在控制氨水平条件下的棒酸发酵 【发明领域】
本发明涉及用产棒酸的微生物发酵生产棒酸的领域。
【发明背景】
已知链霉菌属可产生很多种次级代谢物，这些次级代谢物可用于生产药物。属于链霉菌属产生的这类药物的实例，例如聚酮化合物类、大环内酯类、蒽环素类、四环素类、脂肽类和β-内酰胺类，可进一步参照Strohl(1997)的文献。
一个特殊的实例是β-内酰胺酶抑制剂棒酸的生产，棒酸为β-内酰胺化合物，可由属于链霉菌属的各种微生物菌株产生，例如带小棒链霉菌(S.clavuligerus)ATCC 27064、S.jumonjinensis(英国专利号1563103)、片村滨链霉菌(S.katsurahamanus)IFO 13716 FERM3944(日本专利号83009679B)和链霉菌属种(Streptomyces sp.)P6621 FERM 2804(日本专利申请号55162993A)。
链霉菌属的次级代谢有各种调节方式。这些调控方式可能包括碳分解代谢物、铵盐或磷酸盐的阻抑或任何其它种类能阻抑目的次级代谢物的代谢物。碳分解代谢物和铵可以抑制带小棒链霉菌中头孢菌素的产生(Aharonowitz和Demain 1978和1979)，氮分解代谢产物可以调节生二素链霉菌(S.Ambofaciens)产生螺旋霉素(Untrau 1994)，而磷酸盐、铵盐和谷氨酸盐可以抑制带小棒链霉菌产生棒酸(Romero等1984)。氧浓度可影响铵盐和磷酸盐调节带小棒链霉菌合成抗生素的能力(Fang & Demain,1995)。涉及到在各种链霉菌属中产生头霉素的各种调控类型在Omstead等(1985)的文献中有描述。已发现，高浓度的铵可抑制团片链霉菌(S.Flocculus)中链黑霉素的生物合成(Wallace等1990)。相似的氨的对铵和磷酸盐对带小棒链霉菌的头孢菌素产生的调节的负面影响已被Aharonowitz和Demain(1979)所描述。此外，因为带小棒链霉菌为脲酶阳性菌株，其中脲酶可被NH4Cl抑制(参照Bascaran等(1989)的2478页)，在产生棒酸地过程中已产生了ureum(Elson,1993)，当保持低浓度的铵时，据说带小棒链霉菌产生棒酸的量特别高(WO96/18743)。
但是，同专利申请号为WO96/18743中描述的相反，发现当维持铵浓度在一优化的、大约最低为50mg/l的较高浓度范围时，链霉菌属中棒酸的产量有令人吃惊的大量增加。当应用该浓度范围铵时，棒酸的产量有超过20％的增加。
在任何以前的文献中均没有这样的描述或提示：通过应用最低为50mg/l的铵浓度，从而获得令人吃惊的高棒酸产量。
发明概述
本发明提供了在含有碳源和氮源的合适培养基中，用产棒酸的微生物发酵生产棒酸的一种方法，其中在该产棒酸的微生物发酵过程中，氨(ammonia)浓度维持在等于或高于50mg/l，特别是在等于或高于75mg/l时，尤其是在等于或高于100mg/l时。铵(ammonium)浓度的调节可从下述措施中选择一或两种：调节铵的加入速率(additionrate)，例如硫酸铵或尿素；调节加入包含一种或多种铵的滴定剂，这些滴定剂选自氨和氢氧化铵，同例如硫酸和氢氧化钠结合使用。在发酵过程中，优选的pH值维持在6.5-7.5之间，优选发酵过程在以补料分批，连续或半连续的方式进行。发明详述
根据本发明，我们吃惊地发现，当铵浓度维持在等于或高于50mg/l，特别在等于或高于75mg/l，更特别在等于或高于100mg/l时，同铵浓度维持在低浓度(＜50mg/l)的发酵过程相比，棒酸的产量有显著的改进。通过使用本领域公知补料分批发酵技术，可将营养成分加料到工业发酵罐，从而提供优化的生理条件，以达到在给定发酵过程中获得最大的产量。作为一实例，通过连续或不连续(间断地)向发酵罐中加入铵源，可以将发酵肉汤中的残余铵浓度控制在预期的浓度范围之内。这可以通过以下方法来实现：要么直接地通过控制氮源(铵，铵盐如氯化铵，硝酸铵，磷酸铵和碳酸铵或尿素(作为铵前体))的流量，要么间接地通过铵作为碱滴定剂的加入，最终交替以氢氧化钠，以防止铵的剂量过高。此外，可以通过控制温度或pH值，从而使生长速率增加和铵的消耗速率增加，达到减少铵浓度的目的。可以通过调节氮源的流入或控制碱滴定剂和/或pH值来控制铵的浓度。
根据本发明，铵浓度维持在等于或高于50mg/l。另一方面，为了减轻对次级代谢的抑制和避免铵的毒性，铵的浓度应足够的低。例如，铵的浓度可维持在低于2500mg/l，优选低于1000mg/l，例如500mg/l。
用于产生棒酸的微生物可以是任何链霉菌，任选地通过经典菌株改进或重组DNA技术而来的在生长和/或棒酸产量方面有改进的，例如带小棒链霉菌或S.jumonjinensis。
