试剂盒， 包括 ： 说 明 书 CN 102031281 A CN 1020312。
20、84 A2/6 页 6 1、 通用型非选择性增菌液 ： 胰酪胨大豆胨肉汤 （TSB） 。成分 ： 胰化酪蛋白胨 17.0g， 植 物蛋白胨 3.0g， 氯化钠 5.0g， K2HPO4 2.5g， 葡萄糖 2.5g， 蒸馏水 1000ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.30.2（按冷却至 25后测量值为标准） 。经 15 磅压力 15 分钟 （121） 灭菌后分装 225mL/ 瓶备用。 0005 2、 10倍浓缩通用型非选择性增菌液 ： 胰酪胨大豆胨肉汤 （TSB） 。 成分 ： 胰化酪蛋白 胨 17.0g， 植物蛋白胨 3.0g， 氯化钠 5.0g， K2HPO4 2.5g， 葡萄糖 2。
21、.5g， 蒸馏水 100ml， 加热溶 解后矫正 pH 至 7.30.2（按冷却至 25后测量值为标准） 。经压力 15 磅 15 分钟 （121） 灭菌后分装 10mL/ 瓶备用。 0006 3、 沙门菌增菌液 ： 亚硒酸盐磺绿 - 磺胺增菌液 （SBG） 。成分 ： 酵母浸出物 5.0g， 蛋 白胨 5.0g， D- 甘露醇 5.0g， 牛磺酸钠 1.0g， 磺胺抑制剂 0.5g， 亚硒酸钠 4.0g， KH2PO42.65g， K2HPO41.02g， 磺绿 5.0mg， 蒸馏水 1000ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.20.2（按冷却至 25 后测量值为标准） 。煮沸 3 次后分。
22、装 9mL 无菌试管备用。 0007 4、 志 贺 菌 增 菌 液 ： 成 分 ： 胰 化 酪 蛋 白 胨 20.0g， 氯 化 钠 5.0g， KH2PO42.0g， K2HPO42.0g， 葡萄糖1.0g， 新生霉素0.05g， 吐温-80 1.5mL， 蒸馏水1000ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.00.2（按冷却至 25后测量值为标准） 。经 15 磅压力 15 分钟 （121） 灭菌后冷 却至 45 -50添加新生霉素溶液后混匀分装 9mL 无菌试管备用。 0008 5、 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） ： 成分 ： 琼脂 13.5g， 乳糖 7.5g， 蔗糖 7.5。
23、g， 硫代硫酸钠 6.8g， L- 赖氨酸 5.0g， 氯化钠 5.0g， 木糖 3.5g， 酵母浸出物 3.0g， 脱氧胆 酸钠 2.5g， 枸橼酸铁铵 0.8g， 酚红 0.08g， 蒸馏水 1000ml， 加热溶解后矫正 pH 至 7.50.2 （按冷却至 25后测量值为标准） 。经 15 磅压力 15 分钟 （121） 灭菌后倾注无菌平皿置冰 箱中， 备用。 0009 6、 沙门菌显色琼脂平板 （CAS） ： 成分 ： 琼脂 17.0g， 胰化酪蛋白胨 10.0g， 蛋白胨 10.0g， 酵母浸出物 3.0g， 氯化钠 5.0g， 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 吡喃半乳糖。
24、苷 250mg， 辛酸盐250mg， 磺胺吡啶0.5g， 蒸馏水1000ml。 配制 ： 取琼脂粉17.0g、 胰化酪蛋白胨10.0g、 蛋白胨 10.0g、 酵母浸出物 3.0g、 氯化钠 5.0g 置 990ml 蒸馏水中加热溶解煮沸 2 次后， 称取 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 吡喃半乳糖苷 250mg 溶解于 4mlTri.HCl（pH8.0） ， 继续称取 辛酸盐 250mg 溶解于 4ml 蒸馏水中， 再称取磺胺吡啶 0.5g 溶解于 2ml0.01 摩尔浓度 NaOH 中， 待加热培养基冷却至 50一并加入后混匀， 调整 pH 至 7.2（按冷却至 25后测量值为。
25、 标准） 。倾注无菌平板置冰箱中， 备用。 0010 7、 沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管配方 ： 第一试管 ： 琼脂 14.0g， 牛肉膏 2.0g， 酵母浸出物 2.0g， 葡萄糖 1.0g， 蛋白胨 15.0g， 甘 露醇 10.0g， 尿素 10.0g， 重量百分浓度为 0.2% 麝香草酚蓝溶液 10ml， 重量百分浓度为 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12.5ml， 重量百分浓度为 0.2% 甲酚红溶液 4ml， 蒸馏水 1000ml。 0011 第一试管配制 ： 1） 、 取琼脂 14.0g、 牛肉膏 2.0g 及蒸馏水 1000ml， 混合后加热溶解， 并用数层纱布过 滤 ； 2。
