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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410258025.1 (22)申请日 2014.06.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105272838 A (43)申请公布日 2016.01.27 (73)专利权人 成都普瑞法科技开发有限公司 地址 610041 四川省成都市高新区肖家河 沿街99号 (72)发明人 郭建龙邝彬谢海峰胡云岭 冉波徐雷 (74)专利代理机构 成都希盛知识产权代理有限 公司 51226 代理人 柯海军武森涛 (51)Int.Cl. C07C 49/737(2006.0。
2、1) C07C 45/78(2006.01) (56)对比文件 CN 102126941 A,2011.07.20, CN 103424488 A,2013.12.04, CN 103157295 A,2013.06.19, CN 102879498 A,2013.01.16, 审查员 张鑫松 (54)发明名称 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 (57)摘要 本发明涉及巨大戟醇提取物的分离纯化方 法， 属于中药提取分离领域。 本发明所要解决的 技术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方 法。 本发明巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 包 括如下步骤： a、 将巨大戟醇提取物加碱水解后， 加酸中和后， 浓。
3、缩得到膏状物； b、 将步骤a得到的 膏状物进行硅胶柱层析分离纯化； c、 将步骤b收 集得到的巨大戟醇-乙酸乙酯溶液， 减压浓缩， 静 置析出， 过滤得巨大戟醇。 本发明操作简单， 避免 了多步萃取操作， 收率得到提高， 同时实现了规 模化连续生产。 并且层析柱B中的硅胶可以重复 使用2次以上， 一定程度上减少了硅胶使用量和 试剂消耗量， 可大幅降低生产成本。 权利要求书3页 说明书7页 附图5页 CN 105272838 B 2017.12.01 CN 105272838 B 1.巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 包括如下步骤： a、 将巨大戟醇提取物加碱水解后， 加酸中和， 。
4、然后浓缩得到膏状物； b、 将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化， 所述硅胶柱层析装置包 括层析柱A和层析柱B， 层析柱A和层析柱B之间采用三通阀进行连接； 硅胶柱层析具体操作 如下： 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 在层析柱A中上样， 然后， 层析柱A采用石 油醚洗脱除杂， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱， 收 集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液； c、 将步骤b得到的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液减压浓缩后， 静置析出， 过滤得到巨大戟 醇； 其中， 步骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取溶剂提取得到； 所述提取溶剂为。
5、甲醇、 乙醇、 丙酮、 乙醚或氯仿； 步骤a所述碱水解、 酸中和的操作如下： 取巨大戟醇提取物， 加入甲醇或无水乙醇稀释， 甲醇或无水乙醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0.52倍， 加碱水解0.524小时， 每升混 合溶液中碱的含量为540g， 水解完毕， 加酸调节pH至7得到水解液， 然后将水解液浓缩得 膏状物。 2.根据权利要求1所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤a中所述 巨大戟醇提取物的制备方法如下： 取大戟科大戟属植物药材， 粉碎或切段， 按料液比1:5 20w/v加入提取溶剂进行回流提取， 提取14次， 每次0.52小时， 合并提取液， 减压浓缩得 巨大戟醇提取物。