可通过在一合适的培养基中发酵链霉菌来产生棒酸，该培养基包含各种碳和能量来源像糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、或多糖如淀粉、麦芽糖糊精和菊粉或其他果糖聚合体、蛋白如来自坚果、蔬菜、种子、谷类、草类诸如发酵工业中有用的草类的粉；大豆粉、亚麻籽粉、花生粉、马铃薯粉、向日葵、豌豆或豆类粉、棉籽粉、麦麸、全麦、大米粉、或来自动物源称做蛋白胨的蛋白、或来自微生物的蛋白如酵母抽提物、甘油三酯如大豆油、向日葵油、橄榄油、三-油酸酯等、(聚-)醇类如乙醇、丙醇、甘油、山梨醇、或有机酸或有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、丙二酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐等、和氮源如铵盐、铵、尿素、硝酸盐、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸和从复合来源而来如来自微生物(酵母抽提物)或植物(玉米浸出液、大豆粉、棉籽粉等)和动物(蛋白胨)的蛋白产品。磷可以以无机盐形式提供，或以磷蛋白形式如酪蛋白，或在很多种植物蛋白源如大豆粉中同肌醇结合成肌醇六磷酸盐形式，或在酵母抽提物中结合成核苷酸形式。
此外，维生素和各种无机阴离子如硫酸根离子、磷酸根离子、氯离子、硼酸根离子、钼酸根离子、碘酸根离子和无机阳离子如钾离子、钠离子、锌离子、锰离子、镁离子、铁离子、铜离子、钴离子、镍离子也可以加入到发酵培养基中。
可从预培养物或接种物发酵按主发酵培养基1-50％的体积接种，优选5-20％，开始发酵。该过程可持续24-400小时，优选48-168小时。温度保持在20-40℃，特别25-35℃，更特别25-30℃。pH值应通过滴定优选维持在6-8，更优选6.5-7.5，滴定物是碱性物质如氨、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或有机碱如赖氨酸、精氨酸和组氨酸或这些碱性物质的组合，和酸性物质如无机酸如硫酸、盐酸、磷酸和硝酸。或者，也可使用有机酸如谷氨酸、柠檬酸、葡萄糖酸或乙酸。
在过程中，通过变化一个或多个下述参数，可以将溶氧浓度优选地控制在优化的范围之内：入口气的氧浓度、使用超压、搅拌速率或气流的改变。该范围可在0-100％气体饱和度之内变化。
通过增加经过发酵罐的气流，使二氧化碳应保持在非毒性浓度，因此出气口的二氧化碳浓度低于5％，更优选少于2.5％。
发酵可以以批、补料分批或连续发酵过程的模式进行。
该过程也可以将各种非生长限制的营养成分控制在优化的浓度而进行。根据所选择限制生长的营养成分，这些生长非限制的营养成分可以包括任何相关的碳、氮、磷或硫源，或可以包含氧。
当然，本发明发酵过程中所形成的不纯棒酸溶液的回收，以及随后用本领域所知的方法将其转换为药物学上可用盐的过程，的确也是本发明的一个方面。其中最有利的程序之一是：通过加入相应的氨基(amino)盐形成化合物例如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，1,3-双(二甲基氨基)-2-丙醇，t-丁胺，t-辛胺，二苯甲基胺和双(2-(二甲基胺基)乙基)醚，使不纯的棒酸变为氨基盐，并使该胺棒酸盐同药物学上可接受的非毒性盐如乙基己酸钾反应形成相应的纯盐，例如棒酸钾。
下述的实施例仅仅用于说明本发明。参考文献Strohl W.R.，工业抗生素生物技术(Biotechnology of IndustrialAntibiotics),Marcel Dekker Inc.,1-48页(1997)。Aharonowitz Y.和Demain A.L.，抗微生物制剂和化学治疗(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)Vol.14,No.2,159-164页(1978)。Aharonowitz Y.和Demain A.L.，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)25,61-67(1979)。Aharonowitz Y.和Friedrich C.G.，微生物学文献(Arch.Microbiol.)125,137-142(1980)。Elson S.W.,Baggaley K.H.,Davidson M.,Fulston M.,NickolsonN.H.,Risbridger,G.D．和Tyler,J.W.，化学协会和化学交流杂志(J.Chem.Soc.,Chem.Commun.)1213(1993)。