技术领域
本发明属于诱导性多能干细胞技术领域，具体涉及一种Tc1iPs细胞系及其构建方法。
背景技术
唐氏综合征患儿在出生时即已有明显的特殊面容，且常呈现嗜睡和喂养困难，其智能低下表现随年龄增长而逐渐明显，智商约25-50，动作发育和性发育都延迟，患儿眼距宽，鼻根低平，眼裂小，眼外侧上斜，有内眦赘皮，外耳小，舌胖，常伸出口外，流涎多，身材矮小，头围小于正常，头前，后径短，枕部平呈扁头，颈短，皮肤宽松，骨龄常落后于年龄，出牙延迟且常错位，头发细软而较少，发旋多居中，前囟闭合晚，顶枕中线可有第三囟门，四肢短，由于韧带松弛，关节可过度弯曲，手指粗短，小指中节骨发育不良使小指向内弯曲，指骨短，手掌三叉点向远端移位，常见通贯掌纹，草鞋足，拇趾球部约半数患儿呈弓型皮纹。患儿常伴有先天性心脏病等其他畸形，因免疫功能低下，易患各种感染，白血病的发生率比一般增高10-30倍，如存活至成人期，则常在30岁以后即出现老年性痴呆症状。
唐氏综合征致病原因是由于多了一条21号染色体，但致病机理和疾病的发生衍变并不十分清楚。iPS细胞可作为一种工具疾病细胞模型，用于研究疾病的病理学发生机制及用来进行治疗性研究。目前，尚没有一种可用于方便的研究唐氏综合征的iPS细胞系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Tc1iPs细胞系及其构建方法。
一种Tc1iPs细胞系，所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。
上述Tc1iPs细胞系的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)制备Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞；
(2)制备KMSO质粒，并复苏和培养PlatE细胞；
(3)Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒包装；
(4)以小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，将KMSO质粒转染入Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞中。
所述Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的制备方法如下：
(1)剪取Tc1小鼠0.5-1.5cm尾尖，浸泡于2％Pen/Step的PBS中；
(2)用手术刀刮去毛发后用眼科剪将其剪成组织块，将真皮层贴于直径是3.5cm的培养皿中，并用盖玻片轻压；
(3)滴加少许15％FBS的FP培养液，过夜后加入2ml FP培养液；
(4)每2天更换新鲜FP培养液，第8-12天用0.25％的胰酶消化后按1:3进行传代培养；
(5)等细胞长至95-100％汇合度时，用成纤维细胞冻存液冻存。
所述小鼠胚胎成纤维细胞的制备方法如下：
(1)颈椎脱臼处死怀孕13.5天的ICR孕鼠，75％酒精消毒小鼠，剖腹取子宫置于含2％P/S的PBS中；
(2)解剖显微镜下，将小鼠胚胎一个个分离出来，去头、去四肢、去尾、去内脏；
(3)将小鼠胚胎皮肤置于1.5ml EP管中，用眼科剪将其彻底剪碎；
(4)将组织转移到50ml离心管中，加入5-10ml 0.25％胰酶，用5ml吸管反复吹吸，将组织块消化成单细胞，用10％FP培养液中止消化；
(5)1,000rpm/min离心3分钟后，用用10％FP培养液重悬细胞，按8×106cells量接种于75cm2培养瓶中，第二天换液；
(6)待细胞长至100％汇合度后，消化传代，按1：3接种；
(7)细胞长至100％汇合度后，一个75cm2培养瓶细胞量冻存一管冻存细胞。
所述滋养层细胞的制备方法如下：
(1)小鼠胚胎成纤维细胞长至90％左右时，用浓度10ug/ml的丝裂酶素处理；
(2)丝裂酶素处理2-3小时，用无钙镁PBS洗四遍，0.25％Trypsin-EDTA消化2分钟，用2倍体积10％FP培养基终止消化；
(3)1000rpm/min离心3分钟后用10％FP培养基重悬，接种于预先用0.2％Gelatin处理过的10cm培养皿中，细胞密度控制在85％左右。
本发明的有益效果：本发明用Yamanaka四因子重编程方法将唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成Tc1iPSCs，并建立细胞系，同时制备嵌合体小鼠以验证其多潜能分化能力，通过高通量基因组甲基化谱分析，与具有四倍体补偿的iPS细胞系比较，Tc1iPSCs总体甲基水平较高，这表明唐氏综合征的发生机制可能和胚胎发育早期的表观遗传学改变有关系。本发明建立的Tc1iPS细胞系，作为一种细胞模型，将有助于研究发育早期唐氏综合征的发生发展机制，以及在细胞水平进行相关治疗性研究，以推动胚胎早期唐氏综合症的早期干预性防治。
附图说明
图1为Tc1-iPS细胞系形态学电镜图；图中，R1-ES：正常小鼠ESCs；14D-1-iPSCs：具有四倍体补偿能力的小鼠iPSCs；Tc1-iPSCs：小鼠21三体iPSCs。
图2为Tc1-iPS基因型鉴定图；图中，M：Marker；21TG：Tc1iPSCs；14D-1：小鼠14D-1iPSCs；R1：小鼠R1ESCs；Blank：空白对照。
