技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及人TWIST1/Vimentin基因甲 基化检测标志物及试剂盒
背景技术
膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶 性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率 的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全 国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的 第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增 长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。 临床上膀胱癌具有恶性程度高、术后复发率高等特点，因此早期诊断 对治疗和预防复发有着非常重要的意义，可以增加保留膀胱的机会并 提高患者总体生存率。
众所周知，恶性肿瘤的发生发展是一个多基因作用的多阶段过 程。大量研究表明，有一套特定基因的改变导致并推动了癌症的发生 发展：染色体不稳定性、微卫星不稳定性、表观遗传学改变等。表观 遗传是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以遗传 给子代细胞的基因组修饰作用，目前最为人们所知的表观遗传学主要 方式是DNA甲基化。由于DNA甲基化往往发生在膀胱癌发生过程中 的早期，很容易在患者的尿液中检测到。因此，检测尿液中DNA甲 基化状态有望成为膀胱癌早期无创诊断的一条新途径。
膀胱癌DNA分子甲基化检测组合物一直以来都没有其特有的基 因，多数研究是联合几个基因同时检测尿液中基因甲基化水平，以此 来提高灵敏度与特异性。根据最新的文献报道，研究人员已经通过大 规模的基因筛选和样本测序，发现在膀胱癌发生早期尿液脱落细胞中 1-2个基因的甲基化概率明显增加，这为膀胱癌早期辅助诊断提供了 可靠的检测标志物。
TWIST1是碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中高度保守的转录因子， 其mRNA在胎盘组织表达量最高，在胚胎发生、发展中发挥重要作 用。它参与上皮间质转化过程的调控，进而影响肿瘤的侵袭与转移。 转移性肿瘤中常见TWIST1过表达或启动子的甲基化。目前国内外涉 及膀胱肿瘤与TWIST1基因的相关性研究包括，TWIST1蛋白表达与 肿瘤的相关性分析，以及尿液标本甲基化水平检测。IsabelleRenard 等人研究发现，在膀胱癌尿液样本中TWIST1甲基化的检出率达到 88％，特异性达到94％。
Vimentin是中间丝纤维蛋白家族的一员，在很多方面表现出复 杂的基因表达模式，主要表达于胚胎组织和来源于间叶组织的成体细 胞。越来越多的研究表明，Vimentin的表达不再是间充质起源细胞、 向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志，它也在乳腺癌、膀胱癌、 子宫内膜癌等上皮源性恶性肿瘤中共同表达，而且与癌细胞的侵袭性 强和易转移密切相关。另有研究证实，与肿瘤癌前病变(如腺瘤)产生 相关的Vimentin的表达下调可能与其启动子的甲基化密切相关，这提 示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin表达，其对于肿瘤 细胞迁移具有促进作用。
目前，膀胱镜检查、对可疑病变组织进行活检以及对尿液进行细 胞学检查仍然是膀胱肿瘤临床最常用的诊断和随访方法。然而，膀胱 镜检查是一种侵入性且昂贵的检查方法，给患者带来痛苦及经济负 担；尿液细胞学检查的灵敏度不高，阳性率较低，给临床应用带来不 便。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的膀胱癌检测标 志物以及试剂盒，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、 样本易存放和无创伤性等优点。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：人TWIST1/Vimentin基 因甲基化检测标志物，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志 物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针；
所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：
引物、探针 序列(5‘-3’) TWIST1-F CGGTAAGAAGTTTGCGGGTTG TWIST1-R AAATACGCTAACGCTCCC TWIST1-P FAM-AGCGGCGGCGGGAGTT-MGB Vimentin-F TAATCGGCGGGATAGTAGGG Vimentin-R GCGCCTCTATCCATCGACTT Vimentin-P FAM-CGTCGTTTCGTAATTTTCG-MGB ACTB-F GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT ACTB-R CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA ACTB-P VIC-ACCACCACCCAACACACAA-MGB
