发明领域
本发明涉及地高辛(digoxin)和洋地黄毒苷(digitoxin)衍生物，其为Na,K-ATP酶的α2亚型的选择性抑制剂，并且其降低眼内压。本发明进一步涉及这些衍生物用于治疗与眼内压升高相关的病状，诸如青光眼，和/或作为强心剂的用途。
发明背景
青光眼是导致不可逆转的失明的疾病。眼内压(IOP)的控制是当前青光眼治疗的主体，并且通过局部或全身给予各种药物，诸如β-阻滞剂、前列腺素类似物、α2肾上腺素能受体激动剂、胆碱能激动剂和碳酸酐酶抑制剂来实现。如果药物能有效地透过角膜，局部途径是优选的，因为这使全身性副作用降到最低。尽管有可用的药物选择，但许多患者的IOP失控最终使手术干预成为必要。因此，青光眼药物治疗的新方法是非常需要的。
Na,K-ATP酶是睫状体上皮中房水产生的发动机(motor)，并且原则上，Na,K-ATP酶的抑制应抑制房水的产生，并控制IOP。IOP的控制是青光眼治疗的主体，但尽管有可用的药物选择，但药物治疗的新方法是非常需要的。以前，静脉注射地高辛，一种Na,K-泵的经典抑制剂，主要用于治疗充血性心力衰竭，由于这种作用而被考虑但由于全身毒性而被废弃(1,2)。
Na,K-ATP酶由α和β亚基(αβ)及附属FXYD调节亚基组成。存在α1亚基的四种亚型(α1-4)和β亚基的三种亚型(β1-3)，其以组织特异性方式表达。α1是常见的亚型，其在所有组织中维持Na和K梯度，而α2主要在肌肉和星形胶质细胞中表达，和α3主要在神经细胞中表达。人心脏表达α1(c.70%)及α2和α3亚型二者(c.30%)以及β1。眼中的睫状体上皮是由朝向血液的顶端色素细胞(PE)和朝向眼前房的基底外侧无色素(NPE)细胞组成的功能合胞体。
已知PE的主要Na,K-ATP酶亚型是α1β1，而NPE的主要Na,K-ATP酶亚型是α2β3(3)。因此，原则上，穿透完整眼睛并到达睫状体上皮的局部施用的α2选择性强心苷可有效地降低IOP，且如果它们穿透完整眼睛并到达睫状体上皮，它们可局部施用。局部施用的潜在优势可能是强心苷的典型的全身毒性作用应是最小的。
α2-选择性强心苷的另一种可能的应用可以是作为有效的强心剂，与已知的药物诸如地高辛相比，其具有降低的心脏毒性。洋地黄类药物诸如地高辛已用于治疗心力衰竭两百多年，但为具有多种副作用的危险药物。现有充分的证据表明α2的选择性抑制在增强心脏兴奋-收缩耦联和调解强心苷介导的正性肌力中特别有效(4)。α2(其为次要的亚型)的抑制可能不会引起细胞Ca超载(心脏毒性的标志)(5)。
先前已经研究了大量的已知强心苷的亚型选择性(6)，其使用表达Na,K-ATP酶亚型(α1β1、α2β1、α3β1)的酵母毕赤酵母(P.pastoris)和Na,K-ATP酶的纯化的清洁剂可溶性(detergent-soluble)亚型复合物(7-11)。相对于α1，在膜的3H-乌本苷(ouabain)置换测定中测量的洋地黄糖苷地高辛和洋地黄毒苷的解离常数KD显示出对α2/α3的中度选择性(3-4倍)。相比之下，糖苷配基诸如地高辛配基(digoxigenin)和洋地黄毒苷配基(digitoxgenin)没有显示出亚型选择性。在用纯化的亚型蛋白复合物测量的Na,K-ATP酶活性抑制的测定中，与α1相比，地高辛和洋地黄毒苷显示出对α2低3-4倍的Ki值，α3更类似于α1。同样，没有任何测试的强心苷的糖苷配基显示出亚型选择性。对于具有一至四个洋地黄毒糖(digitoxose)部分的地高辛衍生物，发现最大的α2/α1选择性为具有三个洋地黄毒糖的糖的地高辛本身。与洋地黄糖苷相比，乌本苷的KD显示出相对于α2有一些倾向于α1和针对所有三个亚型的Ki值类似。
基于这些研究，确定地高辛的糖部分可能决定亚型选择性，其通常与具有结合型乌本苷的Na,K-ATP酶的最新结构相一致(12-14)。乌本苷的不饱和内酯环和类固醇部分在α亚基的跨膜片段M1、M4、M5之间结合，其中亚型之间没有氨基酸差异。假定所有强心苷的糖苷配基类似地结合，其含意是在任何糖苷配基之间亚型不能区分，如实验所发现的。与此相反，糖在邻近胞外环处结合，在此处亚型之间存在一定数量的氨基酸差异。这些残基可能以亚型选择性方式与结合地高辛的糖相互作用。
对治疗与眼内压升高相关的眼部病状，诸如青光眼的新疗法，和对一方面是有效的，且另一方面证实可接受的安全性的新强心剂，存在未满足的需求。
发明概述
本发明涉及地高辛和洋地黄毒苷衍生物，相对于Na,K-ATP酶的其它亚型，其为该酶的α2亚型的选择性抑制剂。本发明的化合物有效地降低眼内压，并且可用于治疗与眼内压升高相关的病状，诸如青光眼，和/或作为强心剂。
先前已使用重组人α1β1、α2β1和α3β1亚型表明，经典抑制剂地高辛是部分α2-选择性的和三-洋地黄毒糖部分负责亚型选择性。本发明基于如下发现：相对于α1，第三洋地黄毒糖的修饰增加对α2的选择性。因此，地高辛的第三洋地黄毒糖已通过高碘酸盐氧化和使用多种R-NH2取代基还原胺化进行化学修饰，导致一系列地高辛的全氢-1,4-氧氮杂䓬(oxazepine)衍生物。如本文首次证实，相对于α1，几种衍生物显示出对α2高达约8倍的增加的选择性。此外，结合至Na,K-ATP酶的地高辛的分子模型表明，用不同的脂族取代的地高辛的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物可以对α2β3复合物具有相对选择性。事实上，相对于α1β1，一系列脂族衍生物显示出对α2β3改善的选择性-高达约16倍。局部施用的强心苷对兔子眼内压的效果已通过其预防或逆转由4-氨基吡啶或A3腺苷受体的选择性激动剂诱导的急性眼内压增加的能力进行评估。与地高辛本身、地高辛配基或乌本苷相比，所述α2-选择性地高辛/洋地黄毒苷衍生物更有效地预防或逆转高眼压症。因此，本发明的地高辛/洋地黄毒苷衍生物具有治疗与眼内压升高相关的病状，诸如青光眼的效用。如本文所证明的，最高(the most) α2β3-选择性衍生物是特别有效的。这些观察与α2β3在房水产生中的主要作用是一致的并建议，潜在地，α2-选择性且特别是α2β3-选择性地高辛衍生物可能感兴趣作为用于眼内压控制的新型药物。