图3为Tc1-iPS嵌合体小鼠形态图。
图4为Tc1-iPS甲基化谱检测分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
小鼠：Tc1小鼠，其尾尖皮肤成纤维细胞用于制备iPSCs。ICR小鼠，其E3.5囊胚用于制备嵌合体小鼠，以及用于囊胚移植受体小鼠。Tc1小鼠iPS细胞系的制备，参照Yamanaka Klf4、c-Myc、Sox2、Oct4四因子重编程方法。
(一)Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞的制备。
1.剪取Tc1小鼠1cm的尾尖，浸泡于2％Pen/Step的PBS中。
2.用手术刀刮去毛发后用眼科剪将其剪成组织块，将真皮层贴于直径是3.5cm的培养皿中，并用盖玻片轻压。
3.滴加少许15％FBS的FP培养液，过夜后加入2ml FP培养液。
4.每2天更换新鲜FP培养液，第10天用0.25％的胰酶消化后按1:3进行传代培养。
5.等细胞长至95-100％汇合度时，用成纤维细胞冻存液冻存。
(二)小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts，MEF)的制备和培养
1.颈椎脱臼处死怀孕13.5天的ICR孕鼠，75％酒精消毒小鼠，剖腹取子宫置于含2％P/S的PBS中。
2.解剖显微镜下，将小鼠胚胎一个个分离出来，去头、去四肢、去尾、去内脏。
3.将小鼠胚胎皮肤置于1.5ml EP管中，用眼科剪将其彻底剪碎。
4.将组织转移到50ml离心管中，加入5-10ml 0.25％胰酶，用5ml吸管反复吹吸，将组织块消化成单细胞，用10％FP培养液中止消化。
6.1,000rpm/min离心3分钟后，用用10％FP培养液重悬细胞，按8×106cells量接种于75cm2培养瓶中，第二天换液。
7.待细胞长至100％汇合度后，消化传代，按1：3接种。
8.细胞长至100％汇合度后，一个75cm2培养瓶细胞量冻存一管冻存细胞。
(三)KMSO质粒制备
KMSO质粒：pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-cMyc。
质粒转化：
(1)四份100ul DH5α感受态细胞分装于预冷的离心管中，置于冰浴中。
(2)分别加入pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-Nanog、pMXs-Nanog质粒1ul(100ul感受态细胞可被1ng超螺旋DNA饱和，轻旋离心管以混合内容物，冰浴中静置30分钟)。
(3)离心管中置于42℃水浴中60-90秒后快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。
(4)离心管中加入900ul无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀，置于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)。
(5)混匀离心管内容物，吸取100ul己转化的DH5α感受态细胞加到含氨苄青酶素(终浓度为100ug/ml)LB固体琼脂培养基上，用无菌弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，培养箱中37℃培养12-16小时。
备注：DNA质粒﹤DH5α感受态细胞悬液体积的1/10；若转化的DNA总量少，取200ul-300ul转化产物涂布平板；若预计的克隆较少，可通过离心(4,000rpm 2min)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。涂布剩余的菌液置于4℃保存。若次日转化菌落数目过少，可将剩下的菌液再涂布于新的培养板。
菌落的小量扩增：
(1)LB培养液中加入氨苄青酶素(终浓度为100ug/ml)；
(2)挑取平板上菌落于3—5ml含氨苄的LB培养基中；
(3)37℃摇床振荡培养过夜(250转/分钟，16小时)；
(4)质粒冻存：一部分菌液用于大量扩增，另一部分菌液5000rpm/min离心1分钟，新鲜含抗生素的LB培养液重悬，加入20％甘油混匀冻存(-20℃)；或30-40％甘油混匀冻存(-80℃)。
菌落的大量扩增：
挑克隆于5-6ml含抗生素的LB培养液中37℃振荡摇菌12-16小时后加入到200ml含抗生素的LB培养液中37℃振荡摇菌12-16小时。
菌落大量扩增后质粒抽提：
(1)采用质粒大抽试剂盒：TIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits，收集大扩的细菌200ml，4℃6000×g离心15min；
(2)10ml Buffer P1重悬细胞；
(3)加入10ml Buffer P2剧烈上下颠倒4—6次，置于室温5分钟。此时准备QIAfilter Cartridge,将cap封住QIAfilter Cartridge端口；
(4)加入10ml Buffer P3(用于溶解)立即剧烈下下颠倒4-6次混匀；
(5)将溶解产物倾入QIAfilter Cartridge，室温静置10分钟。(注意不要触动QIAfilter Cartridge)；
(6)此时用10ml Buffer QBT平衡QIAGIN-tip 500，重力作用使液体下滴；