6、。 3.根据权利要求2所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述大戟科大 戟属植物为甘遂、 乳浆大戟、 千金子或南欧大戟。 4.根据权利要求13任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步 骤a中所述碱为氢氧化钠、 氢氧化钾、 甲醇钠或乙醇钠； 所述酸为磷酸、 盐酸、 醋酸或甲酸。 5.根据权利要求13任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步 骤b中所述硅胶柱层析操作为： 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 装填层析柱A和层析柱B， 层析柱A采用石 油醚洗脱平衡至无气泡， 层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡， 然后上样， 样品装入层。
7、 析柱A， 然后采用石油醚洗脱； 洗脱完毕， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层析柱A 中加入乙酸乙酯洗脱， 得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。 6.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中所述 硅胶柱层析操作为： 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 装填层析柱A和层析柱B， 层析柱A采用石 油醚洗脱平衡至无气泡， 层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡， 然后上样， 样品装入层 析柱A， 然后采用石油醚洗脱； 洗脱完毕， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层析柱A 中加入乙酸乙酯洗脱， 得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。 7.根据权利要。
8、求13或6任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小时0.55个柱体积。 8.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中各洗 脱剂的洗脱速度为每小时0.55个柱体积。 权利要求书 1/3 页 2 CN 105272838 B 2 9.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中各洗 脱剂的洗脱速度为每小时0.55个柱体积。 10.根据权利要求13、 6、 8或9任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征 在于： 所述步骤b完成后， 拆出层析柱A中硅胶， 保留层析柱B中硅胶， 重。
9、新装填层析柱A， 然后 取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化， 进行连续操 作。 11.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述步骤b完 成后， 拆出层析柱A中硅胶， 保留层析柱B中硅胶， 重新装填层析柱A， 然后取新的一批步骤a 得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化， 进行连续操作。 12.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述步骤b完 成后， 拆出层析柱A中硅胶， 保留层析柱B中硅胶， 重新装填层析柱A， 然后取新的一批步骤a 得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化， 进行。
10、连续操作。 13.根据权利要求7所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述步骤b完 成后， 拆出层析柱A中硅胶， 保留层析柱B中硅胶， 重新装填层析柱A， 然后取新的一批步骤a 得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化， 进行连续操作。 14.根据权利要求13、 6、 8、 9或1113任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方 法， 其特征在于： 步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵， 湿法上样、 洗脱溶剂石油 醚或乙酸乙酯均采用泵送加入。 15.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中所述 硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵， 湿法上。
