技术领域
本发明属于农产品贮藏与加工领域，更具体地，涉及一种莲藕节多酚提取物及其制备方法和应用。
背景技术
莲藕，即我们俗称的藕，属莲科。莲藕在我国种植范围比较大，一般分布在江苏、安徽、湖北、河南、河北以及浙江等省，是一种种植区的重要农业经济作物。莲藕口感偏甜，清脆可口，既可生吃也可煮熟后食用，是家庭餐桌常见菜之一。同时，藕的药用价值也比较高，它的根茎、叶子、花和果实都是宝，都可作药用。用藕制成粉，能消食、止泻，开胃、清热，防止内出血，是老人、孩子、体弱多病者绝佳的流质食品和滋养佳品。
藕节，是莲藕除去根须后莲的干枯根茎节部位，性味甘涩，中医记载其对医治吐血、便血、尿血具有一定疗效。相对莲藕来说，藕节的质地较硬、口感较差，在加工过程中常常被丢弃，易造成不可逆的环境污染和资源浪费。目前对藕节的综合利用主要是作为中药材及保健滋补品，例如：简单加工炮制成藕节炭，或利用喷雾干燥制备成藕节颗粒剂等，该方法未能充分利用大量的藕节副产物资源，产品的附加值不高、普适性较差。研究表明，藕节富含酚类和膳食纤维，具有控制体重、调节血脂血糖和改善肠道功能的作用，是一种极好的活性膳食来源。
目前果蔬的保鲜方法以物理(湿热和非热处理)、化学(抗氧化剂和护色剂)以及生物(菌种干预)法为主，主要目的旨在抑菌和灭酶，成本较高或引入了外源添加。常用化学保鲜剂保藏(如一定浓度的焦亚硫酸钠溶液，柠檬酸溶液，氯化钙溶液和明矾液的混合液按一定比例混合)，乳酸剂处理，盐水贮藏，塑料薄膜真空包装等等，虽也有长期的应用基础，但都不可避免的破坏了莲藕原有的特殊风味，违背了农业资源绿色生态可持续发展的原则。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中保鲜剂保藏对食品原有风味造成破坏、成本较高、易引入外源添加的问题。
本课题组研究发现，藕节中含有的多酚类物质比莲藕更丰富，包括鞣质、酚酸、原花青素、黄酮等。莲藕多酚及其提取物具有抗氧化、抑制金黄色葡萄球菌、降血糖、加强记忆力及神经发育的功能。除此以外，莲藕多酚还是莲藕褐变的关键酶多酚氧化酶PPO的作用底物，调控着莲藕储藏期内的酶促反应。倘若将藕节这种天然活性资源进行高附加值化综合利用，将其多酚提取物反过来应用于食品加工中作为抑制果蔬褐变的保鲜剂、食品添加剂(抗氧化剂)，势必具有较好的工业化前景。且此前并未见文献报道。将莲藕节多酚作为果蔬褐变抑制剂，取之于“果蔬”用之于“果蔬”，可有效解决上述外源化合物添加的问题，且保鲜效果较好。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种莲藕节多酚提取物，该多酚提取物包括表儿茶素、儿茶素、芦丁、绿原酸、咖啡酸、没食子酸丙酯和原花青素低聚体。
经检测，以多酚提取物的总重量为基准，所述表儿茶素的含量为8-12wt％，所述儿茶素的含量为1-3wt％，所述芦丁的含量为1-3wt％，所述绿原酸的含量为2-5wt％，所述咖啡酸的含量为1-5wt％，所述没食子酸丙酯的含量为8-12wt％，所述原花青素低聚体的含量为25-28wt％。
本发明的第二方面提供一种莲藕节多酚提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
以纤维素酶和果胶酶的复合酶对莲藕节进行水酶法提取，得到初级提取物；
对初级提取物进行膜分离，得到的透过液进行蒸发浓缩和干燥，得到所述莲藕节多酚提取物。
本发明中，所述水酶法的条件包括：料液重量比为1：5-20，复合酶的浓度为0.1-0.3mg/mL。
本发明中，所述纤维素酶和所述果胶酶的质量比优选为1-2：1-2。
本发明中，所述水酶法的条件包括：酶解时间优选为60-120min，温度优选为50-70℃，pH值优选为3-5。
