本发明涉及制备单克隆抗体的方法。本发明尤其涉及比常规方法 更快速制备和筛选单克隆抗体的高通量方法。
25年前，Kohler和Milstein描述了用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞 融合制备单克隆抗体的方法(Kohler和Milstein，1975年)。从那 以后，单克隆抗体在帮助人类了解生理、生化和遗传方面起着重要的 作用。单克隆抗体是常用的检测、定位特异性生物分子的灵敏方法。 单克隆抗体可以作用于任何细胞分子，从而使该分子能被区别、定位 和纯化。在一些实例中，单克隆抗体也可以帮助确定与其结合的分子 的功能。
七十年代中期杂交瘤技术的发展使人们认识到单克隆抗体在诊 断和治疗中的作用。单克隆抗体已经成为众多临床诊断试剂中的主要 组分。此外，许多已被认证的药物中含有单克隆抗体，并且许多正在 研发的药物也是单克隆抗体。通过最小化其不良反应促进了单克隆抗 体在临床上的使用。然而，尽管单克隆抗体在医疗和分子生物学领域 得到广泛应用，但是自Kohler和Milstein在七十年代提出单克隆抗 体学说以来，制备和筛选单克隆抗体的进展却很缓慢。制备针对某一 抗原的单克隆抗体的方法需要用某一抗原对小鼠或者大鼠进行免 疫，促使成熟B细胞活化和增值，进而产生抗原特异性抗体，这一免 疫过程需要几周时间。体细胞融合前对小鼠进行免疫并定期测定血清 免疫球蛋白滴度。融合后，通过免疫方法筛选杂交瘤上清，以确定针 对某一抗原的高特异性单克隆抗体。使用这种方法制备单克隆抗体需 要的时间通常在3到9个月。
RIMMS(重复，多位点免疫策略)技术的发展使体细胞融合在免 疫起始后8到14天即发生(Kilpatrick等人，1997)。由此获得的 杂交瘤上清可以通过标准的免疫测定方法进行筛选，这使分离针对某 一抗原的单克隆抗体变得非常迅速。然而，即使使用RIMMS，制备和 筛选大量针对不同抗原的单克隆抗体也需要消耗相当长的时间和资 源。随着越来越多新蛋白的发现，有必要建立更快速更高效的制备、 筛选针对这些蛋白的单克隆抗体的方法，以便对其进一步表征。
发明概述
因此，本发明提供了一种制备单克隆抗体的方法，该发明包括下 述步骤：
a)将至少一种候选抗原导入动物；
b)从所述动物收集抗体产生细胞，并使这些细胞成为单细胞悬 液；
c)从所述单细胞悬液制备永生化细胞系；
d)用其上展示有候选抗原的蛋白质芯片筛选所述永生化细胞系 的上清液；和
e)选择与所述候选抗原结合的抗体作为所述单克隆抗体。
本发明的方法相对于目前制备单克隆抗体的方法具有相当大的 优势。如同已讨论的，在当前制备单克隆抗体的方法中，每一种抗原 的免疫和分离都需要复杂的操作。相比之下，本发明的方法中，动物 体内可以导入多种抗原，从而可以同时制备针对多种抗原的单克隆抗 体，这使制备单克隆抗体的速度和效率大大提高。本发明中的蛋白质 芯片可以结合导入动物体内的抗原，蛋白质芯片的应用加速了单克隆 抗体的筛选和检测过程。此外，蛋白质芯片相对于其他常规筛选方法 (例如酶联免疫吸附试验)具有更高的灵敏度，使一些常规方法无法 检测的杂交瘤分泌蛋白易于检测，从而使检测效率提高。此外，本发 明中使用的蛋白质芯片使针对抗原的上清液被筛选多次，并且只需使 用常规筛选(例如ELISA)方法所需抗原量的一部分既可。例如，针 对某一抗原的每种上清液能被同时一式两份、三份或四份筛选。
本发明方法中的步骤a)中的动物可以是任何非人类的哺乳动 物。优选的动物是小鼠、大鼠、兔、仓鼠或者豚鼠。优选的是小鼠。
步骤a)中的候选抗原优选的是纯化的候选抗原。纯化的候选抗原 或者纯化候选抗原的混合物都可以导入动物。纯化的候选抗原是指同 质的抗原制剂，不含有任何其他组分。纯化候选抗原的混合物是指用 于免疫的抗原中含有一种以上的纯化抗原，但是该抗原混合物中不含 有可能引起抗体产生的其他组分。例如，使用常规的操作在动物体内 导入均匀的组织，使动物对多种抗原免疫，但是这样的免疫并不表示 是由此处所述纯化的候选抗原引起的免疫，因为该抗原已被细胞碎片 污染。
任何数量的纯化候选抗原可以导入动物。优选的是将1到50种 纯化抗原导入动物。优选的是一种以上的纯化候选抗原导入动物。例 如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50种或50种 以上纯化候选抗原可以导入动物体内。抗原可以以混合的方式同时导 入动物体内，也可以分别依次导入。不同抗原的导入可以有几天的间 隔。优选的不同抗原的导入时间间隔是短于48小时，优选短于24小 时。优选的导入方法涉及将抗原注射入动物。
术语“候选抗原”是指当其导入动物体内时可以引起免疫应答的 物质。因此候选抗原包括蛋白物质和非蛋白物质。
蛋白物质包括蛋白质及其衍生物，例如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白 和多肽。这些蛋白质的片段也包括在上述“抗原”中。优选的这些片 段包括抗原决定簇。非蛋白质抗原包括多糖、脂多糖和核酸。尤其， 术语“抗原”包括核酸分子，该核酸分子能诱导针对其编码的蛋白质 的免疫应答。这些非蛋白质片段也包括在术语“抗原”中。术语“抗 原”进一步包括和载体相连的能引起免疫反应蛋白质或者非蛋白质， 例如脂类、半抗原和载体相连后能够使前两者具有抗原性。本发明的 抗原可以是天然物质，也可以通过本领域的方法合成。
纯化抗原用于免疫时，优选抗原是蛋白质或者核酸分子。纯化抗 原是蛋白质物质时，可以单独或者以融合蛋白的方式导入。尤其本发 明的抗原也可以是表达于重组病毒表面的融合蛋白，该重组病毒可注 射入动物。Lindley等人在2000年已描述，使用编码蛋白质抗原的 核酸序列构建重组病毒。