11、样、 洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加 入。 16.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中所述 硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵， 湿法上样、 洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加 入。 17.根据权利要求7所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中所述 硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵， 湿法上样、 洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加 入。 18.根据权利要求10所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤b中所 述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵， 湿法上样、 洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加 入。 19.根据权利要求1。
12、3、 6、 8、 9、 1113或1518任一项所述的巨大戟醇提取物的分离 纯化方法， 其特征在于： 步骤c中所述静置析出在-205下静置， 0静置时间24h。 20.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤c中所述 静置析出在-205下静置， 0静置时间24h。 21.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤c中所述 静置析出在-205下静置， 0静置时间24h。 22.根据权利要求7所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤c中所述 静置析出在-205下静置， 0静置时间24h。 23.根据权利要求10所述的巨大戟醇。
13、提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤c中所 权利要求书 2/3 页 3 CN 105272838 B 3 述静置析出在-205下静置， 0静置时间24h。 24.根据权利要求14所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 其特征在于： 步骤c中所 述静置析出在-205下静置， 0静置时间24h。 权利要求书 3/3 页 4 CN 105272838 B 4 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 属于中药提取分离领域。 背景技术 0002 巨大戟醇(ingenol)是一种四环二萜类天然产物， 其结构式如式 所示， 来源于大 戟科大戟属植物， 。
14、以其为母核的衍生物表现出较好的抗癌、 抗HIV等生物活性， 其中以巨大 戟醇-3-当归酸酯为分子实体的新药Picato已于2012年被FDA批准上市， 用于光化性角化病 的治疗。 0003 0004 巨大戟醇结构新奇复杂， 在过去的30多年里， 其独特的结构和活性虽然引起了众 多化学家的关注， 也有相关全合成的报道， 但合成路线大多步骤繁琐， 得率低， 难以适应日 益增长的市场需求； LEO Pharma公司与Scripps Research Institute合作Science341, 878(2013)， 由(+)-3-蒈烯通过14步最终合成得到巨大戟醇， 总收率达到1.2， 但其合成 路。
15、线仍然处于实验室阶段， 且合成过程中需要用到剧毒试剂四氧化锇和二氧化硒， 该工艺 用于放大生产还有待进一步验证。 0005 目前市场上， 巨大戟醇仍然主要来源于大戟科植物的提取分离。 0006 中国专利CN 102126941A对提取浸膏采用萃取、 反萃取、 碱水解、 调pH、 减压浓缩， 然后对浓缩后的浸膏采用硅胶柱层析， 结合重结晶手段纯化得到高纯度的巨大戟醇， 该方 法前期有多次萃取操作， 耗时长， 转移率低， 损失较大， 且用到价格昂贵的有毒性的萃取试 剂乙腈， 成本高， 不利于环保， 也不适合规模化生产， 而且硅胶柱层析采用了石油醚/乙酸乙 酯(1:1)洗脱除杂， 然后加入乙酸乙酯洗。
16、脱， 在除杂的过程中由于乙酸乙酯的加入会将部分 巨大戟醇化合物带出， 降低产率。 0007 专利CN 103694096A对提取浸膏同样采用了萃取操作， 萃取物浓缩后先后经过硅 胶柱层析和制备液相纯化， 最终得到高纯度的巨大戟醇单体， 由于千金子药材中巨大戟醇 主要以其酯类衍生物形式存在， 该纯化工艺未采用水解步骤， 因而最终产品收率极低， 难以 满足规模化生产要求。 0008 专利WO 2013050365 A1中对千金子药材粉末直接加碱搅拌水解， 中和后再依次用 石油醚和四氢呋喃萃取， 然后采用硅胶柱层析纯化得到高纯度的巨大戟醇， 该方法虽简化 了纯化步骤， 但因其用药材粉末直接加碱搅拌水。
