技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定量检测牛肉 中猪肉成分的等温数字化padlock-RCA-microscopy方法，用于所述方法的 寡核苷酸探针组合物，以及包含所述组合物的padlock-RCA试剂盒。
背景技术
肉类掺假是重要的食品检验项目。目前肉类掺假的分子生物学检测技 术主要采用PCR或实时荧光PCR技术。该技术的原理是根据动物特异性的 基因片段序列、设计引物和探针，通过聚合酶链式反应，产生针对该特异 性基因片段的信号，从而判断样品中是否含有该动物成分。这种方法在进 行定量检测时，需要制备不同含量的标准样品，通过实时荧光PCR定量曲 线计算样品中目标成分的含量。由于肉品加工方式多样，样品与标准样品 之间的差异会带来巨大的误差。
目前的数字化PCR技术通过将样品DNA模板物理分隔，使每个微小的 反应体系仅包含单个模板，通过统计大数量反应体系的扩增信号，推算样 品中目标模板的比例。该技术摆脱了对标准样品的依赖，实现对样品的直 接数字化检测。但该技术依赖于昂贵的数字化PCR仪和试剂盒，而且每次 实验只能检测一个或少数样品。
利用滚环复制技术(RCA，rollingcircleamplification)检测靶核酸 序列一般具有两种途径，一种直接扩增环形单链模板，然后检测扩增信号； 另一种途径利用锁式探针(padlockprobe)，锁式探针的两端与靶核酸序 列特异性互补，通过连接反应环化与模板链杂交的探针，再扩增已经环化 的探针，然后检测扩增信号。
目前，国内外少见报道能同时简单、快速、特异且灵敏地检测牛肉中 猪肉含量的方法。
发明内容
本申请提供了padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法，该方法 采用基于padlock探针的RCA技术，设计针对猪和牛生长激素基因的特异性 padlock探针，在液相环境中完成探针对生长激素基因序列的识别和成环连 接，通过固定在玻片上的捕获探针捕获padlock环，利用带荧光标记的检测 探针进行固相RCA滚环复制，最后在显微镜下通过检测探针的荧光标记鉴 定序列。
本发明的方法在等温条件下进行，能够实现常规操作条件下的数字化 检测，同时突破了实时荧光PCR方法受标准品限制，数字化PCR操作繁琐， 仪器昂贵，通量低等瓶颈。
在本发明的一个方面，提供了定量检测牛肉中猪肉成分的特异性牛 padlock寡核苷酸探针SEQIDNo.1 (5’AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGGATGTGTT CAG3’)和特异性猪padlock寡核苷酸探针SEQIDNo.2 (5’AACCTTGGGCTTTGGGGCTGCTCATAGACTAGTGCCAGATGGAT GGGGCACC3’)。在所述两个序列的的5’端是磷酸基团。该padlock探针 分别识别牛和猪生长激素基因的DNA序列，并使其连接成环。
在本发明的一个方面，还提供了捕获探针序列SEQIDNo.3 (GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3’)。在捕获探针5’端有连接分子， 例如生物素。通过该捕获探针，使连接成环的DNA序列富集在固相上，例 如固定在玻片上。
在本发明的一个方面，还提供了牛检测探针序列SEQIDNo.4 (5’CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3’)和猪检测探针序列SEQIDNo.5 (5’CTAGTGCTGGATGATCGTCCUUUU-3’)，在所述两种检测探针的5’ 端连接有不同的荧光素，例如在牛检测探针的5’端标记FITC，在猪检测探 针的5’端标记cy3。该检测序列对固相上的成环DNA序列进行RCA滚环复 制，用于在显微镜下进行进一步的观测。
在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。
在本发明的另一个方面，提供了用于定量检测牛肉中猪肉成分的 padlock-RCA试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。
本发明提供的试剂盒包括本发明的用于padlock-RCA方法检测牛肉中 猪肉成分的特异性padlock探针和使用说明书。在一个实施方案中，本发明 的牛肉和猪肉特异性padlock探针分别根据牛和猪的生长激素基因序列设 计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含牛padlock探针序列为 padlockcow: 5’AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGGATGTGTTC AG3’(SEQIDNo.1)，猪padlock探针序列为padlockpig: 5’AACCTTGGGCTTTGGGGCTGCTCATAGACTAGTGCCAGATGGATG GGGCACC3’(SEQIDNo.2)。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含捕 获探针序列:5’GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3’(SEQIDNo.3)。