一种以上抗原用于免疫时，可以使用任何纯化抗原组合。可以只 给动物注射蛋白质抗原或者非蛋白质抗原，也可以是两者的混合物。 根据本发明的一个实施方案，所用的纯化抗原都是蛋白质成分。纯化 抗原可以是来源于相同蛋白或者不同蛋白的片段。纯化抗原可以是来 源于cDNA文库的重组病毒体，每种重组病毒体在其表面表达一种 cDNA编码的蛋白质。
根据进一步的实施方案，本发明提供了多种纯化抗原以核酸分子 形式导入动物体内的方法，该核酸分子编码可以诱导产生单克隆抗体 的蛋白质。核酸分子可以是DNA分子、cDNA分子或者RNA分子。本发 明在这一方面优选将cDNA导入动物体内。因此，有可能给动物体内 注射某些核苷酸，这些核苷酸编码身份不确定的蛋白质，如下所述， 细胞芯片可以用来分离针对某一蛋白质的抗体，该抗体反过来又可以 使蛋白质被纯化。
纯化抗原是核酸分子时，优选该核酸分子包括或者由DNA、cDNA 或者RNA序列组成，这些核酸序列编码一种可以诱导免疫应答的蛋白 质。核酸分子可以是裸露的核酸分子，也可以以载体的形式存在。
载体可以是病毒载体，优选是一种反转录病毒、腺病毒、腺病毒 相关病毒(AAV)、疱疹病毒、α-病毒或者其他任何合适的载体，这 些载体被本领域的技术人员所熟知。核酸分子也可以以非病毒载体的 形式存在，优选质粒载体。许多这样的载体已被公众所了解并在本领 域报导(参考，例如FernandezJ.M.&Hoeffler J.P.基因表达系统。 Using nature for the art of expression ed.学术杂志，San Diego， London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto，1998).这些 载体可以附加含有调节序列，例如在基因的5’和3’非翻译区含有增强 子、启动子、核糖体结合位点和终止信号序列，这些序列可以保证编 码序列的正确转录和翻译。
核酸分子也可以以聚阳离子浓缩DNA的形式存在，该DNA结合或者 未结合灭活的腺病毒，例如参见Curiel(1992)Hum Gene 20 Ther 3：147-154，或者以配体结合DNA的形式存在，例如参见Wu(1989)J Biol Chem 264：16985-16987。核酸分子可以以DNA覆盖的胶乳珠形 式存在。核酸分子也可以存在于脂质体中，例如WO95/13796，WO94 /23697，WO91/14445和EP-524，968.SA 91(24)：11581-11585。
抗原可以通过任何合适的方法导入动物体内。优选的导入方法包 括注射。纯化的抗原可以通过脾内注射、静脉注射、腹膜内注射、皮 内注射、皮下注射或者任何合适的途径导入动物对其进行免疫。可以 通过一种以上的方法在动物体内导入一种或者多种纯化的抗原使之 免疫。例如，一些抗原可以通过腹膜内注射导入动物体内，而另一些 则可以通过皮下注射导入。注射的具体方法取决于被注射的抗原的特 性。例如，注射核酸分子时可能需要使用手持的基因转移枪(如 US5149655中所述)来注射核酸分子。蛋白质抗原的剂量范围优选在 0.01到1000微克。
本发明的方法中优选包含附加的步骤，即在获取抗体产生细胞之 前对动物进行加强剂量的一些或所有抗原免疫。在第一次注射后的1 到365天给予动物加强剂量的免疫。动物加强免疫的优选次数是1到20 次。
优选本发明方法使用的免疫操作规程简短，给动物导入一种以上 抗原以避免某一种抗原在免疫应答中占据主导。优选地，动物接受一 种以上抗原免疫，在第一次注射3天后对动物进行每种抗原的加强免 疫或者一种以上抗原的合并加强免疫，在第5天再进行一次免疫，在 第6天到第15天去除脾组织或者淋巴结。当希望免疫过程较长时，可 在第一次注射21天后，对动物进行每种抗原的加强免疫或者多种抗原 的同时加强免疫，在第26天去除脾组织和淋巴结。
动物的免疫可以使用或者不使用药学载体。合适的载体通常是大 的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、脂类聚集物(例如油滴 或者脂质体)和灭活的病毒颗粒。这些载体为本领域的技术人员所熟 知。此外，这些载体可以起到免疫刺激剂(佐剂)的作用。除了药学 载体，对动物进行免疫可以使用或者不使用佐剂。
优选的增强组合物有效性的佐剂包括、但不仅限于以下所列佐 剂：(1)铝盐(矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝等；(2)水 包油乳剂(含或不含特异性免疫增强剂，例如胞壁酰肽(参见下述) 或者细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59TM(WO90/14837；Chapter 10 in Vaccine design：the subunit and adjuvant approach， eds.Powell & Newman，Plenum Press)含有5％鲨烯、0.5％吐温80 和0.5％司盘85(可选择性包括MTP-PE)，其在微液化器作用下形成 亚微粒，(b)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克封闭 的聚合物L121和t hr-MDP，其可以通过微液化成为亚微粒乳剂或者通 过旋涡产生体积稍大的乳剂(大小为5)，(c)RibiTM佐剂系统(RAS)， (Ribi Immunochem，Hamilton，MT)含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一 种或者多种细菌细胞壁成分，该细胞壁成分选自单磷脂A(MPL)、海 藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3) 可以使用皂甙佐剂，例如QS21或者StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)，或者使用皂甙佐剂产生的颗粒，例如 ISCOMs(免疫刺激复合物)，该ISCOMs可以不含另外的去污剂例如 WO00/07621；(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(5) 细胞因子，例如白介素(如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7， IL-12(WO99/44636)等)，干扰素(如γ-干扰素)，巨噬细胞集落 刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)单磷酰酯A(MPL) 或者3-O-脱酰基酶(3dMPL)例如GB-2220221，EP-A-0689454可选地 当和肺炎球菌糖类共同使用时基本缺失明矾，例如WO00/56358；(7) 3dMPL和QS21和/或者水包油乳剂的组合，例如EP-A-0835318，EP- A-0735898，EP-A-0761231；(8)寡核苷酸，其包括CpG基序(Roman 等人Nat.Med，1997，3，20 849-854；Weiner等人，PNAS USA，1997， 94，10833-10837；Davis等人，J.Immunol，1998，160，870-876； Chu等人，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等人， Eur.J.Immunol，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等人，Vaccine， 1988，16，1216-1224，Krieg等人，Nature，1995，374，546-549； Klinman等人，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等人，J. Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等人，J.Immunol，1996， 156，4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol，1996，167，72- 78；Yamamoto等人，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873； Stacey等人，J.Immunol，1996，157，2116-2122；Messina等人， J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等人，J.Immunol，1996， 157，4918-4925；Yi等人，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi 等人，J.Immunol，1998，160，4755-4761；and Yi等人，J.Immunol， 1998，160，5898-5906；国际专利号为WO96/02555，WO98/16247， WO98/18810，WO98/40100，WO98/55495 WO98/37919和WO98/52581 等的专利中至少包括一个CG二核苷酸，并且在胞嘧啶处可以选择性地 用5-甲基胞嘧啶取代；(9)聚氧乙烯醚或者聚氧化乙烯酯等 WO99/52549；(10)一种聚氧化乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯 昔醇组合(WO01/21207)；或者一种聚氧化乙烯烷基醚或酯表面活性 剂连同至少一种附加的非离子型表面活性剂，例如一种辛苯昔醇 (WO01/21152)；(11)一种皂甙和一种免疫刺激寡核苷酸(例如一种 CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(12)一种免疫刺激剂和一种金属盐颗 粒，例如WO00/23105；(13)一种皂甙和一种水包油乳剂，例如 WO99/11241；(14)一种皂甙(例如QS2 1)+3dMPL+IL-12(可选择 性加一种甾醇)，例如WO98/57659；(15)其他用作免疫增强剂的物质 可以提高组合物的有效性。其他可以使用的佐剂的例子包括 Montanide ISA 50，Hunter′s TiterMax和Gerbu佐剂。
优选地，本发明中的抗体制备细胞包括B细胞、T细胞和干细胞。 这些用于本发明的抗体制备细胞可以通过去除动物免疫系统的任何 合适的细胞组分获得。优选的抗体制备细胞通过去除脾、淋巴结、骨 髓或其部分。根据本发明的步骤b)，通过合适的方法使上述组织成 为单细胞悬液。优选地，从动物取得的脾组织、淋巴结或者骨髓通过 机械碾磨或者蛋白酶消化的方法获得单细胞悬液。红细胞则通过低渗 裂解从细胞悬液中去除。
本发明的方法的步骤c)中的永生化细胞系优选是杂交瘤细胞， 由单细胞悬液中的细胞和骨髓瘤细胞发生体细胞融合制备得到。单细 胞悬液中的细胞和骨髓瘤细胞在融合剂作用下发生融合。所使用的骨 髓瘤细胞包括SP2、NS1和NS0。优选的融合剂可以是PEG、病毒或者通 过电融合的方法(Zimmermann等人，1990)。