本发明中，所述膜分离的条件包括：采用20-100kDa的超滤膜对初级提取物进行膜分离，转速为200-600rpm，压力为0.2-0.4MPa。
作为本发明一个优选的实施方式，所述蒸发浓缩为薄膜蒸发浓缩，所述干燥为喷雾干燥。
本发明的第三方面提供由所述方法制得的莲藕节多酚提取物。
本发明的第四方面提供所述的莲藕节多酚提取物作为抑制果蔬褐变的保鲜剂和/或食品抗氧化剂的应用。
本发明中，所述保鲜剂和/或食品抗氧化剂为喷剂、粉剂或颗粒剂。
通过研究莲藕节多酚对莲藕等果蔬感官和贮藏品质的影响发现，该多酚提取物能作为一种天然的果蔬保鲜剂，其中抑制酶促褐变和抗氧化是其主要的保鲜机理。
同时，莲藕节多酚可以作为食品保鲜剂添加到新鲜果蔬中延长其货架期，也可以作为食品抗氧化剂添加到固体或液体食品中形成保健食品或饮品。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、目前果蔬的保鲜方法以物理(湿热和非热处理)、化学(抗氧化剂和护色剂)以及生物(菌种干预)法为主，主要目的旨在抑菌和灭酶，成本较高或引入了外源添加。莲藕节多酚属膳食来源，作为多酚氧化酶的作用底物，可调控酶促反应，且抑制果蔬褐变效果显著，是一种良好的天然果蔬保鲜剂和抗氧化剂。
2、本发明制备莲藕节多酚的过程结合了生物酶提取和膜分离纯化技术，制备得率较高，得到的是一种天然无毒副作用的提取物，整个制备过程绿色低碳环保，可广泛应用于食品加工。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了莲藕节多酚提取物的高效液相色谱图(280nm)。
图2示出了莲藕片浸泡处理后储存3-8天色度的变化图。
图3示出了荔枝储存不同天数果壳色度(L*和a*)的变化图。
图4示出了荔枝储存不同天数果壳中花色苷含量的变化图，图中每组左侧柱为对照组，右侧柱为样品组。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1：莲藕节多酚提取物的成分分析和结构表征
1实验材料：
1.1实验原料：鄂莲5号莲藕
1.2实验试剂：纤维素酶(10000U/g)、果胶酶(30000U/g)、福林-酚试剂、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3和NaOH等。
1.3主要仪器：
分光光度计，Agilent 1100高效液相色谱质谱联用仪。
2实验方法：
2.1莲藕节多酚提取物的制备：
以莲藕节为原料，以纤维素酶和果胶酶的复合酶对莲藕节进行水酶法提取，确定其提取条件为料液比1：20，酶浓度为0.15mg/mL，其中纤维素酶和果胶酶质量比为2：1，酶解时间为90min，酶解温度为62.5℃，pH＝4；使用100kDa的超滤膜对水酶提取液进行膜分离纯化，转速600rpm，压力0.3MPa；透过液经过薄膜蒸发浓缩和喷雾干燥得到所述莲藕节多酚提取物。
2.2莲藕节多酚的成分分析和结构表征：
2.2.1总酚和黄酮含量的分析
总酚含量的测定
配制溶液：依次配制20％无水碳酸钠溶液(热水溶解，冷却至室温，24h后过滤)，没食子酸酚母液和Folin-cioialteau试剂。
绘制标准曲线：分别取浓度为0、50、100、150、250、500mg/L的标准溶液0.2mL加至12mL去离子水中，混合后加入1mL Folin-cioialteau试剂，均匀混合30s再静置8min，最后加入3mL 20％碳酸钠溶液，定容至20mL。室温下放置2h后，765nm下比色，用吸光度值对标液浓度制作标准曲线。计算回归方程为Y＝0.0015X-0.0082，R2＝0.9999。