17、解， 无法保证药材里的巨大戟醇衍生物都 能浸提出来并水解完全。 0009 上述专利均采用了多步萃取操作， 因千金子中富含油类成分， 萃取时容易乳化， 需 大量溶剂多次萃取才能将目标成分萃取完全， 萃取效率低， 导致提取率低； 萃取所用萃取剂 说明书 1/7 页 5 CN 105272838 B 5 石油醚沸点低， 减压浓缩回收率低， 也在一定程度上增加了生产成本； 而且现有技术中柱层 析大多采用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱剂洗脱， 虽然能够有效的除去极性小的杂质， 由于 混合洗脱剂中乙酸乙酯的加入， 目标化合物巨大戟醇也会随着杂质被带出， 降低了生产产 率。 发明内容 0010 本发明所要解决的技。
18、术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方法。 0011 本发明的技术方案： 巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 包括如下步骤： 0012 a、 将巨大戟醇提取物加碱水解后， 加酸中和， 然后浓缩得到膏状物； 0013 b、 将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化， 所述硅胶柱层析装 置包括层析柱A和层析柱B， 层析柱A和层析柱B之间采用三通阀进行连接； 硅胶柱层析具体 操作如下： 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 在层析柱A中上样， 然后， 层析柱A采 用石油醚洗脱除杂， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层析柱A中加入乙酸乙酯洗 脱， 收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
19、； 0014 c、 将步骤b得到的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液减压浓缩后， 静置析出， 过滤得到巨 大戟醇。 0015 进一步地， 优选步骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取 溶剂提取得到； 所述提取溶剂为甲醇、 乙醇、 丙酮、 乙醚或氯仿。 0016 进一步地， 优选步骤a中所述巨大戟醇提取物的制备方法如下： 取大戟科大戟属植 物药材， 粉碎或切段， 按料液比1:520w/v加入提取溶剂进行回流提取， 提取14次， 每次 0.52小时， 合并提取液， 减压浓缩得巨大戟醇提取物。 其中， w/v的单位为kg/L。 0017 进一步地， 优选所述大戟科大戟属植物为甘遂、 乳浆大戟、。
20、 千金子或南欧大戟。 0018 进一步地， 优选步骤a所述碱水解、 酸中和的操作如下： 取巨大戟醇提取物， 加入甲 醇或无水乙醇稀释， 甲醇或无水乙醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0.52倍， 加碱水解 0.524小时， 每升混合溶液中碱的含量为540g， 水解完毕， 加酸调节pH至7得到水解液， 然后将水解液浓缩得膏状物。 0019 进一步地， 优选步骤a中所述碱为氢氧化钠、 氢氧化钾、 甲醇钠或乙醇钠； 所述酸为 磷酸、 盐酸、 醋酸或甲酸。 0020 进一步地， 优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为： 0021 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 装填层析柱A和层析柱B， 层析柱A采。
21、 用石油醚洗脱平衡至无气泡， 层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡， 然后上样， 样品装 入层析柱A， 然后采用石油醚洗脱； 洗脱完毕， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层 析柱A中加入乙酸乙酯洗脱， 得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。 0022 进一步地， 优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为： 0023 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 层析柱A先装填01/2柱体积的层析 用硅胶， 并用石油醚洗脱平衡至无气泡， 层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯 洗脱平衡至无气泡， 另将拌样硅胶与步骤a得到的膏状物按质量比11.5:1混合拌匀， 得到 样品 ， 取样品 装入A柱，。