单细胞悬液中的细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞需要 进一步培养。杂交瘤细胞在最初阶段优选在一种选择性培养基中培 养，这种选择性培养基如偶氮丝氨酸次黄嘌呤或者次黄嘌呤氨基蝶呤 胸腺嘧啶脱氧核苷，然后转移入一种非选择性培养基中。优选杂交瘤 细胞在选择性培养基中培养7天，然后用非选择性培养基培养3天。这 可以保证在筛选之前细胞生长速率增加。杂交瘤制备的步骤优选采用 自动化操作，这可以加速操作过程。本发明的实例展示了一种自动化 制备杂交瘤的方法。
永生化细胞系也可以由一种永生化病毒感染单细胞悬液制备得 到。优选的永生化病毒是Epstein-Bar病毒(参见Epstein Barr病毒 操作手册，Eds.Wilson and May，Humana Press；ISBN： 0896036901)。
本发明步骤d)包括筛选永生化细胞系的上清液，优选这种细胞 系是一种杂交瘤细胞系，该上清液中含有和蛋白质芯片作用的抗体， 蛋白质芯片中含有候选抗原，而候选抗原就是用来免疫动物的抗原。 如此处所使用的，蛋白质芯片表面展示有候选抗原，这些抗原排列成 矩阵形状。当仅一种纯化抗原导入动物体内时，该纯化抗原可以锚定 在蛋白质芯片上。当超过一种纯化抗原导入动物体内时，每个纯化的 抗原可以分别处在蛋白质芯片的不同位置上，优选处于预先已经确定 的位置上。蛋白质芯片的每个位置可以有一个不同的抗原。或者，相 同的抗原包被在每一排或者每一列上，使每一列或者每一排上具有不 同的抗原。在某些情况，使用一种以上抗原免疫一种动物时，也可能 有必要使每一种抗原在不同的芯片上。一片蛋白质芯片可以含有多种 抗原，例如含有1到1000种纯化抗原，这些抗原包被在预先确定了位 置的芯片上。
该领域任何已知的蛋白质芯片都可以应用于本发明中。例如该蛋 白质芯片可以是锚定有纯化抗原或抗源的玻璃片。当只有一种抗原需 要检测时，该玻璃片可以用氨基酸硅烷(Ansorge，Faulstich)覆盖， 继而在玻璃片上滴加含有抗原的溶液，然后干燥。覆盖有氨基酸硅烷 的玻璃片可以从Telechem和Pierce获得用于包被纯化抗源。该玻璃片 优选覆盖有(6-aminohexil)氨基硅烷。
其他种类的应用于本发明的蛋白质芯片包括3D凝胶垫(Arkenov 等人，2000)和微孔芯片。根据本发明，各种目前技术还没有成熟、 将来研制成功的蛋白质芯片将有充分的理由适用于本发明中，这些为 本领域的技术人员所熟知。
术语“蛋白质芯片”也包括表达目的cDNAs的细胞构成的微阵列 (Ziauddin等人，2001)，此处即指“细胞芯片”。在该技术中，哺 乳动物细胞培养于玻璃片上，玻璃片的不同位置含有不同的cDNAs。 在确定位置上生长的细胞摄取和表达cDNAs。当动物体内需要注射 cDNA或cDNA文库、重组病毒体或者cDNA文库制备的病毒体时，细胞芯 片尤其有用。在这些情况，cDNA序列编码的蛋白质可能还没有分离得 到。给动物注射编码蛋白的cDNAs序列或者表达cDNAs的重组病毒体， 可能产生针对cDNAs表达蛋白的单克隆抗体。如果使用细胞芯片表达 同样的cDNAs，这些抗体将和细胞芯片结合，并可通过如下所述方法 检测这种结合。假如可以获得编码蛋白的核酸序列，本发明可以使一 种单克隆抗体的检测和分离变得可行。该单克隆抗体和核酸序列编码 的蛋白结合，可以用作蛋白质本身的纯化。
筛选抗体或者筛选产生抗体的永生化细胞系，将永生化细胞系的 上清液点样于蛋白质芯片的确定位置。上清液的点样优选自动化完 成，例如使用一种Genemachines Ominigrid点样仪。优选上清液点 样于表面覆盖有甘油的蛋白质芯片，甘油可以起到简化玻璃片上抗体 干燥和固定的操作。例如可以使用0到99.9％浓度的甘油。然后清洗 芯片以去除任何未结合的上清液。在这个阶段，任何永生化细胞系产 生的、随后分泌到上清液中的单克隆抗体和芯片表面的抗原结合。
通过使用不同的洗脱条件，该方法可以粗略量化单克隆抗体和其 配体的亲和力。可以使用的洗脱液包括盐酸胍或者浓度在10umol到 8mol之间的尿素或者浓度在0.01％到100％(w/v)的乙二醇水溶液。 洗脱也可以使用甘氨酸的水溶液或者非水溶液、浓度从0.01mol到饱 和(优选200mM)，溶液的pH值在l到9之间，优选pH为3.2。pH值高的 洗脱可以使用三乙胺的水溶液或者非水溶液、浓度在1umol到饱和， 优选浓度为100mM，pH值在8到13之间，优选pH值为11.5。
本发明步骤e)包括和抗原结合的单克隆抗体的筛选。优选该步 骤中包含有检测步骤，例如加入一种标记物，该标记物和单克隆抗体 结合用于指示单克隆抗体的存在。优选的标记物是酶或者荧光标记， 后两者使单克隆抗体便于检测。例如，该标记物可以是标记的蛋白质 A或者蛋白质G。蛋白质A和G可以用荧光标记如Cy3或者Cy5。蛋白质A 或者蛋白质G也可以用酶标记，例如生物素，其存在能通过标记的链 霉素或者抗生物素蛋白检测。
优选的标记物是一种和第一抗体结合的抗体。优选该抗体用酶或 者荧光标记。优选该抗体用荧光标记，因为这可以使用于DNA芯片检 测的设备适用于蛋白质检测。
优选检测结合抗原的单克隆抗体的方法进一步包括对单克隆抗 体进行分型。优选检测和对单克隆抗体进行分型的步骤包括在蛋白质 芯片中加入同型特异的抗免疫球蛋白抗体，其中每种含有不同标记的 抗免疫球蛋白抗体，以及检测所述标记的存在。这种方法使单克隆抗 体和其免疫球蛋白分型同时得到检测。