精确称量5mg样品，加少量蒸馏水溶解后定容至50mL。取1mL待测溶液，用测定标准曲线的方法分析，所得吸光度值后带入方程计算饮料中的总酚含量。
黄酮含量的测定
芦丁标准溶液的配制：准确称取芸香苷(Rutin，芦丁)10mg到小烧杯中，加入少量纯水，水浴加热使之部分溶解，将溶液转移至100mL容量瓶中冷却定容，得到0.1mg/mL的芦丁标准液。
标准曲线的制备：以芦丁为标准物质，准确吸取芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5mL分别置于10mL刻度比色管中，加30％乙醇溶液定容至5mL，加入0.3mL 5％NaNO2溶液，摇匀，立刻加入0.3mL浓度为10％的Al(NO3)3溶液，放置5min，加入2mL浓度为4％的NaOH溶液，用30％乙醇定容到10mL，摇匀，同样放置5min，以0为空白，在510nm处测定吸光值，绘制芦丁含量与吸光值的标准曲线。
样品中总黄酮含量的测定：称取提取物5mg，用蒸馏水定容至50mL，按照标准曲线制作的方法，取3mL样液依次加入30％乙醇、NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液，静置20min后过滤，测定滤液的吸光度，并根据标准曲线换算为浓度。
2.2.2HPLC和HPLC-MS分析
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm,5μm)；柱温：28℃；检测波长：280nm；流速：1mL/min；流动相：A为0.4％的醋酸水溶液，B为乙腈。洗脱梯度：0-40min，5-35％B；40-45min，35-50％B；45-50min，50-80％B；50-55min，80-5％B，柱平衡10min，进样量20μL。
质谱选用负离子模式，电喷雾气压为20psi，干燥气流速为7.0L/min，干燥温度为325℃。离子扫描范围：50-1000m/z，同时进行二级破碎。
3实验结果：
3.1莲藕节多酚提取物中总酚含量为62.9％(对照品为没食子酸，纯度>95％)，黄酮含量为74.2％(对照品为芦丁，纯度>99％)。
3.2莲藕节多酚提取物中主要酚类化合物为表儿茶素、儿茶素、芦丁、绿原酸、咖啡酸、没食子酸丙酯和少量原花青素低聚体，见表1、图1。
表1 HPLC-MS表征莲藕节多酚提取物中主要的酚类化合物
测试例1：莲藕节多酚提取物对莲藕储藏期内褐变的抑制和品质的影响
1实验材料：
1.1实验原料：鄂莲5号莲藕、实施例1中制备的莲藕节多酚提取物。
1.2实验试剂：邻苯二酚、磷酸缓冲液等。
1.3主要仪器：色度仪、质构仪、分光光度仪。
2实验方法：
2.1莲藕节多酚提取物对鲜切莲藕的处理
配制5mg/mL的提取物溶液，置于4℃的冰箱中；待溶液的温度降至4℃时，放入5片鲜切藕并用保鲜膜密封容器；藕片低温浸泡1小时后取出蘸干，置于保鲜盒中10℃保存，相对湿度70％，贴好标签待测。
2.2莲藕感官和贮藏品质的变化
2.2.1失重率
在鲜切藕浸泡处理后的第3-8天内，每天定时测量其失重率及变化。
2.2.2色泽
在鲜切藕浸泡处理后的第3-8天内，每天定时测量其明度L*值，并用Origin软件制成折线图，用以观察莲藕色泽的变化趋势。
2.2.3多酚氧化酶(PPO)活性
邻苯二酚法测定：
①配制0.05mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液；0.1mol/L的邻苯二酚溶液。
②将研钵、50mL离心管置于冰中预冷，取鲜切藕样品3克置于其中，量取15mL磷酸缓冲液加入其中，冰浴研磨，并用磷酸缓冲液定容至50mL(50mL包括冲洗研磨棒和研钵的磷酸缓冲液)，对照品也按同样方式处理。