22、 上样量为层析柱A柱体积的1/21， 用26个柱体积的石油醚洗 脱； 然后， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 用26个柱体积的乙酸乙酯洗脱， 收集巨 说明书 2/7 页 6 CN 105272838 B 6 大戟醇-乙酸乙酯混合液； 0024 或调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 层析柱A装填1个柱体积层析用硅 胶并用石油醚洗脱平衡至无气泡； 层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯洗脱平 衡至无气泡， 另将步骤a得到的膏状物用石油醚稀释得到样品， 石油醚的体积为膏状物体 积的0.53倍， 将1/21个柱体积的样品上样至层析柱A， 用26个柱体积的石油醚洗 脱； 然后，。
23、 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 用26个柱体积的乙酸乙酯洗脱， 收集巨 大戟醇-乙酸乙酯混合液。 0025 硅胶柱层析中， 优选最终收集合并巨大戟醇纯度80的巨大戟醇-乙酸乙酯混 合液。 纯度是通过高效液相(HPLC)检测的。 0026 进一步地， 为了达到更好的柱层析效果， 优选步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小 时0.55个柱体积。 0027 进一步地， 优选所述步骤b完成后， 拆出层析柱A中硅胶， 保留层析柱B中硅胶， 重新 装填层析柱A， 然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离 纯化， 进行连续操作。 0028 进一步地， 优选步骤b中所述硅胶柱层。
24、析装置中层析柱A连接泵； 更进一步地， 优选 湿法上样、 洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯采用泵送加入。 0029 硅胶柱层析湿法上样时可通过泵送加入。 湿法上样即将膏状物加石油醚稀释后上 样， 即样品。 0030 进一步地， 优选步骤c中所述静置析出， 优选在-205下静置024h。 0031 本发明所具有的有益效果如下： 0032 1、 操作步骤简单， 采用本发明方法石油醚洗脱除杂， 然后采用乙酸乙酯洗脱得到 目标化合物， 不仅可以省去多步萃取操作， 并且最终的巨大戟醇的纯度仍能将纯度提高到 99.9， 由于萃取步骤的省去， 操作更为简单、 产品损失少， 收率得到提高。 0033 2、 水解时间大。
25、为缩短， 在0.5-24小时内， 可大幅缩短产品的生产周期。 0034 3、 采用柱切换技术， 操作更简单， 一次完整的柱层析流程相当于将提取物进行了 多次单柱柱层析， 而且层析柱B中的硅胶可以重复使用2次以上， 一定程度上减少了硅胶使 用量和试剂消耗量， 可大幅降低生产成本。 0035 4、 本发明采用单一洗脱剂石油醚洗脱除杂， 然后采用乙酸乙酯洗脱得到目标化合 物， 采用的单一洗脱剂， 洗脱剂易回收。 0036 5、 本发明采用附图1的装置， 采用泵送加入溶剂， 尤其适用于规模化连续生产。 附图说明 0037 图1是本发明用到的装置连接示意图(1为层析柱A， 2为层析柱B， 3为三通阀， 。
26、4为 泵)； 0038 图2是本发明制备得到的巨大戟醇TLC谱图(展开剂为石油醚:乙酸乙酯1:1； 显色 剂为2香草醛-浓硫酸溶液)； 0039 图3是本发明制备得到的巨大戟醇MS谱图； 0040 图4是本发明制备得到的巨大戟醇1H-NMR谱图； 0041 图5是本发明制备得到的巨大戟醇13C-NMR谱图； 说明书 3/7 页 7 CN 105272838 B 7 0042 图6是本发明制备得到的巨大戟醇HPLC谱图。 具体实施方式 0043 本发明所要解决的技术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方法。 0044 本发明的技术方案： 巨大戟醇提取物的分离纯化方法， 包括如下步骤： 0045 a。
27、、 将巨大戟醇提取物加碱水解后， 加酸中和， 然后浓缩得到膏状物； 0046 b、 将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化， 所述硅胶柱层析装 置包括层析柱A和层析柱B， 层析柱A和层析柱B之间采用三通阀进行连接； 硅胶柱层析具体 操作如下： 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 在层析柱A中上样， 然后， 层析柱A采 用石油醚洗脱除杂， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层析柱A中加入乙酸乙酯洗 脱， 收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液； 0047 c、 将步骤b得到的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液减压浓缩后， 静置析出， 过滤得到巨 大戟醇。 0048 进一步地， 优选步。