本方法中使用许多不同的型特异性抗免疫球蛋白抗体，这些型特 异性免疫球蛋白抗体是由动物免疫产生，都含有不同的标记。例如， 一种动物例如小鼠注射了某种抗原，检测并区分同型单克隆抗体的步 骤包括加入用第一标记物标记的抗IgA抗体和/或者用第二标记物标 记的抗IgD抗体和/或者用第三标记物标记的抗IgE抗体和/或者用第 四标记物标记的抗IgG1抗体和/或者用第五标记物标记的抗IgG2a抗 体和/或者用第六标记物标记的抗IgG2b抗体和/或者用第七标记物标 记的抗IgG3抗体和/或者用第八标记物标记的抗IgG4抗体和/或者用 第九标记物标记的抗IgM抗体。检测并区分同型单克隆抗体的步骤也 包括加入同型特异性抗免疫球蛋白抗体，该抗体和可能的亚型相结 合。优选该同型特异性抗免疫球蛋白抗体包括标记有第一标记物的抗 IgM抗体和标记有第二标记物的抗IgG抗体。优选标记是荧光标记。标 记的检测表明结合抗原的单克隆抗体的存在，该步骤优选自动化完 成。标记是荧光标记时，标记的检测以及单克隆抗体的存在可以通过 使用扫描蛋白质芯片的设备完成。例如，蛋白质芯片的检测可以由 GenePix 4000B扫描仪(Axon Instruments，Inc.)或者Tecan LS200 或LS400扫描仪操作。扫描可以在1到4的激光条件下进行操作，并且 几种滤光片联合使用以检测多种荧光标记。虽然多种荧光标记的检测 可以依次检测，但是优选同时进行。
扫描图片可以获得并用适当的软件例如GenePix Pro(Axon Instruments，Inc.)、Chipskipper(Schwager，Ansorge)或者Tecan LS200、LS400进行分析。
为了保证单克隆抗体检测的可靠性，筛选方法优选使用各种控制 条件。例如，对于表面仅覆盖有一种抗原的蛋白质芯片，不仅本发明 制备的永生化细胞系上清液需要点样于蛋白质芯片表面，而且阳性和 阴性对照也需要点样于芯片表面。
阳性对照可以用以前测定过的单克隆抗体，也可以使用通过商业 途径购买的多克隆抗体。或者，阳性对照可以由稀释或未稀释的、预 先从免疫动物获取的血清组成，该血清在加强剂量的抗原注射后获 得，也可以在处死动物收集B细胞时获取。
阴性对照可以选用模拟上清液，并点样于确定的位置。每种上清 液筛选几种抗原时需要选用其他的对照。获得的信号仅针对一种抗原 被认为是有力的含有单克隆抗体的上清液。
蛋白质芯片表面的阳性信号可以追踪确定特异的永生化细胞 系，按照本发明的步骤e)使该单克隆抗体能被分离。随后可以对该 分离得到的抗体进行进一步的特性确定。
对抗体进一步表征的方法包括进一步确证抗体的特异性。例如， 本发明分离得到的一种单克隆抗体可以用来检测另一种蛋白质芯 片，该蛋白质芯片包被有众多不同的蛋白质，从而确定单克隆抗体是 否特异性地结合另一种抗原。上述用于蛋白质鉴定的扫描方法可以用 来检测其特异性。本发明制备的单克隆抗体的特异性和亲和力可以通 过改变蛋白质芯片表面的浓度或洗脱条件进行进一步确定。
进一步根据本发明第一方面的实施方案，提供了建立一种产生目 的单克隆抗体的永生化细胞系的方法，该方法包括以下步骤：
a)将至少一种候选抗原导入动物；
b)从所述动物获取抗体制备细胞并使这些细胞成为单细胞悬 液；
c)从所述单细胞悬液制备永生化细胞系；
d)用蛋白质芯片筛选所述永生化细胞系的上清液，所述蛋白质 芯片表面展示有候选抗源。
e)筛选其上清液中含有与所述候选抗原结合抗体者作为永生 化细胞系。
由该方法建立的永生化细胞系在特异性抗体制备方面有着广泛 的应用。
根据本发明第一方面的一个特殊实施方案，提供了一种制备多种 单克隆抗体的高通量方法，每种制备得到的单抗和一种不同的候选抗 原结合，该方法包括如下步骤：
a)将多种候选抗原导入动物；
b)从该动物收集抗体制备细胞并使这些细胞成为单细胞悬 液；
c)从该单细胞悬液中建立永生化细胞系；
d)用一种或多种蛋白质芯片筛选该永生化细胞系的上清液，这 些蛋白质芯片的表面展示有候选抗原；
e)选择与所述候选抗原结合的抗体作为所述单克隆抗体。
如上所述，候选抗原优选是纯化的候选抗原。动物体内导入候选 抗原、收集抗体制备细胞、建立永生化细胞系和永生化细胞系上清液 的筛选方法同样如上所述。
以前本领域制备单克隆抗体的方法需要复杂的操作并且耗时很 长。相比之下，该方法使同时制备和筛选多种抗体变得可行。使用蛋 白质芯片进行抗体大量筛选的方法相对于常规方法具有非常高的效 率和准确性，并且只需较少的候选抗原。
如上所述，优选地，该实例的步骤e)进一步包括单克隆抗体进 行分型的方法。这使本发明相对于本领域以前的发明具有另一优点， 因为后者不能对单克隆抗体同时进行检测，也不能区分同型单克隆抗 体。
根据本发明的第二方面，提供了一种通过本发明的方法制备的单 克隆抗体。本发明也可以用于制备抗体库，其特异性覆盖整个生物体 的蛋白质组。该抗体文库构成本发明的另一方面。
根据本发明的第三方面，建立了一种永生化细胞系，优选杂交瘤 细胞系，该杂交瘤细胞系根据本发明的第二方面可以制备单克隆抗 体。本发明的该方面也包括建立永生化细胞系库，优选杂交瘤细胞系 文库。本发明也可以用于构建杂交瘤细胞系文库，例如，可以产生整 个生物体蛋白质组的细胞系文库。
根据本发明的第四方面，提供了制备大量单克隆抗体的方法，每 种抗体结合一种不同的纯化候选抗原。该方法包括在一种动物体内导 入多种候选抗原。
优选每种候选抗原具有不同来源。根据该方法，每种抗原来源于 不同的蛋白质、核酸等物质。本发明的这一方面不包括给动物注射同 一蛋白质的不同片段进行抗体制备的方法。例如，如果抗原不是来源 于同一蛋白的全片段，那么纯化候选抗原可以都是蛋白质物质。
该方法相对于本领域以前的方法具有另一优点，即该方法使同时 制备一种以上单克隆抗体变得可行，这些单克隆抗体分别结合不同的 纯化候选抗原。