③将②制得的样品在4℃的环境下，以6000r/min的转速离心15min,将上清液转移到10mL的离心管，所得即为酶液。
④取7个10mL的离心管(其中包括一个空白，空白中加1mL蒸馏水，每组3个平行)，每支离心管中加入1.5mL磷酸缓冲液，1mL邻苯二酚溶液，空白中再加入1mL蒸馏水，然后在37℃的水浴锅中预热5min，在420nm处将空白管调零，在平行管中加入1mL酶液，并且立即开始计时，每隔一定时间计下吸光度值。
2.2.4质构
用质构仪测定。调整为TPA模式，P/45探头，100g触发力，预压速度10.0mm/s，下压速度0.5mm/s，压后上行速度10.0mm/s，两次压缩中间停顿5s，受压变形10％。
以未经多酚提取液浸泡直接冷藏的莲藕片作为对照。
3实验结果：
3.1失重率
在贮藏期间，由于莲藕进行呼吸作用和其他各项生理活动，进而导致莲藕的营养物质和水分等成分损失，从而使莲藕的质量下降，即产生失重率。所以失重率可以作为莲藕营养损失程度的参考指标。实验数据表明，经过多酚溶液浸泡的鲜切藕的失重率为2.22％，而对照品为5.31％，证明莲藕节多酚提取物溶液可以抑制莲藕的呼吸作用以及其他的生理活动，从而降低莲藕营养成分和水分的损失即失重率。结果如表2所示。
表2鲜切莲藕储存5天后的失重率
M——原重，单位为g
M1，M2，M3——分别是三次测量的现重，单位为g
W1，W2，W3——分别是三次求得的失重率
W——平均失重率
3.2色泽的变化
优质鲜藕的品质是肉质洁白嫩脆，因此莲藕的色泽(即明度L*)是评判莲藕品质的重要标准。由图2不难看出，莲藕节多酚浸泡藕片后，莲藕的初始L*变低，表明藕片白度下降，可能是由于多酚提取液本身的浅黄色造成。储存3-8天后，藕片的色泽逐渐变深，反映了莲藕的褐变程度。被多酚溶液处理过的藕片褐变速率明显较慢，而未经处理的对照样品存放8d后，藕片白度显著低于实施例。结果说明，藕节多酚提取液可以一定程度上减缓莲藕的褐变，并使其保持更好的颜色特征。
3.3PPO的变化
莲藕在普通的贮藏条件下，5天左右就会发生表皮褐变等现象，严重时还会使组织内部发生褐变，进而影响其食用品质。经研究表明，莲藕发生的主要褐变为酶促褐变，而引起酶促褐变的主要酶类为酚酶，在酚酶的催化作用下，莲藕中的大量酚类物质与氧气发生反应生成邻醌，进而聚合成褐色苏素或黑色素，所以抑制莲藕中的酶活性对于莲藕的保鲜至关重要。一个酶活力的单位定义为：在测试条件下，每分钟A420变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位，计算公式U＝A420*VT*60/(W*VS*0.01*t)，结果表示为ΔOD420nm·min-1·g-1(单位)。
经分析，实施例中莲藕PPO活性为33.333，而对照品的PPO活力为66.296。表明经过莲藕节多酚溶液处理的样品酶活力显著低于未经处理的对照品，证明藕节多酚可以抑制藕中多酚氧化酶的活性，从而减缓莲藕的品质劣变，与上述测定的莲藕明度L*这一指标所得出的结论是吻合的。
3.4质构的变化
硬度是指使事物保持内部形状的结合力，是使其达到一定变形所需要的力，也是评价莲藕的指标之一，如表3所示，本实验中的经莲藕节多酚溶液处理的鲜切藕的硬度比样品略低，可能是由于样品的厚度略薄造成。粘着性反映了咀嚼食物时，食物和上颚，牙齿，舌头等接触面附着时，剥离它们所需要的力，随着粘着性的增大，食品品质下降；弹性表示物体在外力作用下变形，当撤去外力后恢复原来状态的能力，与食品的质地的紧密程度相关；凝聚性反映的是食品抵抗受损的能力，反映细胞间结合力的大小；实施例的这三个指标优于对照品。咀嚼性是凝聚性，硬度，弹性三者的乘积的结果，是综合评价食品一项参数，从本实验可以看出，处理样品的咀嚼性评价远高于对照品，所以可认为其食用品质优于对照品。