。
本发明还提供一种人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒， 其特征在于，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒包括：
提取试剂：尿液保存液、尿液漂洗液、裂解液、提取漂洗液、洗 脱液；
硫化纯化试剂：硫化试剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化 漂洗液1、纯化漂洗液2、纯化漂洗液3、洗脱液；
PCR检测试剂：TWIST1PCRMix、VimentinPCRMix、ACTBPCR Mix、阴性质控品、阳性质控品、聚合酶。
所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒用于检测时的 PCR程序如下：首先95℃变性5分钟，然后95℃变性20秒、62℃退 火40秒，并进行45次循环，PCR循环过程中，仪器升降温速度设定 为1.3℃/S，最后40℃维持30秒。
所述PCR结果在480II上进行TWIST1/Vimentin/ACTB的Cp值分析，根据空白对照组、阴性质控品、阳性质控品、待测样品的扩增情况，确定试验结果的有效性并对样本结果进行判读。
所述PCR结果的分析具体如下：
1)在480基本软件模块栏中选择“AnalysisOverview”；
2)选择“AbsQuant/2ndDerivativeMax”分析模式；
3)选择“FilterComb465-510”；
4)点击“Calculate”，软件自动给出目的基因TWIST1/Vimentin 的Cp值；
5)选择“FilterComb533-580”；
6)点击“Calculate”，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。
所述PCR结果的具体判读如下表：
若判读结果为阴性，患膀胱癌风险性较低；若判读结果为阳性， 患膀胱癌风险较高，建议镜检确认。
本试剂盒采用荧光PCR法检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化 指标。将待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照进 行PCR扩增反应，对检测基因和内参基因进行双重PCR扩增反应。 通过对所述待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照 的参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情 况。
本发明选择TWIST1和Vimentin两个基因中的标志片段进行膀胱 癌检测，未见于任何报道，将其作为检测标志物，灵敏度高、特异性 强。本发明组合物首次建立TWIST1和Vimentin双基因联合检测膀胱 癌尿液脱落细胞基因甲基化体系，不仅可以用于膀胱癌早期诊断，还 可以预测术后复发。
本发明在较少样本体积(5mL)下进行，依然可得到相同水平的 灵敏度和特异性，可适用于小体积样本的检测。
采用本发明检测膀胱癌尿液中TWIST1与Vimentin甲基化情况， 具有操作简单、快速、灵敏度高，特异性好，无创伤等优点，适合于 复发率很高的膀胱癌的早期诊断与随访，使需定期进行膀胱镜检查的 患者数量明显减少，具有很高的临床应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例
1、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测体系
样本：人尿液样本、阳性质控品、阴性质控品以及空白对照样本；
仪器：Lightcycler480、高速离心机、金属浴、PCR仪、漩涡震 荡仪等；
TWIST1、Vimentin和ACTB三个基因的甲基化引物和探针如下 所示：
引物、探针 序列(5‘-3’) TWIST1-F CGGTAAGAAGTTTGCGGGTTG TWIST1-R AAATACGCTAACGCTCCC TWIST1-P FAM-AGCGGCGGCGGGAGTT-MGB
Vimentin-F TAATCGGCGGGATAGTAGGG Vimentin-R GCGCCTCTATCCATCGACTT Vimentin-P FAM-CGTCGTTTCGTAATTTTCG-MGB ACTB-F GATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT ACTB-R CCAATAAAACCTACTCCTCCCT ACTB-P VIC-ACCACCACCCAACACACAA-MGB
2、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒
2.1根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因提取试 剂，具体组分如下：
注：*表示粉末，需加入相应体积的溶剂溶解后才能使用；**表示浓缩液，需加入 相应体积的无水乙醇才能使用
2.2根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因硫化纯 化试剂，具体组分如下：