Butterworth，工业抗生素生物技术(Biotechnology of IndustrialAntibiotics),Marcel Dekker Inc.,225-235页(1984)。Romero J.Liras P.和Martin J.F.，应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)20,318-325(1984)。Omstead D.R.,Hunt G.R.和Buckland B.C.in ComprehensiveBiotechnology Pergamon Press,Vol.3,Harvey W.Blanch,StephenDrew和Daniel I.C.Wang编，187-210页(1985)。Brana A.F.,Paiva N.和Demain A.L.，普通微生物学杂志(J.Of Gen.Microbiol.)132,1305-1317(1986)。Brana A.F.,Wolfe S.和Demain A.L.，微生物学文献(Arch.Microbiol.)146,46-51(1986)。Bascaran V.,Hardisson C.和Brana A.F.，普通微生物学杂志(J.Of Gen.Microbiol.)135,2465-2474(1989)。Bascaran V.,Hardisson C.和Brana A.F.，普通微生物学杂志(J.Of Gen.Microbiol.)135,2475-2482(1989)。Wallace K.K.,Payne G.F.和Speedie M.K.，工业微生物学杂志(J.Of Industrial Microbiology),6,43-48(1990)。Untrau S.,Lebrihi A.,Lefebvre G.和Germain P.，当代微生物学(Curr.Microbiol.)28(1994)。Kasarenini S.和Demain A.L.，工业微生物学杂志(J.OfIndustrial Microbiology),13,217-219(1994)。Fang A.和Demain A.L.，工业微生物学杂志(J.Of IndustrialMicrobiology),15,407-410(1995)。
实施例1
带小棒链霉菌ATCC27064通过几轮经典突变(紫外，亚硝基胍(NTG))，在摇瓶培养中进行筛选以改进棒酸的产量，其中棒酸产量的检测用本领域所知的咪唑方法测定。菌株保存为营养菌丝，其在胰蛋白胨-豆胨(soytone)-肉汤培养基(TSB培养基)中于以280rpm振摇的摇床中于28℃培养48小时，冻存于-80℃。
将1ml的冻存菌丝体接种到100ml的灭菌(121℃,30分钟)预培养培养基中，其中含有5-20g/l的麦芽糖.1aq,15-30g/l细菌用胰蛋白胨，1-10g/l细菌用豆胨，磷酸二氢钾(1-5g/l)和0.2g/l的合成除沫剂。
在27℃培养72小时之后，将100ml的培养物转移到接种发酵罐，其中有70l的经蒸气灭菌的培养基，pH值为7.0，含有甘油(20-25g/l)、大豆粉(20-40g/l)、酪蛋白水解物(10-15g/l)、磷酸二氢钾(2-5g/l)、合适的痕量元素混合物和合成抗泡沫剂(1g/l)。接种发酵罐在26-30℃再培养72小时，如果需要，可通过增加气流、搅拌和反压来保持溶氧浓度高于25％的气饱和度。
用压力将9l的接种物肉汤接种到将含有1501培养基的主发酵罐，该培养基接种前经蒸气灭菌。该培养基含有甘油(50-100g/l)、大豆粉(5-20g/l)、酪蛋白水解物(10-50g/l)、磷酸二氢钾(0.5-2g/l)、合适的痕量元素混合物和合成除沫剂(0.2-2g/l)。
用NaOH和硫酸滴定使pH值维持在7+/-0.25，而通过发酵罐的夹套泵入冷水使温度保持在26-29℃。如果需要，可通过增加气流、反压和搅拌子速率来保持溶氧浓度高于25％的气饱和度。
在控制铵的发酵中，将0.58g/l的硫酸铵加入到灭菌后的主发酵培养基，用含12g/l NH3的硫酸盐灭菌稀释溶液加料入铵到发酵罐。通过每2小时脱线测定铵浓度，调节流量使铵浓度到达预期浓度范围。当在肉汤中的铵浓度高于500mg/l时，加入碱性滴定剂升高pH值0.2单位，以降低铵浓度的水平。
从表1中我们可以看出，当铵浓度控制在高于50mg/l时，在两个独立的运行系列中，棒酸的产量增加均超过25％。在对照发酵实验中，铵浓度低于50mg/l持续35小时；在接种后5-40小时之间。经过这段时间后，由于棒酸的产生，铵浓度也升高。
表1．在300l规模的棒酸发酵中，控制铵水平和不控制铵水平实验的结果实验相对滴度不控制铵水平的对照例 100％控制铵水平的实例1 132％控制铵水平的实例2 127％