在一 个实施方案中，所述试剂盒中还包含牛检测探针序列SEQIDNo.4 (5’CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3’)和猪检测探针序列SEQIDNo.5 (5’CTAGTGCTGGATGATCGTCCUUUU-3’)。在优选的实施方案中，所 述试剂盒还包括用于padlock-RCA反应的试剂。在一个优选的实施方案中， 所述试剂盒的使用说明书中包括对用于定量检测牛肉中猪肉成分的 padlock-RCA扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒 的说明书中给出的padlock探针成环连接反应条件是：60℃1hr，捕获反应 的条件是：37℃1hr，RCA扩增反应的条件是37℃1hr。在一个具体的实施 方案中，本发明的用于检测牛肉中猪肉成分的试剂盒还包括对照品。任选 地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照 为无菌双蒸水。
本发明的另一个方面，提供了定量检测牛肉中猪肉成分的 padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法，所述方法使用了本发明的 寡核苷酸序列、组合物或者试剂盒。该方法能在无需标准样品，无需数字 化PCR仪的情况下，对牛肉中猪肉成分及其含量进行检测。本发明的另一 个方面，提供了本发明的特异性padlock寡核苷酸探针、本发明寡核苷酸 序列、组合物或者试剂盒在检测牛肉中猪肉成分中的应用。
所述padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法包括步骤：
1)获得来自待测牛肉产品的总DNA样品；
2)使用牛padlock探针序列SEQIDNo.1和猪padlock探针序列SEQ IDNo.2进行连接反应，获得环状DNA序列；
3)使用捕获探针SEQIDNo.3进行捕获反应，将环状DNA序列捕获 在固相；
4)使用牛检测探针序列SEQIDNo.4和猪检测探针序列SEQIDNo.5 在所述固相上进行滚环复制反应，从而扩增所捕获的序列；
5)通过荧光显微镜检测扩增序列。
在一个实施方案中，本发明的牛肉中猪肉成分的 padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法还进一步包括对所述总 DNA样品进行酶切。
在一个实施方案中，所述酶切过程使用HaeIII酶。
在一个实施方案中，padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法还 包括使用图像分析软件对扩增序列进行定量。
在一个实施方案中，所述padlock-RCA检测方法检测出10pM浓度下猪 基因模板成分的检测限为0.5％。在一个实施方案中，所述padlock-RCA检 测方法检测猪肉和牛肉混样中猪肉成分检测限可达到0.5％。
本发明的Padlock-RCA-microscopy方法通过探针识别牛和猪基因特异 序列，连接成环后通过荧光检测探针进行RCA滚环复制，加入后在荧光显 微镜下直接对牛和猪分子扩增产物进行成像和计数，从而对样品中猪成分 进行定性和定量检测。
本发明使用一种基于padlock-RCA的技术，能够在等温条件使特异性 探针与目标序列杂交成环、复制。本发明即基于该技术原理，设计牛和猪 特异性探针，优化技术条件，建立了能够对样品中牛和猪特异性基因片段 比例进行数字化检测的技术，在无需标准样品的情况下，利用实验室常规 的恒温设备及荧光显微镜，实现对多个样品的同时简单、快速、特异且灵 敏的定量检测。另外，本发明的padlock-RCA法又无需数字化PCR仪和前 处理试剂盒，极大降低成本，能同时处理多个样品，很大程度地提高方法 通量。
附图说明
图1是使用padlock-RCA等温数字化检测方法对合成的猪生长激素基 因靶序列(A)、牛生长激素基因靶序列(B)以及两者的混合物(C)进 行检测。显微镜成像使用20倍视野。A图是100％猪模板分子(浓度1nM)。 B图是100％牛模板分子(浓度1nM)。C图是猪和牛模板分子(浓度1nM) 等比例混合。
图2是不同比例混合猪、牛生长激素基因靶序列模板分子时猪模板分 子理论混合比例和观测值关系曲线。观测值是利用padlock-RCA等温数字 化检测方法对样品中猪和牛模板分子进行识别和成环复制后显微镜成像 的分析结果，表示一个视野下猪模板分子在所有分子中的比例平均值。该 比值反映了样品中猪成分比例。
图3是对猪模板分子梯度稀释后用padlock-RCA等温数字化检测方法 观测到的分子微球的图像。模板分子浓度分别为0.1nM，0.05nM,0.01nM, 0.005nM,0.001nM。显微镜为10倍镜。
图4是猪模板分子数与观测到的单视野下分子微球平均数的关系曲线。
图5是猪肉和牛肉混合样品的padlock-RCA分子微球图像，猪肉的比例 分别为50％,10％,5％,1％,0.5％，显微镜为10倍镜。
图6是猪肉比例测量值和理论值的柱状图。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局 限于以下实施例。
实施例1
本实施例对猪和牛特异性padlock探针的特异性、灵敏度和线性相关 性进行验证。