28、骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取 溶剂提取得到； 所述提取溶剂为甲醇、 乙醇、 丙酮、 乙醚或氯仿。 0049 进一步地， 优选步骤a中所述巨大戟醇提取物的制备方法如下： 取大戟科大戟属植 物药材， 粉碎或切段， 按料液比1:520w/v加入提取溶剂进行回流提取， 提取14次， 每次 0.52小时， 合并提取液， 减压浓缩得巨大戟醇提取物。 0050 其中， w/v的单位为kg/L。 0051 进一步地， 优选所述大戟科大戟属植物为甘遂、 乳浆大戟、 千金子或南欧大戟。 0052 进一步地， 优选步骤a所述碱水解、 酸中和的操作如下： 取巨大戟醇提取物， 加入甲 醇或无水。
29、乙醇稀释， 甲醇或无水乙醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0.52倍， 加碱水解 0.524小时， 每升混合溶液中碱的含量为540g， 水解完毕， 加酸调节pH至7得到水解液， 然后将水解液浓缩得膏状物。 0053 进一步地， 优选步骤a中所述碱为氢氧化钠、 氢氧化钾、 甲醇钠或乙醇钠； 所述酸为 磷酸、 盐酸、 醋酸或甲酸。 0054 进一步地， 优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为： 0055 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 装填层析柱A和层析柱B， 层析柱A采 用石油醚洗脱平衡至无气泡， 层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡， 然后上样， 样品装 入层析柱A， 然后采用石油醚洗脱；。
30、 洗脱完毕， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 向层 析柱A中加入乙酸乙酯洗脱， 得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。 0056 进一步地， 优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为： 0057 调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 层析柱A先装填01/2柱体积的层析 用硅胶， 并用石油醚洗脱平衡至无气泡， 层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯 洗脱平衡至无气泡， 另将拌样硅胶与步骤a得到的膏状物按质量比11.5:1混合， 得到样品 ， 取样品 装入A柱， 上样量为层析柱A柱体积的1/21， 用26个柱体积的石油醚洗脱； 然 后， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 用26个柱。
31、体积的乙酸乙酯洗脱， 收集巨大戟 醇-乙酸乙酯混合液； 0058 或调节三通阀， 将层析柱A和层析柱B断开连接， 层析柱A装填1个柱体积层析用硅 说明书 4/7 页 8 CN 105272838 B 8 胶并用石油醚洗脱平衡至无气泡； 层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯洗脱平 衡至无气泡， 另将步骤a得到的膏状物用石油醚稀释得到样品， 石油醚的体积为膏状物体 积的0.53倍， 将1/21个柱体积的样品上样至层析柱A， 用26个柱体积的石油醚洗 脱； 然后， 调节三通阀， 使层析柱A和层析柱B连接， 用26个柱体积的乙酸乙酯洗脱， 收集巨 大戟醇-乙酸乙酯混合液。 0059 硅胶柱层析。
32、中， 优选最终收集合并巨大戟醇纯度80的巨大戟醇-乙酸乙酯混 合液。 纯度是通过高效液相(HPLC)检测的。 0060 进一步地， 为了达到更好的柱层析效果， 优选步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小 时0.55个柱体积。 0061 进一步地， 优选所述步骤b完成后， 拆出层析柱A中硅胶， 保留层析柱B中硅胶， 重新 装填层析柱A， 然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离 纯化， 进行连续操作。 0062 进一步地， 优选步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵； 更进一步地， 优选 湿法上样、 洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯采用泵送加入。 0063 硅胶柱层析湿法上样时可。