此外，本发明的α2-选择性地高辛/洋地黄毒苷衍生物可显示出降低的毒性，尤其是当局部施用时。首先，角膜和晶状体的肿胀(swelling)应最小，因为仅α1和少量的α3但没有α2在角膜上皮表达且仅α1在晶状体上皮表达。其次，从眼睛到达全身循环的α2-选择性地高辛/洋地黄毒苷衍生物应仅有最低限度的心脏毒性。因此，本发明提供不仅有效的作为IOP降低剂，而且有潜力比母体化合物地高辛或洋地黄毒苷的毒性显著较低的化合物。
根据一个方面，本发明涉及由通式(I)的结构代表的化合物：
其中
R选自OH、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-(CRbRc)nSi(Ra)3、-(CRbRc)n-C(=Y)-NR1R2、-(CRbRc)n-C(=Y)-NHOH、-(CRdRe)n-C(=Y)-COOR3；和-NHC(=Y)NR1R2；
Y为O或S；
X为H或OH；
R1、R2和R3各自独立地为H或C1-C4烷基；
Ra为C1-C4烷基；
Rb、Rc和Rd各自独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4羟基烷基；
Re选自C1-C4烷基和C1-C4羟基烷基；且
n为0、1或2；
包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、几何异构体、旋光异构体、对映异构体、非对映异构体及其混合物。
在式(I)的一个实施方案中，R选自CZ3、-CZ2CZ3、-(CH2)2CH3、-CH(CH3)2、-(CH2)3CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3和-C(CH3)3，其中每个Z在每次出现时独立地为H或卤素。在一个特定实施方案中，每个Z为H或F。
在式I的另一个实施方案中，R选自-CH2-C(=O)-NH2、-CH3、-(CH2)2-C(=O)-NH2、-NHC(=O)-NH2、OH、-CH(CH3)CONH2、-CH(CH2OH)COOH、-CH(CH2OH)CONH2、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2C(CH3)2、-CH2CF3、-CH2CONHOH、-NHCSNH2、-CH2CH2F、-CH(CH2)3、-C(CH3)3和-CH2-Si(CH3)3。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在式(I)的一个实施方案中，R1、R2和R3各自为H。在式(I)的另一个实施方案中，n为1。在式(I)的另一个实施方案中，n为2。在式(I)的另一个实施方案中，Y为O。在式(I)的另一个实施方案中，Y为S。在式I的另一个实施方案中，C1-C4羟基烷基为CH2OH (即，化合物衍生自丝氨酸或丝氨酰胺)。
在一个目前优选的实施方案中，本发明的化合物为地高辛的衍生物，即，式I中X为OH。在一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH2-C(=O)-NH2 (本文中称为“DGlyN”或“化合物1”)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH3(本文中称为“DMe”或“化合物2”)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-(CH2)2-C(=O)-NH2 (本文中称为“DPrN”或“化合物3”)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-NHC(=O)-NH2 (本文中称为“DSCar”或“化合物4”)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X和R各自为OH (化合物6)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH(CH3)CONH2 (化合物8)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH(CH2OH)COOH (化合物9)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH(CH2OH)CONH2 (化合物10)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH2CH3 (化合物12)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-(CH2)2CH3 (化合物13)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH2CH(CH3)2 (化合物14)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH2CF3 (本文中称为“DMeCF3”或“化合物15”)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH2C(=O)-NHOH (化合物17)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-NHCSNH2 (化合物18)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH2CH2F (化合物19)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-CH(CH3)2 (化合物21)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为-C(CH3)3 (化合物22)。在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中X为OH且R为–CH2-Si(CH3)3 (化合物23)。
在另一个目前优选的实施方案中，本发明的化合物为洋地黄毒苷的衍生物，即，式I中X为H。