注：*表示粉末，需加入相应体积的溶剂溶解后才能使用；**表示浓缩液，需加入 相应体积的无水乙醇才能使用
2.3根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因PCR检 测试剂，具体组分如下：
2.4根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因质控品 试剂，具体组分如下：
组分 规格 包装 备注 阳性质控品 1.2mL/支 棕色离心管 T47D细胞DNA 阴性质控品 1.2mL/支 棕色离心管 293细胞DNA
3、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒检测过程
3.1、人TWIST1/Vimentin基因DNA提取
a)试剂准备
提取漂洗液：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。
b)提取步骤
3.1.1取一支15mL离心管(自备)，加入5mL尿液样本，3500rpm 离心10min，弃掉上清，保留沉淀；
3.1.2尿沉淀用500μLPBS(4℃预冷)悬浮分装到1.5mL离心管 中，3500rpm离心5min(4℃)，弃掉上清；
3.1.3重复1次步骤3.1.2；
3.1.4尿沉渣用500μLPBS重悬，加入750μL裂解液，颠倒混匀 15次，涡旋震荡1min；
3.1.5将上述混合液转入到已装入收集管的吸附柱中，10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重 复操作，将剩余混合液转入吸附柱；
3.1.6向吸附柱中加入500μL的提取漂洗液，10000rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
3.1.7向吸附柱中加入500μL的85％乙醇(自备)，10000rpm离 心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
3.1.8重复1次步骤3.1.7；
3.1.912000rpm空离2min，彻底去除残余的乙醇，以免其影响 后续反应；
3.1.10将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，向吸附柱的中 间部位悬空加入56℃预热的30μL的洗脱液，室温放置5-10min， 12000rpm离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。
3.2、人TWIST1/Vimentin基因DNA硫化纯化
a)试剂准备
(1)硫化试剂：加入1mL灭菌水，室温涡旋振荡10min至粉末 完全溶解。
(2)纯化漂洗液1：初次使用前加入40mL无水乙醇，振荡混匀。
(3)纯化漂洗液2：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。
(4)纯化漂洗液3：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。
b)操作步骤
3.2.1取一只PCR管，加入30μLDNA溶液，100μL硫化试剂溶 液，30μLDNA保护液，轻弹管壁混匀后瞬离；
3.2.2将PCR管放入PCR仪，运行下列程序：
80℃for1hours；
20℃storageupto20hours；
3.2.3取一只2mL的EP管，加入1mL的结合液，再加入上述转 化修饰产物(约160μL)，涡旋振荡15s，瞬离；
3.2.4加入20μL磁珠，涡旋振荡混匀，室温振荡20min，将离 心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；
3.2.5加入500μL纯化漂洗液1，涡旋混匀10s，将离心管放置 在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；
3.2.6加入500μL纯化漂洗液2，涡旋混匀10s后，室温振荡10 min，将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；
3.2.7加入500μL纯化漂洗液3，涡旋混匀10s，将离心管放置 在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；
3.2.8加入500μL纯化漂洗液1，涡旋混匀10s，将离心管放置 在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；
3.2.9重复步骤3.2.8；
3.2.10小心去除残留液体，自然干燥10min；
3.2.11向磁珠加入50μL预热到80℃的洗脱液，充分混匀后 80℃孵育10min，中间再混匀一次；
3.2.12将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，吸取 上清(bisDNA)至新的离心管保存备用。
3.3、PCR检测
3.3.1将试剂盒组分置于4℃冰箱中，自然融化，瞬离至管底；
3.3.2按照下表反应体系，配制PCRMix和DNA聚合酶混合液， 混匀后分装至PCR管，样品、质控品和纯化水作为模板加入，每个 反应体积为20μL；
PCR反应体系
3.3.3根据待测样品数量设计加样布局，推荐PCR布局