可以使用任何技术给动物注射纯化候选抗原。例如，本发明该方 面的方法进一步包括收集抗体制备细胞如B细胞、T细胞和干细胞的步 骤，这些细胞来源于免疫动物。获取细胞的方法如去除动物脾、淋巴 结或者骨髓，并使这些组织器官成为单细胞悬液。该方法进一步包括 通过单细胞悬液和骨髓瘤细胞融合构建永生化细胞系，优选是杂交瘤 细胞系。优选地，本发明该方面的方法包括这些步骤，也包括筛选永 生化细胞系上清液的步骤，优选杂交瘤细胞系，这些上清液中的抗体 和一种或多种蛋白质芯片表面的候选抗原结合；筛选和抗原结合的单 克隆抗体，优选分离这些抗体和/或者产生这些抗体的永生化细胞 系。建立永生化细胞系的正确操作以及随后的上清液筛选和本发明第 一方面描述的方法相类似。如上所述，尤其是检测单克隆抗体的步骤 包括同时检测单克隆抗体和对其进行分型。
通过本发明这一方面的方法提供了一种制备单克隆抗体的方 法。本发明的这一方面可以用来制备抗体库，其包含，例如，和所有 生物体蛋白质组有特异亲和力的抗体。该抗体库代表本发明的进一步 成果。
本发明也构建了永生化细胞系，优选杂交瘤细胞系，所述细胞系 如上所述能够产生单克隆抗体。本发明也可以用来构建永生化细胞系 文库，例如优选构建杂交瘤细胞系库，该细胞系库能够产生包含所有 生物体的蛋白质组的抗体。
根据本发明的第五方面，可以产生抗独特型抗体，该抗独特型抗 体根据本发明的第二方面可以结合单克隆抗体。因为抗独特型抗体含 有可变区域，该可变区域模拟原抗体所针对分子的结构。因此抗独特 型抗体具有取代原抗体所针对分子进行治疗的作用。可以通过本发明 第一或者第四方面的方法，使用依据本发明第二方面制备的单克隆抗 体制备抗独特性抗体作为纯化的候选抗原。
因此，本发明的该方面提供了一种制备抗独特型抗体的方法，所 述抗独特型抗体与根据本发明第二方面的单克隆抗体结合。该方法包 括根据本发明的第二方面使用单克隆抗体作为纯化的候选抗原，该纯 化的候选抗原用于本发明的第一方面或者第四方面中。本发明也包括 通过该方法制备的抗独特型抗体。
根据本发明的第六方面可以制备抗抗独特型抗体，该抗体结合根 据本发明第五方面制备的抗独特型抗体。该抗抗独特型抗体可以通过 本发明第一或者第四方面的方法使用如上所述的抗独特型抗体作为 纯化的候选抗原。因此本发明该方面提供了一种制备抗抗独特型抗体 的方法，该抗体结合根据本发明第五方面制备的抗独特型抗体，该方 法包括使用一种如上所述的抗独特型抗体作为纯化的候选抗原，该候 选抗原用于本发明第一或第四方面的方法中。本发明的各个方面和实 施方案将通过实施例更详细进行描述。应当理解在不偏离本发明内容 的前提下对细节可进行修改。
附图简述
附图1：扫描芯片的全图，图中绿色和红色的点分别表示产生阳 性IgG和IgM的上清液。芯片中特殊区域进行了放大以显示细节，这些 特殊的区域可以观察到某些有效点。
附图2：比较芯片分析和ELISA筛选。第一张图中是阴性样品 (Ia＜0.5)，而其他的则是阳性样品。平均Ic表示3片芯片上的点的 平均总强度。Ia：相对于三片芯片总强度，平均每个点的比例(％)。
附图3：比较了ELISA(■)或者芯片分析方法(□)筛选结合B5 抗原的培养上清液所测得的相对于总强度的比例(附图3A)。本底值 在图3B中显示。显示了许多通过芯片分析和/或者ELISA方法测得的阳 性上清液。
附图4：比较了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)筛选结合 B5抗原的培养上清液所测得的相对于总强度的比例(附图4A)。本底 值在图4B中显示。显示了一种通过芯片分析和ELISA方法测得的阳性 上清液。
附图5：比较了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)筛选结合 Ket94/95抗原的培养上清液所测得的相对于总强度的比例(附图 5A)。本底值在图5B中显示。显示了许多通过芯片分析和/或者ELISA 方法测得的阳性上清液。
附图6：比较了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)筛选结合 Ket94/95抗原的培养上清液所测得的相对于总强度的比例(附图 6A)。本底值在图6B中显示。通过ELISA或者芯片分析方法没有测得 阳性上清液。
实施例
实施例1：用10种蛋白抗原进行免疫
免疫
给出生8周的雌性Balb/c小鼠脾内注射10种蛋白质抗原，各10μ g，这些抗原用100μl磷酸缓冲盐(PBS)溶解。在随后的第三天，在 小鼠脾内再次注射各1μg的这10种蛋白质抗原，抗原仍然用100μ 1PBS溶解。在第五天，给这些小鼠静脉注射各0.1μg的这10种蛋白质 抗原。在第八天，通过颈脱臼的方法处死小鼠并分离脾脏，把脾脏保 存于DMEM培养基中(DMEM：Life Technologies Inc.)
融合
所有的步骤在无菌的层流通风橱中完成。通过两块磨沙显微载波 片的机械碾磨使脾脏成为单细胞悬液。用一种70μm的尼龙细胞滤器 (BD Falcon)收集上清液到容积为50ml、条形码编码的圆锥形底试 管中(BD Falcon)，转移给自动化操作系统。
SP2骨髓瘤融合伴侣(ATCC)在融合前用HM20(DMEM，20％精制胎牛 血清(Hyclone)、10mM的L-谷氨酰胺、50μm庆大霉素)培养5天。 在融合当天转移到HM20/HCF/2xOPI(含10％杂交瘤克隆因子 (Origen)和2％OPI克隆补充剂(Sigma)的HM20)中，在37℃、5 ％CO2的条件培养至少1小时。
通过条形码识别设备读取条形码，Genesis Freedom System(Tecan)的RoMa臂把50ml的Falcon试管装入转筒。转筒通过工 作台装入离心机。
试管在室温条件(RT)、100g速度下离心10分钟，然后从离心机中 取出转筒，再从转筒中取出试管，通过条形码加以区分。细胞在室温 条件用5ml红细胞裂解液(Sigma)作用9分钟。HM20加至50ml，然后 再一次在室温的条件离心10分钟，自然停止。弃上清重悬细胞于预热 至37℃的DMEM中。每次离心和重悬步骤至少洗涤细胞两次。50μl的 细胞悬液用自动化设备吸至1.5ml的微量离心管中。通过血球计进行 细胞计数。