(7)移去QIAfilter Cartridge上的cap，轻轻地将Plunger插入QIAfilterCartridge，将液体推入QIAGIN-tip 500中；
(8)液体通过重力下滴；
(9)用2×30ml Buffer QC洗涤QIAGIN-tip 500；
(10)用15ml Buffer QF溶解DNA并依重力作用将液体滴入新的离心管中；
(11)用10.5ml室温的异丙醇沉淀DNA，混匀后4℃5000×g离心60min；
(12)5ml室温的70％乙醇洗涤DNA,混匀后4℃5000×g离心60min；
(13)弃去上清液体，空气干燥10分钟，用约500ulddH2O溶解DNA，测DNA浓度，电泳鉴定所抽提质粒的大小，1％凝胶电泳分析各质粒的大小。
(四)PlatE细胞复苏和培养
所有培养皿用前均先用0.2％明胶包被处理。
(1)复苏PlatE细胞，1,000rpm/min离心3分钟后用10％FP接种到培养皿中。
(2)待PlatE细胞长至近100％汇合度时，按1:6-1:10传代培养。
(3)按8×106细胞量分别接种在5个10cm培养皿中。
(4)待细胞长至60-80％汇合度时用作下一步病毒包装用。
(五)Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒包装
PlatE本所保存；DH5α感受态菌目录号：CB101；pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-Nanog、pMXs-Nanog、pMXs-GFP质粒购自Addgene。
(1)取5个1.5ml EP管，各加入0.3ml DMEM。
(2)取27ul Fugene 6转染试剂加入上述各管中，用指尖轻敲使其混匀，室温静置5分钟。
(3)各管中分别逐滴加入9ug pMXs质粒DNA(分别为Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、GFP)(GFP作为包装对照)，用指尖轻敲使其混匀，室温静置15分钟。
(4)在5个Plat-E细胞的10cm培养皿中分加滴加上述DNA/Fugene 6/DMEM混合液，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。
(5)第二天换10％FBS的FP培养液。同时镜检观察GFP病毒包装效果，以作病毒包装的质量控制。
(6)24小时后收集病毒上清液，于50ml离心管中，1000rpm/min离心3分钟，随后用0.45um滤器过滤。
(六)Tc1小鼠TTF iPS细胞制备
1.滋养层细胞的准备。
(1)MEF细胞长至90％左右时，用丝裂酶素(终浓度10ug/ml)处理。
(2)丝裂酶素处理2-3小时后，用无钙镁PBS洗四遍后，0.25％Trypsin-EDTA消化3分钟，用3倍体积10％FP培养基终止消化。
(3)1000rpm/min离心3分钟后用10％FP培养基重悬，接种于预先用0.2％Gelatin处理过的10cm培养皿中，细胞密度控制在85％左右。
2.Tc1小鼠TTF细胞的转染KMSO质粒
Tc1小鼠TTF细胞长至汇合度60-80％，更换无P/S的10％FP培养基。
(1)按相同比例混合Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4病毒上清液，加入5ul 8mg/ml的polybrene(10ml培养液)，polybrene终浓度为4ug/ml，混匀。
(2)将上述混合物加至Tc1TTF细胞培养皿中(β654TTF汇合度为75％左右)，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。
(3)12-16小时后，更换新鲜FP培养液，24小时后再次更换新鲜FP培养液。
3.原代Tc1iPS细胞制备
(1)消化Tc1TTF细胞，离心后用10％FP培养液重悬细胞，按8×105细胞量分别接种于原先接种有滋养层细胞的10cm培养皿中。
(2)过夜后，更换20％KO-SR iPS细胞诱导培养基。
(3)每天更换iPS细胞诱导培养基，直至形成典型的iPS细胞克隆，约20天左右可见明显克隆。
Tc1小鼠iPS细胞系细胞系形态学电镜图如图1所示；Tc1-iPS基因型鉴定如图2所示；图1和图2表明所诱导制备的iPSCs来源于Tc1小鼠尾尖皮肤成纤维细胞，细胞形态正常，为类胚胎干细胞的典型形态。
Tc1-iPS嵌合体小鼠形态如图3所示，嵌合体形成表明Tc1小鼠基本有多潜能分化能力。
图4为Tc1-iPS甲基化谱检测分析，Tc1iPS细胞基因组的甲基化程度较具有四倍体补偿作用的小鼠iPSCs，即具有全能性的iPSCs的高，唐氏病情的发生可能在胚胎发育早期受表观遗传调控的改变就已发生。因此用Tc1iPS细胞进行体内外细胞分化可进一步分析唐氏的发生机制或研究治疗策略。
Tc1iPS细胞形态学正常，具有无限扩增，自我更新、多潜能分化的典型类胚胎干细胞特征。但全基因组甲基化水平较具有四倍体补偿功能的小鼠iPS细胞的高，检测结果表明，Tc1iPS细胞可能在多能性阶段就具有与正常小鼠不同的表观遗传特征，唐氏综合征可能在胚胎发育早期，受表观遗传的异常调控而发生身体的病理性改变。因此，Tc1iPS细胞作为一种唐氏的细胞模型，可用于研究唐氏综合征的形成及发生机制。