在一个实施方案中，相对于Na,K-ATP酶的其它亚型，本发明的化合物对Na,K-ATP酶的α2亚型具有选择性。在其它实施方案中，相对于Na,K-ATP酶的α1β1亚型，本发明的化合物对Na,K-ATP酶的α2β1、α2β2和/或α2β3亚型具有选择性，其中每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在其它实施方案中，本发明涉及包含式(I)的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一些优选的实施方案中，所述药物组合物是适合于以滴眼液、软膏、悬浮液、凝胶或乳膏的形式局部施用至眼的眼用组合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
优选地，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的选自稳定剂、防腐剂、螯合剂、粘度改性剂、缓冲剂和pH调节剂中的一种或多种的试剂。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
相对于Na,K-ATP酶的其它亚型，本发明的化合物优选对Na,K-ATP酶的α2亚型具有选择性，即，相对于该酶的其它亚型，例如，α1亚型，他们抑制α2亚型(特别是α2β3亚型)。因此，他们可用于降低高眼压症或治疗与高眼压症相关的疾病，诸如青光眼的方法中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过向需要此类治疗的个体给予有效量的根据本发明的式I的化合物或药物组合物用于降低高眼压症或用于治疗与高眼压症相关的病症诸如青光眼的方法。在其它实施方案中，可用于降低高眼压症或治疗与高眼压症相关的病症诸如青光眼的化合物为式IA的化合物：
其中
R选自OH、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-(CRbRc)nSi(Ra)3、-(CRbRc)n-C(=Y)-NR1R2、-(CRbRc)n-C(=Y)-NHOH、-(CRdRe)n-C(=Y)-COOR3；-NHC(=Y)NR1R2；和-(CRbRc)n-NH2；
Y为O或S；
X为H或OH；
R1、R2和R3各自独立地为H或C1-C4烷基；
Ra为C1-C4烷基；
Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4羟基烷基；且
n为0、1或2；
包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、几何异构体、旋光异构体、对映异构体、非对映异构体及其混合物。
在式(I)的一个实施方案中，R选自CZ3、-CZ2CZ3、-(CH2)2CH3、-CH(CH3)2、-(CH2)3CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3和-C(CH3)3，其中每个Z在每次出现时独立地为H或卤素。在一个特定实施方案中，每个Z为H或F。
在式(IA)的另一个实施方案中，R选自-CH2-C(=O)OH、-CH2-C(=O)-OCH3和CH2-CH2-NH2。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在式(IA)的一个实施方案中，R1和R2各自为H。在式(IA)的一个实施方案中，R3为H或CH3。在式(IA)的另一个实施方案中，n为1。在式(IA)的另一个实施方案中，n为2。在式(IA)的另一个实施方案中，Y为O。在式(IA)的另一个实施方案中，Y为S。在式(IA)的另一个实施方案中，C1-C4羟基烷基为CH2OH (即，化合物衍生自丝氨酸或丝氨酰胺)。
在一个目前优选的实施方案中，本发明的化合物为地高辛的衍生物，即，式IA中X为OH。在一个实施方案中，本发明涉及式IA的化合物，其中X为OH且R为-CH2-C(=O)OH(本文中称为“DGly”或“化合物5”)。在另一个实施方案中，本发明涉及式IA的化合物，其中X为OH且R为-CH2-C(=O)-OCH3 (本文中称为“DGlyMe”或化合物7)。在另一个实施方案中，本发明涉及式IA的化合物，其中X为OH且R为-CH2-CH2-NH2 (本文中称为“DEtDA或化合物11”)。
在另一个目前优选的实施方案中，本发明的化合物为洋地黄毒苷的衍生物，即，式IA中X为H。
式IA的化合物可在对式I的上述药物组合物中给予。在一些实施方案中，相对于Na,K-ATP酶的其它亚型，式IA所涵盖的化合物对Na,K-ATP酶的α2亚型具有选择性，即，相对于该酶的其它亚型，例如，α1亚型，他们抑制α2亚型。在其它实施方案中，相对于Na,K-ATP酶的α1β1亚型，式IA所涵盖的化合物对Na,K-ATP酶的α2β1、α2β2和/或α2β3亚型具有选择性，其中每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在其它实施方案中，本发明涉及式I或IA的化合物，或这种结构式(formulae)所涵盖的任何化合物，用于制备降低高眼压症或治疗与高眼压症相关的疾病或病状诸如青光眼的药物的用途。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
在其它实施方案中，本发明的化合物也可用作强心剂。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含式(I)的化合物或式(IA)的化合物的强心组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)或式(IA)的化合物作为强心剂的用途。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
本发明将连同下面的说明书、附图和权利要求书得到更好地理解。
附图简述
图1 高眼压症实验的技术特性。新西兰白兔用于IOP测量，兔子的IOP(mm Hg) 使用校准的Pneumatonometer(型号30，Reichert technologies)测量。
图2A-B 地高辛的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物的合成(图2A)，和DGlyN(本发明的代表性化合物)的反相HPLC纯化(图2B)。