26、） 、 再取酵母浸出粉 2.0g、 葡萄糖 1.0g、 蛋白胨 15.0g、 甘露醇 10.0g 及尿素 10.0g， 混 入已溶解的琼脂中。 充分摇匀， 使全部溶解。 再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠约1.5ml， 矫正 pH 至 7.1（按冷却至 25后测量值为标准） ； 说 明 书 CN 102031281 A CN 102031284 A3/6 页 7 3） 、 然后加入重量百分浓度为 0.2% 指示剂溴麝香草酚蓝溶液 12.5ml、 重量百分浓度为 0.2% 甲酚红溶液 4ml、 重量百分浓度为 0.2% 麝香草酚蓝溶液 10ml。指示剂配制见表 1 ； 4） 、 混合后， 充分摇。
27、匀。分装于 13100mm 的试管内， 每管约 3ml ； 5） 、 置高压灭菌器内， 经 10 磅压力 10 分钟的灭菌 ； 6） 、 灭菌后， 制成斜面， 底部宜厚。待凝固后， 置于冰箱中， 备用。 0012 表 1 指示剂所需量及其配制 。 0013 第二试管 ： 琼脂 3.0g， 胰化酪蛋白胨 10.0g， 蛋白胨 10.0g， 氯化钠 5.0g， 重量百分 浓度为 10%Na2HPO42.5ml， 蔗糖 10.0g， 重量百分浓度为 1% 硫代硫酸钠溶液 2.5ml， 重量百分 浓度为 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 5ml， 蒸馏水 1000ml。 0014 第二试管配制 ： 1） 、。
28、 取琼脂 3.0g， 加入 1000ml 的蒸馏水中， 加热溶解， 并用数层纱布过滤 ； 2） 、 再取胰化酪蛋白胨 10.0g、 蛋白胨 10.0g、 氯化钠 5.0g、 重量百分浓度为 10% Na2HPO42.5ml、 蔗糖 10.0g 及硫代硫酸钠溶液 2.5ml， 混合后， 加入已溶解的琼脂中， 充分摇 匀， 使全部溶解， 再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠溶液约1.5ml左右， 矫正pH至7.6 （按 冷却至 25后测量值为标准） ； 3） 、 溴麝香草酚蓝的配制 ： 取溴麝香草酚蓝 0.2g、 N/10 氢氧化钠溶液 5ml 及蒸馏水 95ml， 混合后， 放在棕色瓶中， 备用 。
29、； 4） 、 加重量百分浓度为 0.2% 溴麝香草酚蓝 5ml。充分摇匀， 分装于 13100mm 的试管 内， 每管约 3ml ； 5） 、 置高压灭菌器内， 经 10 磅压力 10 分钟的灭菌， 取出后， 置于冰箱中， 备用。 0015 8、 硫化氢滤纸条 ： 硫化氢滤纸条的制备 ： 选取细薄的滤纸剪成 350mm 的长条， 浸在饱和的醋酸铅溶液中 （重量百分浓度为 35% 醋酸铅饱和溶液） ， 取出后放于平皿中， 置 56烘箱中约 3h， 烤干备用。此纸条阳性结果显黑色。 0016 9、 吲哚滤纸条 ： 吲哚滤纸条的制备 ： 滤纸条 （同上述大小） 浸于对二甲氨基苯甲 醛 5.0g、 甲。
30、醇 50ml 和磷酸 10ml 的混合液中， 取出后放于平皿中， 置 56烘箱中约 4h， 稍微 烤干即取出， 冷却至室温备用。此纸条经对二甲氨基苯甲醛染成淡黄色， 如靛基质阳性， 纸条就变为红色。 0017 本发明的有益效果是 ： 根据不同类型的标本选择进行预增菌或选择性增菌方式使 标本中目的菌达到可以通过平板进行分离的菌量， 通过选择性分离平板生长的 “疑似” 典型 菌落接种于沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管和沙门菌显色琼脂平板 （CAS） 进行的生化筛检 与酶显色定位反应达到不同分离沙门菌和志贺菌的分离、 鉴定效果。将生化反应识别和特 异性酶 - 底物显色琼脂平板结合进行筛选提高了筛选的。
31、时效性和准确性， 通过显色判定结 说 明 书 CN 102031281 A CN 102031284 A4/6 页 8 果非常直观。 同时， 因为操作过程简便也极大提高了单位时间的工作效率， 使操作者更易掌 握和接受， 减少试验过程中人为因素造成的随机误差。 具体实施方式 0018 首先按照技术方案内容配制试剂盒， 使用者根据不同检材选择使用不同的增菌液 或选择性平板进行组合分离， 最后使用简易生化和特异性酶 - 底物反应试验鉴别诊断沙门 菌和志贺菌 （表 2） 。 0019 1、 不同检材的解释、 采集要求和预处理方法 ： 1） 、 患者的血液 ： 以无菌操作采取患者静脉血 3-7ml， 立。