同时，用相似的方式洗涤SP2细胞3次，取50μl细胞悬液移至 1.5ml微型离心管中并通过血球计数器对细胞进行计数。SP2骨髓瘤细 胞和脾细胞以1∶5的比例混合，在100g条件下离心10分钟，自然停止。
完全弃去上清，将溶于50％HEPES的PEG1500预热至37℃并通过自 动化装置加入，加入过程中试管置于Te-shake振动器(Tecan AG)上 以450rpm的转速振摇并且滴加的时间应超过1分钟以保证充分的混 合。细胞/PEG混合物在37℃温孵1分钟，温孵过程轻轻搅拌。37℃条 件下，边搅拌边加入1ml的DMEM，1分钟以上加完。混合物在37℃条件 温孵1分钟，温孵过程轻轻搅拌。通过自动化装置在37℃条件再次加 入1ml DMEM，加入时间在1分钟以上，边加边搅拌。然后在相似条件再 孵育1分钟。37℃条件下通过自动化装置加入7ml HM20，加入的时间在 3分钟以上，边加边搅拌。然后试管在90g条件下旋转5分钟，通过制 动的方式停止离心。吸弃上清液，重悬细胞于20ml的 HM20/HCF/OPI/AH(HM20/HCF/OPI加10％偶氮丝氨酸次黄嘌呤 (Sigma))中。
圆锥形试管再次置于自动化工作台，通过自动化设备的液体移液 臂的8个吸头吸取融合后的细胞混悬液，然后将200μl的细胞混悬液 加到96孔深孔板的每个孔中(Greiner Masterblock)。
通过自动化装置将该深孔板转移到位于Genesis工作台上的 TeMo96孔自动移液器处，把该96孔板的液体吸出置于无菌96孔组织培 养板中。
融合后混合物通过自动设备加至20个96孔无菌板中(Nunc)，每 孔100μl，该96孔无菌板固定于整合于机器人的自动化传送盘。将该 96孔无菌板置于集成的37℃孵箱中，该孵箱通过气压表的CO2含量是10 ％。培养板储存于孵箱中含有的传送盘。
细胞培养
在融合后的第三天，将细胞从孵箱自动化转移到工作台，并通过 自动化装置再加入100μl HM20/HCF/OPI/AH。然后将培养板自动化放 回孵箱。
在第七天，培养板再次从孵箱转移到工作台，弃去每孔200μl的 上清液，重新加入150μl新鲜HM20/HCF。
在第11天，培养板自动化转移到工作台，收集每孔30μl的上清 液并转移到384孔培养板中，该384孔培养板通过传送带(Tecan Inc) 位于工作台上。
微阵列筛选
滴加40μl含有1到5μg抗原的双蒸水至氨基硅烷覆盖的玻璃片 上，并在其表面覆盖一张22×60毫米的盖玻片，在室温条件湿润环境 下保存60分钟，使盖玻璃片表面均一包被纯化抗原。
包被的玻璃片用PBS简单清洗并用含5％牛奶的PBS和0.1％吐温 阻断60分钟，然后用PBS清洗10分钟。在2000rpm速度下离心10秒干燥 芯片。培养上清液通过Beckman Biomek FX自动化装置统一置于384 孔培养板中。培养上清液通过一种GeneMachines OmniGrid微阵列加 样器加载到三张同样的抗原包被的玻璃片上，每张玻璃片上含9600个 点，每个点的大小在120μm左右。
微阵列芯片在37℃条件、湿润环境下孵育60分钟，然后用含0.1 ％吐温的PBS(PBST)清洗5分钟，共5次。
40μl Cy3偶联的羊抗小鼠IgG特异性抗体和Cy5偶联的羊抗小鼠 IgM特异性抗体按照1∶1000的比例用PBST稀释并混合，然后均一地置 于芯片上，用22×60mm的盖玻片覆盖，室温条件在潮湿环境孵育30分 钟。然后芯片依次用PBST、PBS和双蒸水洗两次，每次10分钟。该芯 片在2000rpm条件下离心10秒干燥。
Hit-Picking
在每象素10μm分辨率下，用GenePix4000B扫描仪(Axon Instruments)扫描芯片。Cy3和Cy5通道的PMT电压分别是540v和 610v。两种激光射线都设定为100％强度。每种扫描的芯片赋予合适 的栅格，并且所有的点用GenePixPro 3.0(Axon Instruments)分析。
所有的芯片用GenePixPro 3.0软件分析，确定芯片上每个点在Cy3 和Cy5通道的相对于校正强度(Ic)的信息。从这些数据我们得到了 每个点相对于每个通道总校正强度的比例 ( ( I c / Σ 1 9600 I c ) × 100 ) . ]]>将每个点 的每个通道的三个值平均求值，该平均校正强度用作数据集最后的分 析。我们把大于0.5％的值当作“可能是阳性”的样品，把超过1.5％ 的值作为“确定的阳性”样品。
筛选后处理
重悬阳性孔中得到的细胞并将20μl转移到一块96孔深孔板中， 该96孔板预先加入了1.5ml的HM20/HCF，然后置于孵箱，在37℃、5 ％CO2条件下孵育48小时。
1.4ml的培养液转移入另一深孔板中，然后将剩余的100μl培养 液用来重悬细胞，将这些细胞转移入冻存管，每管含90％胎牛血清/10 ％DMSO(Sigma)，再将冻存管置于-80℃保存2小时，最后放进液氮 罐保存。然后将培养上清液用于所产生单克隆抗体的评价和进一步表 征。
结果
微阵列筛选的结果见图1。该图表示许多阳性单克隆抗体结合玻 璃片上的候选抗原后被检测到。绿色的点表示IgG单克隆抗体，该抗 体结合候选抗原；而红色的点表示IgM单克隆抗体，该抗体结合候选 抗原。图1表示本发明的方法能用来鉴定结合候选抗原的单克隆抗 体，同时也能确定这些单克隆抗体的型别。