图3A-B 地高辛衍生物对纯化的亚型复合物的Na,K-ATP酶活性的抑制。DGlyN (图3A) DMe (图3B)对Na,K-ATP酶活性的抑制的代表性实验。α1/β1亚型□；α2/β1亚型■；α3/β1亚型▼。曲线是单点抑制模型的拟合曲线(参见实施例4：实验部分)。
图4 4-氨基吡啶(4AP)-诱导的兔子短暂性高眼压症。对照■；4AP，1滴(40 mg/ml) □；4AP，2滴(40 mg/ml) ∆。
图5A-E DMe (图5A)、DGlyN (图5B)、地高辛(图5C)、乌本苷(图5D)和地高辛配基(图5E)对4AP-诱导的高眼压症的效果。在加入4AP(40mg/ml，1滴，25μl)前30min，将指定浓度的强心苷(CG’s) (1滴，25μl)加入到两只眼睛中。在此预温育期间IOP有很少或没有变化。加入4AP后在指定的时间测量IOP。在每个实验中每个浓度使用一只兔子。值为双眼IOP的平均值。
图6 不同CG’s的IOP变化的比较。该图描绘施用4AP和0.1mM CG 1.5小时后 IOP的变化(以mmHg计)。该图表示有SEM的3个不同实验的平均值。
图7A-C 地高辛衍生物对IOP的效果的时间过程。在该实验中，通过在强心苷不存在下或在施用一滴强心苷后每2小时施用4AP(图7A和图7B)，或者在首次施用4AP后一小时施用一滴强心苷(图7C)，使IOP升高7-8小时。所有其它条件和测量如图5中所述。
图8A-B DMe、DGlyN和地高辛配基对IB-MECA-诱导的高眼压症的效果，其中在IB-MECA之前30分钟加入指定浓度的DMe(图8A)，在首次加入IB-MECA后1.5小时加入1mM的地高辛配基、DGlyN或DMe(图8B)，在首次加入IB-MECA后1.5小时加入3mM的地高辛配基或DGlyN(图8C)，在零时和此后每2小时加入1µM IB-MECA(箭头)。
图9 地高辛配基、地高辛、DGlyN和DMe从α2亚型的解离。图9描绘来自如方法中所述获得的使用四种不同强心苷的代表性实验的标准化数据。
图10 结合至Na,K-ATP酶的地高辛的模型，其中该模型描绘具有结合地高辛(3B0W)的猪α1β1复合物(4HYT)(图10A)，临近结合地高辛的残基的细节(编号为猪α1和β1)(图10B)，和显示β1Gln84和β3Val89的β1与β3(分别为图10C和图10D)。
图11 显示α2β3和α2β2以及α2β1和α1β1亚型复合物在考马斯蓝染色的凝胶中的表达。在用PNGase处理之前将蛋白质变性。
图12 α1β1、α2β1、α2β2、α2β3亚型复合物的Na,K-ATP酶活性的K-激活。该图显示代表性曲线。
图13 地高辛对α1β1、α2β1、α2β2、α2β3的Na,K-ATP酶活性的抑制。该图显示代表性曲线。
图14 DIB对α1β1、α2β1、α2β2、α2β3的Na,K-ATP酶活性的抑制。该图显示代表性曲线。
图15 DIB对急性高眼压症的抑制。该图表示四个实验中不同浓度的DIB的平均效果。
发明详述
除非另有规定，“一(a)”或“一(an)”表示“一个或多个”。
本发明涉及地高辛和洋地黄毒苷衍生物，其为Na,K-ATP酶的α2亚型的选择性抑制剂。本发明的化合物有效地降低眼内压，并且可用于治疗与眼内压升高相关的病状，诸如青光眼，和/或可用作强心剂。
术语“Na,K-ATP酶的α2亚型的选择性抑制剂”表示所述化合物抑制Na,K-ATP酶的α2亚型的程度比其它亚型例如α1大。在一些实施方案中，相对于Na,K-ATP酶的α1β1亚型，本文所述的化合物对Na,K-ATP酶的α2β1、α2β2和/或α2β3亚型具有选择性。在一些实施方案中，相对于其它亚型，化合物对Na,K-ATP酶的α2亚型(例如，α2β1、α2β2和/或α2β3亚型)的选择性高达约20倍，例如，相对于该酶的其它亚型，对α2亚型的抑制大高达16倍、8倍、5倍或2倍。
化合物
根据一个方面，本发明涉及由通式(I)的结构代表的化合物：
其中
R选自OH、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-(CRbRc)nSi(Ra)3、-(CRbRc)n-C(=Y)-NR1R2、-(CRbRc)n-C(=Y)-NHOH、-(CRdRe)n-C(=Y)-COOR3；和-NHC(=Y)NR1R2；
Y为O或S；
X为H或OH；
R1、R2和R3各自独立地为H或C1-C4烷基；
Ra为C1-C4烷基；
Rb、Rc和Rd各自独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4羟基烷基；
Re选自C1-C4烷基和C1-C4羟基烷基；且
n为0、1或2；
包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、几何异构体、旋光异构体、对映异构体、非对映异构体及其混合物。
根据另一个方面，本发明涉及由通式(IA)的结构代表的化合物：
其中
R选自OH、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-(CRbRc)nSi(Ra)3、-(CRbRc)n-C(=Y)-NR1R2、-(CRbRc)n-C(=Y)-NHOH、-(CRdRe)n-C(=Y)-COOR3；-NHC(=Y)NR1R2；和-(CRbRc)n-NH2；
Y为O或S；
X为H或OH；
R1、R2和R3各自独立地为H或C1-C4烷基；
Ra为C1-C4烷基；
Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、C1-C4烷基和C1-C4羟基烷基；且
n为0、1或2；包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型物、几何异构体、旋光异构体、对映异构体、非对映异构体及其混合物。
在一些目前优选的实施方案中，所述化合物选自地高辛衍生物(X为OH)或洋地黄毒苷衍生物(X为H)。几种优选的式(I)或(IA)的化合物举例如下，其中每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
式(1)的化合物，其中X为OH且R衍生自甘氨酰胺(R = -CH2C(=O)-NH2)，本文中缩写为“DGlyN”。