32、即接种于商业化血培养瓶增菌 培养并同时接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色琼脂平板 （CAS） 进行 直接分离， 36培养24h-48h观察菌落生长结果。 如果为凝固血液则将血块粉碎后接种。 商 业化血培养系统提示阳性者挑取培养液接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门 菌显色琼脂平板 （CAS） ， 36培养 24h 观察菌落生长结果。 0020 2） 、 粪便 ： 包括人 （患者和带菌者） 、 家禽 （畜） 等动物性粪便标本尽可能新鲜采集约 1g（拇指大小） ， 液状便采约 1ml， 在 1h-2h 内进行培养。若短时间不能检测时， 应使用商品 化培养基保。
33、存， 运送至实验室。先使用棉签 （拭子） 挑取标本直接接种木糖赖氨酸脱氧胆酸 盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色琼脂平板 （CAS） ， 36培养 24h 观察菌落生长结果 ； 然后使 用棉签 （拭子） 挑取粪便标本分别置沙门菌增菌液、 志贺增菌液中均质混匀后， 放置 36分 别培养 18h-24h 和 12h， 取出分别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色 琼脂平板 （CAS） ， 36培养 24h 观察菌落生长结果。 0021 3） 、 水 ： 包括饮用水、 生活用水、 江、 河、 湖水和污水等液态标本用无菌玻璃或塑料 瓶采集 250ml-500ml， 液体清澈者可。
34、使用孔径 0.22m-0.45m 滤膜进行负压过滤后将滤 膜剪碎后放置沙门菌增菌液和志贺增菌液中选择性增菌， 36分别培养 18h-24h 和 12h， 分 别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色琼脂平板 （CAS） ， 36培养 24h 观察菌落生长结果 ； 液体浑浊者可在 10 倍浓缩通用型非选择性增菌液瓶中加入 90ml， 36 培养 6h-8h 后吸取 1ml， 分别接种于沙门菌增菌液和志贺增菌液中进行选择性增菌， 36分 别培养 18h-24h 和 12h， 分别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色琼脂 平板 （CAS） ， 36培养 24。
35、h 观察菌落生长结果。 0022 4） 、 食品 ： 采集定型包装或非定型包装500g-1000g， 先使用棉签 （拭子） 直接在食品 表面进行多点涂抹后直接接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色琼脂 平板 （CAS） ， 36培养 24h 观察菌落生长结果 ； 然后将剪碎或均质后食品与通用型非选择性 增菌液按照重量比1:10比例进行混匀， 36培养6h-8h后吸取1ml， 分别接种于沙门菌增菌 液和志贺增菌液中进行选择性增菌， 36分别培养 18h-24h 和 12h， 分别接种木糖赖氨酸脱 氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 和沙门菌显色琼脂平板 （CAS） ， 36培养 。
36、24h 观察菌落生长结果。 0023 检查方法 ： 2、 疑似典型菌落的判断、 生化反应识别和特异性酶 - 底物平板鉴定沙门菌与志贺菌的 使用方法 （表 2） 1） 、 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 （XLD） 生长疑似典型菌落特征 （24h） ： 非伤寒 - 副 伤寒沙门菌中心黑色 （产生硫化氢） ， 边缘淡红色或平板底色， 中等 （2mm-3mm） 大小的半透 说 明 书 CN 102031281 A CN 102031284 A5/6 页 9 明、 光滑、 湿润菌落， 伤寒 - 副伤寒沙门菌产生硫化氢能力弱不易形成典型菌落形态 ； 志贺 菌一般为 2mm-3mm 大小的淡红色或平板底色，。