表3鲜切莲藕储藏5天后的质构特性
测试例2：莲藕节多酚提取物对荔枝储藏期间褐变的抑制作用
1实验材料：
1.1实验原料：妃子笑荔枝、实施例1中制备的莲藕节多酚提取物。
1.2实验试剂：CH3COONa、CH3COOH、KCl、HCl、邻苯二酚等。
1.3主要仪器：色度仪、分光光度仪。
2实验方法：
2.1莲藕节多酚提取物对新鲜荔枝的处理
配制10mg/mL的提取物溶液，置于4℃的冰箱中；待溶液的温度降至4℃时，喷洒荔枝(正反面各15s，重复喷洒3次)，干燥1h后储存在10℃、湿度75％的环境中。比较收获期、储存7日、14日和21日后的各组荔枝(每组5-10个)的果壳表皮色度、花色苷含量等指标，判断荔枝的褐变程度。
2.2荔枝品质和果壳特征的变化
2.2.1色度
将新鲜采收、处理后储存7日、14日和21日的各组荔枝取出，测量其色度Lab值，并用Origin软件绘制成图，观察果壳色泽的变化。
2.2.2花色苷含量
荔枝果皮花色苷制备：将荔枝果皮清洗干净后，在组织捣碎机中捣碎，按料液比1:15加入pH为3.5的70％乙醇溶液，将烧杯密封后放入40℃水浴锅中恒温提取2h，再将提取液减压抽滤浓缩得到样品粗提液。将滤液过AB-8大孔树脂，用水洗去粗提取液中的糖、部分蛋白质，小分子的醛酸、羧酸以及一些花色苷降解物等不被吸附的杂质，再用70％乙醇溶液冲洗树脂吸附柱。收集该洗脱液，40℃水浴下旋转蒸发、冷冻干燥，即可获得荔枝果皮花色苷提取物。
缓冲液的配制：
pH＝1.0的缓冲液，0.2mol/L KCl：0.2mol/L HCl：水(50:97:53v/v/v)
pH＝4.5的缓冲液，1mol/L CH3COONa：1mol/L CH3COOH：水(100:60:90v/v/v)
总花色苷含量测定(pH示差法)：
准确称取8mg纯化过的干燥粉末样品，将其溶于50mL蒸馏水中，取4mL该溶液，分别用pH 1.0缓冲液和pH＝4.5的缓冲液稀释至12ml，置于暗处平衡30分钟。分光光度法测定时的空白对照为蒸馏水，在λmax和700nm处分别测定这两个样品稀释液的吸光值A。
计算公式为：C(mg/g)＝A×V×n×M/(ε×m)
式中：A-pH＝1.0、pH＝4.5时花色苷在λmax处的吸光度差值
A＝(Amax-A700)pH1.0-(Amax-A700)pH4.5
V—提取液总体积(mL)
n—稀释倍数
M—cy-3-glu(矢车菊-3-葡萄糖苷)的相对分子质量(449.4)
ε—cy-3-glu的消光系数(26900)
m—样品质量(g)
以未经多酚提取液处理直接进行冷藏的荔枝果作为对照。
3实验结果：
3.1色度的变化
用L*、a*、b*值表示荔枝果皮的色度，其中L*为光泽明亮度，L*值越大，亮度越高，范围从黑(0)到白(100)；a*值的正值表示色泽红/紫度，正值越大，红色越深，负值表示色泽浅蓝/绿度，负值越小，绿色越深；b*的正值表示黄色程度，负值表示蓝色程度。如图3所示，随着储存时间的延长，荔枝果皮的亮度和红色逐渐褪去，但经莲藕节多酚喷洒后，储存期内果壳的褐变程度明显减慢，可能与外源多酚替代了果壳中原有的酚类化合物成为多酚氧化酶PPO新的反应底物有关。
3.2果皮花色苷含量
研究表明荔枝果皮中花色苷的含量与色度a*显著相关，随着荔枝的存放时间逐渐变长，花色苷不断降解或氧化成醌，使荔枝果皮失去了原有的鲜艳颜色。如图4所示，经藕节多酚提取液喷洒的荔枝果壳中花色苷的含量降低较慢，直至储存21d后，处理后荔枝果皮提取物中花色苷的含量显著高于对照，与色度的研究结果相符。说明藕节多酚提取物喷洒可以有效抑制荔枝果壳褐变，保护果壳中含有的花色苷等酚类物质。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。