式(2)的化合物，其中X为OH且R为CH3，本文中缩写为“DMe”。
式(3)的化合物，其中X为OH且R衍生自丙酰胺(R = -CH2CH2C(=O)-NH2)，本文中缩写为“DPrN”。
式(4)的化合物，其中X为OH且R衍生自氨基脲(R = -NHC(=O)-NH2)，本文中缩写为“DSCar”。
式(5)的化合物，其中X为OH且R衍生自甘氨酸(R = -CH2C(=O)OH)，本文中缩写为“DGly”。
式(6)的化合物，其中X和R各自为OH，本文中缩写为“DOH”。
式(7)的化合物，其中X为OH且R衍生自甘氨酸甲酯(R = -CH2-C(=O)-OCH3)，本文中缩写为“DGlyMe”。
式(8)的化合物，其中X为OH且R衍生自丙氨酰胺(alanineamide)(R = -CH(CH3)CONH2)，本文中缩写为“DAlaN”。
式(9)的化合物，其中X为OH且R衍生自丝氨酸(R = -CH(CH2OH)COOH)，本文中缩写为“DSer”。
式(10)的化合物，其中X为OH且R衍生自丝氨酰胺(R = -CH(CH2OH)CONH2)，本文中缩写为“DSerN”。
式(11)的化合物，其中X为OH且R衍生自乙二胺(R = -CH2-CH2-NH2)，本文中缩写为“DEtDA”。
式(12)的化合物，其中X为OH且R为-CH2CH3本文中缩写为“DEt”。
式(13)的化合物，其中X为OH且R为-(CH2)2CH3本文中缩写为“DPr”或“DP”。
式(14)的化合物，其中X为OH且R为-CH2CH(CH3)2本文中缩写为“DiBu”。
式(15)的化合物，其中X为OH且R衍生自2,2,2-三氟乙基(R = -CH2CF3)，本文中缩写为“DMeCF3”。
式(17)的化合物，其中X为OH且R为-CH2C(=O)-NHOH，本文中缩写为“DGlyNHOH”。
式(18)的化合物，其中X为OH且R衍生自氨基硫脲(semithiocarbazide)(R=-NHCSNH2)，本文中缩写为“DSSCar”。
式(19)的化合物，其中X为OH且R为-CH2CH2F，本文中缩写为“DCH2CH2F”。
式(21)的化合物，其中X为OH且R为-CH(CH3)2，本文中缩写为“DiPro”或“DIP”。
式(22)的化合物，其中X为OH且R为-C(CH3)3，本文中缩写为“DtBu”。
式(23)的化合物，其中X为OH且R为甲基(三甲基甲硅烷基) (-CH2-Si(CH3)3)，本文中缩写为“DTMS”。
这些和其它代表性化合物示于下文表1中。
术语“C1-C6烷基”基团是指任何饱和脂肪烃，包括含有1至6个碳原子的直链和支链基团。术语“C1-C4烷基”基团是指任何饱和脂肪烃，包括含有1至4个碳原子的直链和支链基团。烷基基团的非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、1-己基、2-己基和3-己基。该烷基基团可以是取代的或未取代的。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
本发明化合物的所有立体异构体、旋光和几何异构体均考虑在内，无论以混合物或纯的或基本纯的形式。本发明化合物可在一个或多个原子处具有不对称中心。因此，化合物可以对映异构体或非对映异构体形式或以其混合物形式存在。本发明考虑使用任何外消旋体(即含有等量的各对映异构体的混合物)、对映异构体富集的混合物(即，富含一种对映异构体的混合物)、纯的对映异构体或非对映异构体、或其任何混合物。手性中心可命名为R或S或R,S或d,D, l,L或d,l, D,L。包含氨基酸残基(例如，甘氨酸或甘氨酰胺)的化合物包括 D-氨基酸、L-氨基酸、或氨基酸的外消旋衍生物的残基。
本发明的一种或多种化合物可以盐存在。术语“盐”包括碱加成盐和酸加成盐，并包括与有机和无机的阴离子和阳离子形成的盐。术语“有机或无机阳离子”是指酸的抗衡离子。抗衡离子可选自碱金属和碱土金属，(诸如锂、钠、钾、钡、铝和钙)、铵等。此外，术语包括通过碱性基团与有机或无机酸的标准酸碱反应形成的盐。此类酸包括盐酸、氢氟酸、氢溴酸、三氟乙酸、硫酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、胆酸、扑酸、粘酸、D-樟脑酸、邻苯二甲酸、酒石酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸及类似酸。
本发明还包括本发明的化合物的溶剂合物及其盐。“溶剂合物”表示本发明的化合物与一种或多种溶剂分子的物理缔合。该物理缔合包括不同程度的离子和共价键合，包括氢键合。在某些情形下，所述溶剂合物将能够分离。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离的溶剂合物。合适的溶剂合物的非限制性实例包括乙醇盐、甲醇盐等。“水合物”为一种溶剂合物，其中溶剂分子为水。
本发明还包括本发明的化合物的多晶型物及其盐。术语“多晶型物”是指物质的特定晶态，其可由特定物理性质诸如X-射线衍射、IR光谱、熔点等来表征。
药物组合物和治疗用途
在一些实施方案中，本发明提供通过给予有效量的包含作为活性成分的式I和/或IA的化合物(例如，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、21、22或23)和药学上可接受的载体的药物组合物，用于治疗与眼内压升高相关的病状，并且特别是用于治疗青光眼的方法。
在其它实施方案中，本发明提供通过给予有效量的包含作为活性成分的式I和/或IA的化合物(例如，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、21、22或23)和药学上可接受的载体的药物组合物，用于降低升高的眼内压的方法。
优选地，本发明的药物组合物为局部给予至患者眼部以用于促使药物达到有效的眼内水平并防止其它器官中不必要的药物水平的眼用组合物。此类非全身性的、位点特异性的给药降低了与药物相关的副作用。然而，以有效降低眼内压的剂量口服或其它方式的全身性给药也是可能的。例如，所述组合物可通过皮肤贴片给药以延长释放。