33、通过泵送加入。 湿法上样即将膏状物加石油醚稀释后上 样， 即样品。 0064 进一步地， 优选步骤c中所述静置析出， 优选在-205下静置024h。 0065 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述， 并不因此将本发明限 制在所述的实施例范围之中。 0066 实施例1 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 0067 取甘遂饮片10kg， 采用体积百分比浓度为95的乙醇回流提取3次。 第一次加入 100L回流提取2小时， 第二次加入80L回流提取1小时， 第三次加入80L回流提取1小时， 合并 提取液， 减压浓缩至浸膏状； 0068 上述提取浸膏加甲醇稀释至5L， 搅匀使充分溶解， 然后加入。
34、25g氢氧化钾,， 搅拌水 解12小时， 然后加盐酸调节pH至7以终止水解， 水解液减压浓缩至浸膏状； 0069 选取同等规格的层析柱A和B(10100cm)， 按图1所示连接， 先调节三通阀， 使层析 柱A和B断开连接， 层析柱B预装1.2kg层析用硅胶， 并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡， 层析柱 A预装600g层析用硅胶， 并用石油醚洗脱平衡至无气泡， 取1/2体积的上述浸膏加拌样硅胶 350g拌样， 烘干， 将烘干的样品上样于层析柱A中， 采用3个柱体积石油醚洗脱以除去非极性 杂质； 然后调节三通阀， 使层析柱A和B串联， 换4个柱体积乙酸乙酯洗脱； 待巨大戟醇全部洗 脱下来， 拆出层析柱。
35、A中硅胶， 保留层析柱B中填料， 采用同样方法将剩余的浸膏拌样， 上样 洗脱， 收集合并巨大戟醇洗脱部位； 0070 将上述巨大戟醇部位减压浓缩后， 置冰箱-5条件下24小时， 析出， 过滤， 得到巨 大戟醇晶体2.3g， 经高效液相检测纯度达到99.9以上。 0071 实施例2 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 0072 取千金子50kg， 碾碎， 用甲醇回流提取3次。 第一次加入400L回流提取2小时， 第二 次加入300L回流提取1.5小时， 第三次加入300L回流提取1.5小时， 合并提取液， 减压浓缩至 浸膏状； 0073 上述提取浸膏加无水乙醇稀释至30L， 搅匀使充分溶解， 然后加入。
36、300g氢氧化钠， 说明书 5/7 页 9 CN 105272838 B 9 搅拌水解16小时， 然后加磷酸调节pH至7以终止水解， 水解液减压浓缩至浸膏状； 0074 选取同等规格的层析柱A和B(2060cm)， 按图1所示连接， 先调节三通阀， 使层析 柱A和B断开连接， 层析柱B预装10kg层析用硅胶， 并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡， 层析柱A 预装10kg层析用硅胶， 并用石油醚洗脱平衡至无气泡， 取1/2上述浸膏加石油醚10L稀释溶 解， 将溶解好的样品上样于层析柱A中， 采用5个柱体积石油醚洗脱以除去非极性杂质， 调节 三通阀， 使层析柱A和B串联， 换6个柱体积乙酸乙酯洗脱； 待。
37、巨大戟醇全部洗脱下来， 拆出层 析柱A中硅胶， 保留层析柱B中填料， 采用同样方法将剩余的浸膏稀释溶解， 上样洗脱， 收集 合并巨大戟醇洗脱部位； 0075 将上述巨大戟醇部位减压浓缩后， 置冰箱-5条件下24小时， 析出， 过滤， 得到巨 大戟醇晶体11g， 经高效液相检测纯度达到99.9以上。 0076 实施例3 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 0077 取千金子200kg， 碾碎， 用甲醇回流提取3次。 第一次加入1600L回流提取2小时， 第 二次加入1200L回流提取1.5小时， 第三次加入1200L回流提取1.5小时， 合并提取液， 减压浓 缩至浸膏状； 0078 上述提取浸膏加甲醇。
38、稀释至80L， 搅匀使充分溶解， 然后加入2.4kg甲醇钠,搅拌水 解16小时， 然后加盐酸调节pH至7以终止水解， 水解液减压浓缩至浸膏状； 0079 选取同等规格的层析柱A和B(23150cm)， 按图1所示连接， 先调节三通阀， 使层析 柱A和B断开连接， 层析柱B预装20kg硅胶， 并用乙酸乙酯洗脱平衡， 层析柱A预装10kg硅胶， 并用石油醚洗脱平衡， 取1/2体积的上述浸膏加硅胶6kg拌样， 烘干， 将烘干的样品上样于层 析柱A中， 采用5个柱体积石油醚洗脱以除去非极性杂质； 然后调节三通阀， 使层析柱A和B串 联， 换6个柱体积乙酸乙酯洗脱； 待巨大戟醇全部洗脱下来， 拆出层析柱。
39、A中硅胶， 保留层析 柱B中填料， 重新装填层析柱A， 采用同样方法将剩余的一半浸膏拌样， 上柱， 洗脱， 收集合并 巨大戟醇洗脱部位； 0080 将上述巨大戟醇部位减压浓缩后， 置冰箱-5条件下24小时， 析出， 过滤， 得到巨 大戟醇晶体45g， 经高效液相检测纯度达到99.9以上。 0081 实施例4 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 0082 取千金子300kg， 碾碎， 采用体积百分比浓度为95的乙醇回流提取3次。 第一次加 入3000L回流提取2小时， 第二次加入2400L回流提取1.5小时， 第三次加入2400L回流提取 1.5小时， 合并提取液， 减压浓缩至浸膏状； 0083 上述。