ELISA方法和蛋白质芯片方法进行比较时发现，如图2所示(参见 微阵列结果和ELISA结果比较)许多结合候选抗原的单克隆抗体可以 通过蛋白质芯片方法测得，但是用ELISA方法却无法鉴定。一种通过 微阵列方法筛选是阴性(Ia：0.234)的上清液用ELISA方法测定仍然 是阴性。然而，有四种用微阵列筛选是阳性结果(Ia：5.18，1.96， 3.64，2.02)的上清液用ELISA(参见图2)方法测定只有两种是阳性 结果。有必要指出在ELISA试验中是阴性结果的上清液怎么会通过更 精确更灵敏的微阵列方法测得阳性结果。
实施例2：用9种抗原进行免疫
免疫：
给小鼠体内注射9种剂量为25μg的抗原，其中包括25μg抗原B5 和Ket94/95的融合体，每种抗原和10μg的CpG DNA混合并吸附于明矾 佐剂(Pierce)。每种抗原的一半通过脾内注射导入，另外一半则通 过皮下注射导入。
21天后给予小鼠10μg每种抗原、10μg的CpG DNA和明矾佐剂的 混合物进行加强，每种抗原的一半通过脾内注射导入，另一半则通过 皮下导入。
加强剂量的抗原注射后去除脾脏。
融合和细胞培养
融合和细胞培养如实施例1所述。
针对抗原B5和Ket94/95的抗体的微阵列筛选
滴加40μl含有5μg纯化B5抗原的双蒸水至氨基硅烷覆盖的玻璃 片上，并在其表面覆盖一张22×60毫米的盖玻片，在室温条件湿润环 境下保存60分钟，使盖玻璃片表面均一包被有纯化抗原。用同样的方 法制备一张表面包被有纯化Ket94/95抗原的氨基硅烷玻璃片。
除了用含3％BSA的PBS代替含5％牛奶的PBS阻断玻璃片以外，清 洗、阻断和干燥玻璃片的方法如实例1所述。
如实施例1所述培养的上清液统一置于384孔板中，然后用 Microgrid610微阵列点样仪点样到包被有B5和Ket94/95的玻璃片 上，每孔设3个重孔，每张芯片含大约16000个孔，每孔的大小在150um 左右(ApogentDiscoveries)。
孵育微阵列芯片，并加入Cy3偶联的羊抗小鼠IgG和Cy5偶联的羊 抗小鼠IgM特异性抗体，如实施例1所述。
Hit-Picking
如实例1所述的方法扫描芯片，求得三个培养上清液(一式三份) 的平均校正强度。
微阵列筛选和ELISA方法比较
用ELISA方法检测每种培养上清液进行比较实验。每孔内含200ng B5或者Ket94/95抗原，加入每种培养上清液于孔中，培养上清液中和 抗原结合的单克隆抗体通过常规ELISA试验测定。
用ELISA需要一周的时间筛选5376种培养上清液，这5376种培养 上清液产生5376种结果，每个样品对应一个结果。相比之下，使用微 阵列芯片可以在48小时以内筛选5376种培养上清液，并且每种上清液 可以设3个孔，因此可以产生16128种结果，这表明微阵列筛选相对于 ELISA方法更有效。
此外，微阵列筛选只需5μg的B5和Ket94/95抗原，每片芯片也只 需5μg抗原。相比之下，每块ELISA板需要96微克抗原，并且筛选每 种抗原需要5块ELISA板。因此通过ELISA方法的筛选比微阵列筛选费 用更高且耗时更长。
每块ELISA板的数据给出的是每种培养上清液相对于总强度的百 分比。微阵列筛选得到上清液复孔的均值强度也可以和ELISA数据相 比较。
当用ELISA方法筛选培养上清液中结合B5的抗体时，在超过5块 ELISA板中发现了53种阳性上清液。使用微阵列筛选方法筛选同样的 培养上清液时发现了48种阳性上清液，是用ELISA方法筛选的90.57 ％。微阵列筛选也鉴定了四种未能被ELISA所鉴定的新的阳性上清 液。
当用ELISA方法筛选培养上清液中结合Ket94/95的单克隆抗体 时，在一块ELISA板上鉴定了15种阳性上清液。用微阵列筛选对同样 的上清液进行筛选发现了13种阳性上清液，为ELISA鉴定结果的88.66 ％。微阵列筛选也确定了8种新的未能被ELISA方法鉴定的阳性上清 液。
从这些结果可以看出，微阵列筛选在鉴定结合特异抗原的单克隆 抗体方面至少和ELISA同样有效。事实上，微阵列筛选能鉴定不能通 过ELISA方法测定的上清液表明其灵敏性高于ELISA。此外微阵列筛选 还具有一个明显的优点，即该筛选方法同时还可以确定鉴定的单克隆 抗体是IgG型还是IgM型。
图3A比较了用ELISA方法(■)测定含结合B5抗原的阳性样品的 上清液相对于总强度的百分比值和用B5包被的玻璃片(□)对相同培 养上清液进行微阵列筛选所得到校正的百分比值。图3B表示这些试验 中的本底水平。由图中可见，和ELISA方法相比，用微阵列筛选法测 得的阳性上清液具有更高的相对于总强度的比值。因此，微阵列筛选 和ELISA方法测得的本底和阳性上清液有显著性差异，这可以更容易 更精确地测定阳性上清液。
图4A比较了用ELISA方法(■)测定含结合B5抗原的阳性样品的 上清液相对于总强度的百分比值和用B5包被的玻璃片(□)对相同培 养上清液进行微阵列筛选所得到校正的百分比值。图4B表示这些试验 的本底水平，由图中可知，在本底背景下微阵列筛选方法比ELISA方 法更易于测定阳性样品。
图5A比较了用ELISA方法(■)测定含结合Ket94/95抗原的阳性 样品的上清液相对于总强度的百分比值和用Ket94/95包被的玻璃片 (□)对相同培养上清液进行微阵列筛选所得到的校正的百分比值。 如图5B所示，在本底背景下使用微阵列筛选方法比ELISA方法更易于 测定阳性样品。
图6A比较了用ELISA(■)和微阵列筛选方法(□)测定的不含 阳性上清液的数据。如图6B所示，两种方法的数据归因于本底值。
这些结果表示本发明的方法能同时鉴定针对一种以上抗原的单 克隆抗体。本发明中的微阵列筛选比常规的抗体筛选方法(比如 ELISA)更快速、廉价并且更精确。
参考文献
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