当局部给药时，含有式I或IA的地高辛衍生物的药物组合物可以适于局部递送的各种治疗形式(包括溶液、悬浮液、乳液和凝胶)来配制。这些制剂中的载体可以是任何药学上可接受的载体诸如盐水、缓冲盐水、卡波姆凝胶(carbopol gel)、矿物油等。所述制剂可根据已知的制备眼用制剂的程序来制备。优选地，药物组合物中地高辛衍生物的浓度在约1至约5,000 µg/ml的范围内，优选约80至约800 μg/ml并且所述制剂优选以每天一至四个剂量施用，其中每个剂量含有约1至125 μg的地高辛衍生物，更优选约2至约20 μg的地高辛衍生物。
所述局部药物组合物可以滴眼液的形式通过滴入眼中施用或可以粘性软膏、凝胶或乳膏的形式通过涂抹(ointment)在眼部表面上施用并可含有控释装置以在较长时间内促进缓释。
所述组合物可进一步包括无毒的辅助性的药学上可接受的物质诸如稳定剂、防腐剂、螯合剂、粘度改性剂、缓冲剂和/或pH调节剂。此外，所述组合物可含有其它眼用活性剂诸如抗菌剂、舒适增强剂、抗氧化剂、降低眼内压 (IOP)的药物等。
根据其它实施方案，地高辛/洋地黄毒苷衍生物可以装入药物递送装置中以嵌入或植入患者眼中以使药物以受控且持续的速率通过溶解、扩散或浸出而释放，从而在较长时间内维持有效治疗浓度。药物递送装置可以是例如装有活性剂、嵌入例如下眼睑之下的生物相容性薄膜。
α2-选择性强心苷的另一种可能的应用为作为有效的强心药物，与已知的药物诸如地高辛相比，其具有降低的心脏毒性。因此，在其它实施方案中，本发明提供包含作为活性成分的式I和/或IA的化合物(例如，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、21、22或23)和药学上可接受的载体的强心组合物。根据该实施方案，根据本发明的化合物可因此配制用于口服、颊(buccal)、局部、肠胃外或直肠给药。
对于口服给药，所述组合物可例如以使用可接受的稀释剂通过常规方法制备的片剂、胶囊剂、粉剂、溶液、糖浆或悬浮液的形式提供。对于颊给药，所述组合物可以常规配制的片剂或小药囊的形式提供。
根据本发明的化合物可经配制用于通过推注或连续输注进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以含有单剂量的安瓿的形式提供或者他们可在多剂量容器中与加入的防腐剂一起提供。所述组合物可以是悬浮液、溶液等的形式。
或者，所述活性成分可以粉末形式提供以在使用前用适当的载体重构。对于局部使用，根据本发明的化合物可以常规方式作为软膏、乳膏、凝胶、洗剂、粉剂或喷雾剂来配制。
本发明的原理(使用结合至生物活性部分诸如显像剂或治疗剂的白蛋白缀合物异黄酮衍生物以选择性递送至对根据本发明的异黄酮敏感的细胞)可参照以下非限制性实施例更好地理解。
实施例
实施例1：地高辛的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物的合成和测试
全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物根据(15)中描述的方法制备。图2A显示合成路线，包括(a)第三洋地黄毒糖部分的选择性高碘酸盐氧化和(b)对于甘氨酰胺的情况，使用游离胺(R-NH2)加上NaCNBH3的二醛的还原胺化。化合物通过HPLC纯化，如图2B中的DGlyN衍生物的代表性实例所见。反应的两个阶段的进度以及化合物的纯化通过薄层色谱和质谱测量常规监测。获得几种衍生物的1H和13C NMR光谱和全部分配(assignments)并将另行公布。本发明的代表性化合物的结构示于表1中。为了验证结构，然后测定纯化的化合物的质量。该表显示十五种地高辛衍生物以及双-洋地黄毒糖地高辛配基的甘氨酸衍生物的不同胺取代基的结构、名称和理论和实测质量。在具有电喷雾电离的Micromass ZQ 4000光谱仪中获得质谱。
表1 地高辛的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物的结构、名称和质量
R = 衍生物 化学名称 名称缩写 理论精确质量 实测质量(M + Na+) -CH2CONH2 (1) 甘氨酰胺 DGlyN 820.47 843.42 -CH3 (2) 甲胺 DMe 777.47 800.57 -CH2CH2CONH2 (3) 丙酰胺 DPrN 834.49 857.30 -NHCONH2 (4) 氨基脲 DSCar 821.47 844.37 -CH2COOH (5) 甘氨酸 DGly 821.46 844.44 -OH (6) 羟胺 DOH 779.45 802.47 -CH2COOCH3 (7) 甘氨酸甲酯 DGlMe 835.47 858.51 -CH(CH3)CONH2 (8) 丙氨酰胺 DAlaN 834.49 857.56 -CH(CH2OH)COOH (9) 丝氨酸 DSer 851.47 874.61 -CH(CH2OH)CONH2 (10) 丝氨酰胺 DSerN 850.48 873.59 -CH2CH2NH2 (11) 乙二胺 DEtDA 806.49 829.48 -CH2CH3 (12) 乙胺 DEt 791.48 814.52 -CH2CH2CH3 (13) 丙胺 DPr 805.50 828.27 -CH2C(CH3)2 (14) 异丁胺 DiBu 819.51 842.41 -CH2CF3 (15) 2,2,2-三氟乙胺 DMeCF3 845.45 868.14 bis-CH2COOH (16) 双-甘氨酸* DbisGly 691.39 714.40 -CH2CONHOH (17) 甘氨酸氧肟酸盐 DGlyNHOH 836.47 858.51 -NHCSNH2 (18) 氨基硫脲 DSSCar 821.47 844.37 -CH2CH2F(19) 2-氟乙胺 DCH2CH2F 809.47 832.46 -CH(CH2)3 (21) 异丙胺 DiPro 805.50 828.53 -C(CH3)3 (22) 叔丁胺 DtBu 819.51 842.66 -CH2Si(CH3)3(23) (三甲基甲硅烷基)甲胺 DTMS 849.51 872.50
*双-甘氨酸是指双-洋地黄毒糖地高辛配基的甘氨酸衍生物。
实施例2：Na,K-ATP酶活性的抑制