探针序列由美国IDT生物有限公司合成，padlock锁式探针5’端连接磷 酸基团，捕获探针5’端标记生物素，检测探针5’端标记荧光素。具体序列 见下表。
表1
1.基因模板提取：
利用美国Qiagen公司的动物组织DNA提取试剂盒，根据产品说明书 肉样品中提取总DNA。使用HaeIII酶(英国NEB公司)，按照产品说明 书酶切所提取的总DNA。用于酶切的50μl体系由以下组成：10由缓冲液 (5冲液),HaeIII5μl，总DNA40μl。37℃酶切2h。
2.检测主要步骤：
1)连接反应
50μl连接反应体系由以下组成：10×Ampligase缓冲液(美国Epicentre 公司)5μl,Ampligase(美国Epicentre公司)5U,padlock探针SEQIDNO.1、 2(10I)各1.5IDN模板(10I)0.5D，余量为去离子水。
反应条件为60℃持续1h。
通过该连接反应，使猪、牛生长激素基因的直链DNA序列成环。
2)捕获反应
将50μl捕获探针SEQIDNO.3(100nM)加到玻片反应孔(SurModics IVD，美国)，室温放置30min，吸出溶液，用PBST清洗1次，加入由 步骤1)获得的连接产物(每孔加42μl)，37℃孵育1h，用PBST(0.05％ Tween20)清洗玻片1次。
通过该捕获反应，使成环的DNA序列被固定在玻片上。
3)滚环复制反应
在玻片反应孔中进行滚环复制反应(RCA)。RCA反应体系由以下组 成：10×phi29缓冲液(英国NEB公司)5μl,dNTP25mM0.50.55n205U， 检测探针SEQIDNO.4、5(10μM)各0.5μl和44μl去离子水。将 RCA体系加入步骤2)所得到的玻片的反应孔中，反应条件为37℃1hr。
通过该RCA复制反应，使固相玻片上的捕获序列得到了扩增。
4)观察
将步骤3)处理后的玻片用PBST(0.05％Tween20)清洗2次，去除覆 盖板，加荧光封装剂(VectorLaboratories,Inc.,USA)后在荧光显微镜(CSW DY02，蔡司，德国)下观察。
3.特异性检测
按照以上1)至4)的检测步骤，对合成的猪生长激素基因靶序列(浓 度1nM)、牛生长激素基因靶序列(浓度1nM)以及两者各1nM等量混合 物进行padlock-RCA-microscopy检测。
结果如图1所示，猪基因模板呈现大量清晰的微球结构(A，红色标记)， 牛基因模板也呈现大量清晰的微球结构(C，绿色标记)，猪和牛基因模 板混合物呈现两种颜色标记的清晰微球结构(B，红绿色标记)。
该结果表明，本发明的方法可以对目标基因进行检测，微球结构良好， 在显微镜下呈现边界清晰的球状，物种之间不存在交叉反应，混合样品可 以准确检测到两个物种成分，微球比例与预期吻合。
4.灵敏度和线性相关性检测
按照上述基因模板制备方法提取猪总DNA和牛总DNA，浓度均为1nM。 制备猪和牛总DNA的系列梯度混合物，其中猪总DNA的具体比例分别为 50％、10％、5％、1％、0.5％。进行上述步骤1)至4)的反应。然后，使 用图像分析软件(Cellprofilerv.1)自动识别不同颜色标记微球并计数，从 而对反应产物进行定量检测。
以混合梯度为横坐标，定量检测所获得的猪模板比例为纵坐标作曲线。 结果如图2所示。图2显示该曲线为高度线性的，最低模板比例为0.5％，R2达到0.99，说明该方法可以对样品中目标基因模板进行准确定量，定量限 达到0.5％。
将所合成的猪生长激素基因模板从0.1nM到0.001nM进行梯度稀释后， 仅使用猪padlock探针和检测探针进行上述步骤1)至4)的反应。通过自动 识别微球并计数，对模板绝对数量进行检测。结果如图3所示，显示最低 检测限为0.001nM，单视野下微球数量随着模板浓度降低有规律减少。
将图3观测到的微球数量与基因模板数作图。如图4所示，使用图像软 件(同上)对5个视野平均值进行计算，得到横坐标为猪基因模板数量， 纵坐标为单视野平均观测值的曲线，R2达到0.99，说明该方法对样品中基 因模板的绝对量可以进行准确计数。
实施例2
将猪肉和牛肉按比例混合后，确定本发明的方法的可行性、灵敏度、 准确性等。
在本实施例中，所使用的探针如表1所示，并且进行 padlock-RCA-microscopy的实验操作条件如实施例1中1)-4)步骤中所 述。
将猪肉和牛肉按不同重量比例混合，其中猪肉的比例分别为50％、10％、 5％、1％、0.5％。按照上述方法分别从不同比例的所述混合物中提取DNA (Qiagen，德国)后，使用HaeIII限制性内切酶进行酶切，37℃1hr。通 过实施例1的步骤1)至4)进行padlock-RCA-microscopy检测。结果如 图5所示，不同浓度混合肉品的显微镜图片显示检测低限为0.5％。
图6是对肉品中猪肉成分的定量检测结果,误差和标准误差分别为 3.8％、2.5％、0.2％、0.3％、0.14％和7.6％、25％、4％、30％、28％。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员 应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种 改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的 所有这些改变与修饰。