37、 半透明、 光滑、 湿润菌落， 少数宋内志贺菌粗 糙型的木糖阳性株可能因产生黄色菌落而无法形成典型菌落形态。 肠杆菌科中部分普卢菲 登肠杆菌、 变形杆菌、 爱德华肠杆菌和少数大肠埃希菌与假单胞菌因具有产生硫化氢的能 力可能会形成疑似沙门菌典型菌落生长 ； 肠杆菌科中部分阴沟肠杆菌、 蜂房哈夫尼亚肠杆 菌、 少数不活泼大肠埃希菌和假单胞菌可能会形成疑似志贺菌典型菌落生长， 需要使用沙 门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管进行鉴别诊断。 0024 2） 、 沙门菌显色琼脂平板 （CAS） 生长疑似典型菌落 （24h） ： 所有的沙门菌 （包括伤 寒沙门菌与非伤寒沙门菌） 均为中等 （2mm-3mm） 大。
38、小、 边缘光滑、 湿润的酒红色菌落 ； 非沙 门菌中部分酵母菌或假单胞菌有时也会表现为粉红色菌落形态 ； 志贺菌中所有福氏志贺菌 （B 群） 的菌落表现为中等 （2mm） 大小、 不透明、 湿润、 边缘光滑的白色菌落 （延长培养至 48h 可呈现淡红色） ， 宋内志贺菌 （D 群） 绝大多数表现为中等 （3mm） 大小、 不透明、 湿润、 边缘光 滑的蓝色菌落 （偶有白色菌落为 ONPG 阴性株） ， 其他 A 群和 C 群志贺菌除志贺、 鲍氏 9 型 和鲍氏 15 型外菌落均为白色菌落 （延长培养至 48h 可呈现淡红色） 。部分假丝酵母菌 （白色 念珠假丝酵母菌） 、 部分假单胞菌 （铜绿。
39、假单胞菌和不动假单胞菌） 和少数大肠埃希菌也偶 有粉红色的疑似沙门菌典型菌落生长， 需要使用沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管进行鉴别 诊断。 0025 3） 、 生化反应识别 ： 沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管第一管 ： 葡萄糖、 甘露醇同时发酵的菌株在 36培养 18h 后， 斜面底层均显鲜明黄色 ； 尿素分解菌株产生深蓝色 （脲酶阳性） ； 产碱假单胞菌、 铜绿 假单胞菌脲酶阳性生长时， 斜面变蓝色， 单独底层显黄色 ； 斜面保持绿色的， 为只发酵葡萄 糖不发酵甘露醇的菌株 ； 产气菌株能见气泡产生 （pH7.0-8.0 时为绿色， pH8.0-8.2 时为绿 蓝色， pH8.2 以上时。
40、为深蓝色略带紫色） 。 0026 该培养基直立部分产酸而变黄色， 为葡萄糖发酵， 这因斜面部分少量葡萄糖产酸 后， 在有氧环境下， 少量酸与空气化合而成二氧化碳和水， 因而失去酸在培养基内影响酸碱 度改变的作用。 而在直立部分所产生的酸， 则因在厌氧状况下， 可使培养基的酸碱度改变而 变黄 ； 斜面部分产酸而变黄色， 为甘露醇发酵， 这因加入的大量甘露醇产酸后， 在有氧环境 下， 其部分的酸与空气结合而化合成二氧化碳和水， 但因甘露醇量多， 所产生的酸量亦多。 因此， 一部分酸变质， 而还有一部分酸存在， 故仍可改变斜面部分的酸碱度而变黄色。 0027 沙门菌 - 志贺菌综合生化鉴定管第二管 。
41、： 接种细菌经 36培养 18h 以上培养后， 产酸时变黄色 ； 产酸产气时可见气泡并变黄色。观察动力的有无， 可根据穿刺线生长情况 ； 另在管口悬挂硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条， 如一条显黑色， 则为硫化氢反应阳性 ； 另一条如 显红色则为靛基质反应阳性。 0028 4） 、 特异性酶 - 底物平板鉴定沙门菌和志贺菌使用方法 生化反应识别符合的疑似沙门菌培养物接种沙门菌显色琼脂平板， 36培养 18-24h 后， 所有的沙门菌 （包括伤寒沙门菌与非伤寒沙门菌） 均呈现为中等大小、 湿润、 边缘光滑的 酒红色菌落。 0029 生化反应识别符合的疑似志贺菌培养物接种沙门菌显色琼脂平板， 36培养 1。
42、8-24h 后， 志贺菌中所有福氏志贺菌 （B 群） 的菌落表现为中等大小、 不透明、 湿润、 边缘光 说 明 书 CN 102031281 A CN 102031284 A6/6 页 10 滑的白色菌落 （延长培养至 48h 可呈现淡红色） ； 宋内志贺菌 （D 群） 绝大多数表现为中等大 小、 不透明、 湿润、 边缘光滑的蓝色菌落 （偶有白色菌落为 ONPG 阴性株） ； 其他 A 群和 C 群志 贺菌除志贺型、 鲍氏 9 型和鲍氏 15 型外菌落均为白色菌落 （延长培养至 48h 可呈现淡红 色） 。 0030 表 2 简易生化和特异性酶 - 底物反应试验结果 注 ： ： 发酵产酸产气 ； + ： 发酵产酸 ； +/- ： 大多数阳性反应， 少数阴性 ； -/+ ： 大多数阴 性反应， 少数阳性 ； ND ： 不检测。 1 ： A群志贺型为兰色 ； 2 ： C群鲍氏9型和15型为兰色 ； 3 ： 极个别菌为酶反应阴性菌表现为白色菌落。 说 明 书 CN 102031281 A 。