图3A-B显示与地高辛本身相比对α2具有改进的选择性的两种衍生物DGlyN(图3A)和DMe(图3B)的纯化的人亚型(α1β1、α2β1和α3β1)的Na,K-ATP酶活性的抑制曲线。表2提供根据本发明的16种地高辛全氢-1-4-氧氮杂䓬衍生物的抑制作用的信息。表2中的数据显示，几种衍生物的亚型选择性比率(Kiα1/α2)：DGlyN(7.45±0.46)、DME(6.47±0.71)、DGly(5.1±0.54)、DPrN(5.28±0.75)和DSCar(4.98±1.2)明显高于地高辛的亚型选择性比率(3.44±0.34)。对于这些化合物，对α1和α2二者的Ki值低于地高辛，但与α1相比对α2的作用更大。因此，与地高辛相比，本发明的化合物的Ki α1/α2比率更高。在所有情况下，与α2相比，对α3的Ki更接近对α1的Ki。这一特点在图3A-B所示的DMe和DGlyN中清楚地见到，并且也适用于式(I)所包括的其它化合物。因此，Kiα1/α2主要受第三洋地黄毒糖的改变影响。表2中的几种衍生物(例如DEt)的Ki值明显低于地高辛本身，但亚型之间的差异作用没有观察到，所以选择性比率没有改善。表2中的几种其它衍生物(例如DEtDA)的Ki值明显低于地高辛本身且观察到一些差异作用。在其它情况下(例如DOH和DSer)，Ki值高于地高辛且对α2的选择性没有改善。表2中的结果为与三-洋地黄毒糖的甘氨酸衍生物(DGly)相比，双-洋地黄毒糖地高辛配基的甘氨酸衍生物(DbisGly)显示对α2的选择性较低，相对于α1，这显示第三洋地黄毒糖残基的改变最适合于这种作用，与(6)中类似的结论一致。总之，改变第三洋地黄毒糖部分的策略产生具有改善的Kiα1/α2比率的化合物，在最高α2-选择性衍生物，DGlyN和DMe的情况下达到地高辛值的两倍以上。
表2：具有选择性比率的亚型α1β1和α2β1的Na,K-ATP酶活性抑制的Ki值
* Dbis为地高辛配基双洋地黄毒糖苷(digitoxide)。
CG缩写对应于以下起始胺：DOH-羟胺；DGly-甘氨酸；DGlMe-甘氨酸甲酯；DGlyN-甘氨酰胺；DAlaN-丙氨酰胺；Dser-丝氨酸；DserN-丝氨酰胺；DSCar-氨基脲；DPrN-丙酰胺；DEtDA-乙二胺；DMe-甲胺；DEt-乙胺；DMeCF3-2,2,2三氟乙胺；DbisGly-双-洋地黄毒糖苷甘氨酸(bis-digitoxoside glycine)。p值通过t检验计算并表示为*p<0.05、**P<0.01、***p<0.001。n，独立实验次数。p(α2vα1)表示Kiα2β1和Kiα1β1之间的差异显著性。p(v地高辛)表示与地高辛的(Kiα1β1 /Kiα2β1)相比，选择性比率(Kiα1β1 /Kiα2β1)的差异显著性。
实施例3：通过局部施用的地高辛和全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物降低眼内压。
用局部麻醉剂麻醉角膜后，使用“Reichert Model 30™ Pneumatonometer”测定兔子的眼内压。使用两种不同的药理学试剂诱导IPO的急性升高并测定本发明的局部施用的糖苷是否能够抵制这一效果。首先，IOP升高用4-氨基吡啶(4AP)急性诱导，先前已报道其使兔眼的IOP从22-24mmHg的静止IOP急性和短暂升高4-8 mm Hg (16)。由4AP(其是公知的电压依赖性K通道的阻滞剂)诱导的高眼压症的机制显示涉及从虹膜-睫状体的交感神经释放去甲肾上腺素，导致房水流入速率增加。图4证实4AP的基本作用。在每只眼睛中，一或两滴4AP使IOP升高 3-6mm Hg，且作用在5小时后消退。
由于IOP反映房水流入和流出的平衡，因此通过强心苷减少4AP诱导的房水流入增加应防止IOP增加。因此，测试强心苷效果的标准实验设计涉及在施用4AP前30分钟局部施用化合物(每只眼睛1滴)并且每30分钟测量IOP达五小时。图5A-E显示使用这一方案的DMe (图5A)、DGlyN (图5B)、地高辛(图5C)、乌本苷(图5D)和地高辛配基(图5E)对IOP的效果。每个实验进行三次，但附图描绘对每个浓度的强心苷使用不同兔子的代表性实验。绘制的值表示两只眼睛的平均压力，虽然分别测量的每只眼睛的值类似。高浓度(1 mM)的地高辛(图5C)能够防止4AP诱导的IOP上升，而0.25mM地高辛效果较差。通过比较，DMe和DGlyN(分别为图5A和图5B)，最高α2选择性的新的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物，在比地高辛低得多的浓度(0.05-0.1 mM)下是有效的。类似地，地高辛的糖苷配基地高辛配基在比地高辛低的浓度下有效地降低IOP(图5E)。最后，乌本苷，一种广泛使用的水溶性强心苷，仅在1mM下一定程度降低IOP而更低的浓度则效果不佳(图5D)。
图6比较DGlyN、DMe、地高辛配基、地高辛和乌本苷对IOP的相对效果，其均在0.1mM下和一个时间点。数据代表三个独立的实验(即总共6只眼)的平均效果±SEM，且证实顺序为DGlyN≈DMe≈地高辛配基>地高辛>乌本苷。
随着时间的推移，单独施用后穿透到睫状体上皮的强心苷将被洗出眼睛进入全身循环，并因此对IOP的作用将消散。尽管图5和6表明，强心苷降低IOP的功效更大或更小，但由于4AP效果本身的短暂性质，通过该实验方案无法评估效果的长久性。因此，进行另外的实验，其中当然后每两个小时加入4AP以维持IOP在升高的水平7-8小时时，甚至在不存在强心苷的情况下，比较单滴地高辛、地高辛配基、DGlyN、DMe或乌本苷的效果(图7)。通过该方案，在图7中IOP的降低的确被视为是短暂的。图7A显示DMe的代表性实验，表明洗出时间对浓度的明显依赖。在IOP升回4AP导致的升高水平之前，对于2mM、0.5mM和0.2mM，IOP分别保持低水平5.8、4.5和2.5小时。其它实验显示，在相同浓度下，DGlyN的洗出时间比DMe稍快。当DMe、DGlyN、地高辛配基、地高辛和乌本苷以相同浓度(1mM)施用时，在它们之间检测到洗出时间的显著差异。如在图7B中所见，DMe维持IOP在低水平约5.5小时，相比之下，DGlyN为3.5小时，地高辛配基为约2小时和地高辛仅为1小时。乌本苷以地高辛和地高辛配基之间的速率洗出。为清楚起见数据没有显示。总之，与地高辛(较低α2-选择性强心苷(CG))或非选择性CG地高辛配基相比，最高α2-选择性衍生物DMe(化合物2)和DGlyN(化合物1)产生最长作用效果以降低IOP。