40、提取浸膏加甲醇稀释至150L， 搅匀使充分溶解， 然后加入6kg氢氧化钠， 搅拌 水解16小时， 然后加磷酸调节pH至7以终止水解， 水解液减压浓缩至浸膏状； 0084 选取同等规格的层析柱A和B(23150cm)， 按图1所示连接， 先调节三通阀， 使层析 柱A和B断开连接， 层析柱B预装20kg硅胶， 并用乙酸乙酯洗脱平衡， 层析柱A预装20kg硅胶， 并用石油醚洗脱平衡， 取1/3体积的上述浸膏加石油醚稀释1.5倍使溶解， 将溶解好的样品 上样于层析柱A中， 采用4个柱体积的石油醚洗脱以除去非极性杂质； 然后， 调节三通阀， 使 层析柱A和B串联， 换5个柱体积的乙酸乙酯洗脱； 待巨大戟。
41、醇全部洗脱下来， 拆出层析柱A中 硅胶， 保留层析柱B中填料， 重新装填层析柱A， 采用同样方法将剩余的浸膏分2次稀释溶解， 上样， 洗脱， 收集合并巨大戟醇洗脱部位； 0085 将上述巨大戟醇部位减压浓缩后， 置冰箱-5条件下24小时， 析出， 过滤， 得到巨 说明书 6/7 页 10 CN 105272838 B 10 大戟醇晶体72g， 经高效液相检测纯度达到99.9以上。 0086 实施例5 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 0087 取乳浆大戟300kg， 切段， 采用体积百分比浓度为95的乙醇回流提取3次。 第一次 加入3000L回流提取2小时， 第二次加入2400L回流提取1.5小时。
42、， 第三次加入2400L回流提取 1.5小时， 合并提取液， 减压浓缩至浸膏状； 0088 上述提取浸膏加甲醇稀释至150L， 搅匀使充分溶解， 然后加入6kg氢氧化钠， 搅拌 水解16小时， 然后加磷酸调节pH至7以终止水解， 水解液减压浓缩至浸膏状； 0089 选取同等规格的层析柱A和B(23150cm)， 按图1所示连接， 先调节三通阀， 使层析 柱A和B断开连接， 层析柱B预装20kg硅胶， 并用乙酸乙酯洗脱平衡， 层析柱A预装20kg硅胶， 并用石油醚洗脱平衡， 取1/3体积的上述浸膏加石油醚稀释1.5倍使溶解， 将溶解好的样品 上样于层析柱A中， 采用4个柱体积的石油醚洗脱以除去非。
43、极性杂质； 然后， 调节三通阀， 使 层析柱A和B串联， 换5个柱体积的乙酸乙酯洗脱； 待巨大戟醇全部洗脱下来， 拆出层析柱A中 硅胶， 保留层析柱B中填料， 重新装填层析柱A， 采用同样方法将剩余的浸膏分2次稀释溶解， 上样， 洗脱， 收集合并巨大戟醇洗脱部位； 0090 将上述巨大戟醇部位减压浓缩后， 置冰箱-5条件下24小时， 析出， 过滤， 得到巨 大戟醇晶体70g， 经高效液相检测纯度达到99.9以上。 0091 实施例6 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 0092 取南欧大戟300kg， 切段， 采用体积百分比浓度为95的乙醇回流提取3次。 第一次 加入3000L回流提取2小时， 第二。
44、次加入2400L回流提取1.5小时， 第三次加入2400L回流提取 1.5小时， 合并提取液， 减压浓缩至浸膏状； 0093 上述提取浸膏加甲醇稀释至150L， 搅匀使充分溶解， 然后加入6kg氢氧化钠， 搅拌 水解16小时， 然后加磷酸调节pH至7以终止水解， 水解液减压浓缩至浸膏状； 0094 选取同等规格的层析柱A和B(23150cm)， 按图1所示连接， 先调节三通阀， 使层析 柱A和B断开连接， 层析柱B预装20kg硅胶， 并用乙酸乙酯洗脱平衡， 层析柱A预装20kg硅胶， 并用石油醚洗脱平衡， 取1/3体积的上述浸膏加石油醚稀释1.5倍使溶解， 将溶解好的样品 上样于层析柱A中， 。
45、采用4个柱体积的石油醚洗脱以除去非极性杂质； 然后， 调节三通阀， 使 层析柱A和B串联， 换5个柱体积的乙酸乙酯洗脱； 待巨大戟醇全部洗脱下来， 拆出层析柱A中 硅胶， 保留层析柱B中填料， 重新装填层析柱A， 采用同样方法将剩余的浸膏分2次稀释溶解， 上样， 洗脱， 收集合并巨大戟醇洗脱部位； 0095 将上述巨大戟醇部位减压浓缩后， 置冰箱-5条件下24小时， 析出， 过滤， 得到巨 大戟醇晶体76g， 经高效液相检测纯度达到99.9以上。 0096 上述原料甘遂、 千金子、 乳浆大戟和南欧大戟均为成都市荷花池药材市场购买所 得。 说明书 7/7 页 11 CN 105272838 B 11 图1 图2 说明书附图 1/5 页 12 CN 105272838 B 12 图3 说明书附图 2/5 页 13 CN 105272838 B 13 图4 说明书附图 3/5 页 14 CN 105272838 B 14 图5 说明书附图 4/5 页 15 CN 105272838 B 15 图6 说明书附图 5/5 页 16 CN 105272838 B 16 。