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A PC-T PC-V S5-T S5-V S13-T S13-V S20-T S20-V S28-T S28-V S36-T S36-V B PC-T PC-V S6-T S6-V S14-T S14-V S21-T S21-V S29-T S29-V S37-T S37-V C NC-T NC-V S7-T S7-V S15-T S15-V S22-T S22-V S30-T S30-V S38-T S38-V D NC-T NC-V S8-T S8-V S16-T S16-V S23-T S23-V S31-T S31-V S39-T S39-V E S1-T S1-V S9-T S9-V S17-T S17-V S24-T S24-V S32-T S32-V S40-T S40-V F S2-T S2-V S10-T S10-V S18-T S18-V S25-T S25-V S33-T S33-V S…-T S…-V G S3-T S3-V S11-T S11-V S19-T S19-V S26-T S26-V S34-T S34-V NTC-T NTC-V H S4-T S4-V S12-T S12-V S20-T S20-V S27-T S27-V S35-T S35-V NTC-T NTC-V
注：PC：PositiveControl，阳性质控品；NC：NegativeControl，阴性质控品；NTC： NoTemplateControl，无模板对照；S：Sample，检测样品；T：检测TWIST1；V：检测 Vimentin。
3.3.4按照下表指示设置反应程序
样品上机后，保存实验名称，运行PCR反应，并及时根据实验 布局编写加样排版和样品名称。
3.4PCR结果分析
3.4.1在480基本软件模块栏中选择“Analysis”；
3.4.2选择“AbsQuant/2ndDerivativeMax”分析模式；
3.4.3选择“FilterComb465-510”；
3.4.4点击“Calculate”，软件自动给出目的基因TWIST1/Vimentin 的Cp值；
3.4.5选择“FilterComb533-580”；
3.4.6点击“Calculate”，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。
3.4.7所述PCR结果的具体判读如下表所示：
若判读结果为阴性，患膀胱癌风险性较低；若判读结果为阳性， 患膀胱癌风险较高，建议镜检确认。
4、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒的分析性能评估
按照本领域中常规的制作及检定规程对本试剂盒进行检定，结果 如下：
4.1外观和性状
4.1.1试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；中文包装标签 应清晰、准确、牢固；
4.1.2液体组分应清澈透明，无沉淀、无悬浮物、无絮状物；
4.1.3固体组分应颗粒分明、色泽均一，无结块、无杂质。
4.2提取、硫化纯化效率
4.2.1对TWIST1强阳提取参考品、弱阳提取参考品进行提取、 硫化纯化，经荧光PCR检测其为阳性；
4.2.2对Vimentin强阳提取参考品、弱阳提取参考品进行提取、 硫化纯化，经荧光PCR检测其为阳性。
4.3准确性
4.3.1检测TWIST1阳性参考品，阳性符合率为100％；
4.3.2检测Vimentin阳性参考品，阳性符合率为100％；
4.3.3检测准确性参考品，阳性符合率应为100％。
4.4特异性
4.4.1检测TWIST1阴性参考品，阴性符合率为100％；
4.4.2检测Vimentin阴性参考品，阴性符合率为100％；
4.4.3检测特异性参考品，阴性符合率应为100％。
4.5灵敏度
4.5.1在10ng/mL野生型基因组DNA背景下，对TWIST1甲基 化DNA含量为5％的灵敏度参考品能够准确检出；在TWIST1甲基化 DNA含量为10％背景下，对DNA浓度为5ng/mL的灵敏度参考品能 够准确检出；
4.5.2在10ng/mL野生型基因组DNA背景下，对Vimentin甲基 化DNA含量为5％的灵敏度参考品能够准确检出；在Vimentin甲基 化DNA含量为10％背景下，对DNA浓度为5ng/mL的灵敏度参考品 能够准确检出。
4.6精密度
4.6.1对TWIST1强阳精密度参考品、弱阳精密度参考品重复检 测10次，阳性检出率为100％，且CV≤5％；
4.6.2对Vimentin强阳精密度参考品、弱阳精密度参考品重复检 测10次，阳性检出率为100％，且CV≤5％。
4.7稳定性
4.7.1效期稳定性：本产品有效期6个月。取到期后的样品检测， 应符合4.1～4.6的要求。
5、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒的验证评估
利用41例膀胱癌、34例膀胱炎症尿液样本来验证试剂盒，对结 果进行分析：本发明的特异性为87.5％，灵敏度为82.7％。
本发明灵敏度高、特异性强，即使在较少样本体积(5mL)下进 行，依然可得到相同水平的灵敏度和特异性，可适用于小体积样本的 检测。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做 出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。