图7C显示DGlyN和DMe快速逆转预先建立的高眼压症。在首次施用4AP后一小时，施用DGlyN或DMe(0.1或1mM)，4AP每两小时进行添加。显然，在30分钟内DGlyN和DMe逆转IOP的初始上升，表明所述化合物透过角膜并足够快地与泵结合以具有这一作用。然后将标准化的IOP维持至少4小时，如图7B中。与地高辛本身相比，不依赖于低浓度的α2-选择性衍生物的优异效果，DGlyN和DMe作用的迅速起始暗示α2的抑制，因为已知α2结合强心苷比α1更迅速(17)。
为验证地高辛衍生物直接抑制房水流入而非通过例如干扰4AP本身间接起作用，使用局部IB-MECA。IB-MECA通过一种不同的和明确的机制诱导急性高眼压症。即，IB-MECA是A3-腺苷受体的选择性激动剂，并通过激活NPE细胞的Cl通道使房水流入和IOP升高(18,19)。单滴IB-MECA(1μM)诱导IOP显著但短暂的增加，而每2小时重复施用维持增加的IOP达4-5小时(参见图8A对照)。图8A描绘在IB-MECA之前施用DMe (0.1-1mM)的效果，并且DGlyN获得类似的结果(未示出)。图8B描绘IB-MECA之后施用地高辛配基、DGlyN和DMe (1mM)的效果。1mM的地高辛配基、DGlyN和DMe的效果几乎与如在图7C中用4AP所见的相同，明显排除CG’s干扰4AP本身的作用的观念。此外，DMe和DGlyN的效果持续时间明显大于地高辛配基。另外，当DGlyN和地高辛配基的浓度升至3 mM时，与1mM的实验相比，效果持续时间的差异极大地放大。
也在4AP后施用地高辛(1mM)、DGlyN (0.5mM)、DMe (0.5mM)和乌本苷 (1mM)之后测量角膜厚度。至少经4小时的时间尺度，以微米测量的角膜厚度无显著影响。因此，在该研究中，未检测到角膜厚度的变化(表3)，表示缺乏局部毒性作用。此外，未在结膜或角膜观察到红肿或局部刺激。IB-MECA之后施用CG’s获得类似的结果。
表3：厚度测量法-施用强心苷之前和之后的角膜厚度
RE，右眼，LE，左眼。角膜厚度以微米给出。每个值代表三次独立测量的平均值。
实施例4：强心苷从α2β1的解离
由于NPE细胞中的主要亚型为α2且预计从泵的解离对IOP效果的持续时间有影响，因此对不同强心苷从纯化的α2β1亚型的离解率进行比较。使用(20)中所述的方案比较地高辛、地高辛配基、DGlyN和DMe的离解率。图9描绘了四种化合物中的每种的代表性实验且表4显示三个或四个实验的平均速率常数和半衰期。显然，糖苷配基地高辛配基比地高辛或任何其它糖基解离快得多，且DMe和DGlyN也比地高辛本身明显解离地慢。DMe和DGlyN的缓慢解离表明其对IOP持久作用的潜力。
表4：强心苷从α2β1亚型复合物的离解率。
实施例5：具有对α2β3复合物增强选择性的地高辛衍生物
因为α2β3而不是α2β1是NPE细胞中的主要亚型复合物，所以进一步研究β1、β2或β3亚型是否是重要因素。
地高辛结合Na,K-ATP酶的分子建模
图10A中示出了第三洋地黄毒糖残基和亚型选择性的相互作用的分子观察。该图显示分子模型，其中将地高辛分子(坐标3B0W)引入到高亲和力乌本苷结合分子(4HYT) (14)上，使得乌本苷和地高辛的内酯和类固醇部分紧密重叠，然后获得最小能量结构。三个洋地黄毒糖残基向外指向α和β亚基。图10B中放大的图像显示临近(<3.5A) α的L7/8中的残基AspAspArgTrp887的洋地黄毒糖部分，第三洋地黄毒糖既接近αTrp887，也接近βGln84。朝向β亚基这一方向的支持来自旧观察：位于洋地黄毒苷的第三洋地黄毒糖的光亲和性探针标记α和β亚基，而位于强心苷分子的其它区域的光亲和性探针仅标记α亚基(21,22)。如模型所表明的，αTrp887是胞外环中仅有的四个残基之一，其在α2(和α3)中与α1不同，(在猪α1中为Gln119、Glu307、Val 881和Trp887)，且先前推断为用于确定亚型选择性的候选物(23)。紧邻这四个残基之一与第三洋地黄毒糖的相互作用对于亚型选择性重要的主张，和第三洋地黄毒糖的衍生物可以提高亚型选择性的目前发现非常吻合。在α2中，Trp887被苏氨酸替换。
此外，β1中的Gln84被β3中的Val89和β2中的Glu替换(图10C和D)。由于α2β3是NPE细胞中的主要亚型复合物，似乎通过将比已经尝试的Me和Et更大的脂族基团引入全氢-1,4-氧氮杂䓬地高辛衍生物，有可能产生与所有其它细胞中的主要亚型复合物α1β1相比，对α2β3的选择性增强的地高辛衍生物。更疏水的衍生物的另一可能的优点是，预计它们更能穿透角膜，并因此，潜在地，以比DMe或DGlyN更低的浓度有效地降低IOP。
人α2β3和α2β2亚型复合物的表达、纯化和表征。
为开发对人α2β3具有更高选择性的化合物，α2β3和α2β2人亚型复合物按如下方法所述进行表达。图11显示纯化的亚型复合物α2β1、α2β2、α2β3和α1β1在用PNGase(在变性状态下)处理之前或之后的蛋白凝胶。β1具有3个糖基化位点，β3具有2个糖基化位点，而β2具有7个糖基化位点。在凝胶上的流动顺序，β3>β2>β1，与β1，37172.6>β2，35422.2 >β3，33678.9的去糖基化亚基的预测质量非常吻合。纯化复合物的平均Na,K-ATP酶活性为α1β1，19.3±2；α2β1，18.2±1.6；α2β2，7.7±1.8和α2β3 9.7±0.26 μmoles/min/mg蛋白(n=4)。因为强心苷和K离子是相互对立的，与强心苷结合相关的重要的点是用于Na,K-ATP酶的活化的K0.5 K。如本文所用的术语“K0.5 K”意指Na,K-ATP酶活性的活化所需的钾离子(K)的半数最大浓度。图12和表5显示K的表观亲和力在亚型复合物之间显著不同，顺序为α1β1<α2β1<α2β2<α2β3。地高辛的抑制对具有较高K0.5 K的亚型更有效(Ki α1β1>α2β1>α2β2>α2β3)，因此导致对α2β3的选择性较高，相对于α1β1(图13)。该增加的选择性通过较低程度的K-地高辛拮抗作用来解释且预计对所有的强心苷与对地高辛的程度相同。
表5：α1β1、α2β1、α2β2和α2β3亚型复合物的Na,K-ATP酶活性活化的K0.5 K
。
地高辛的脂族衍生物的合成和亚型选择性。
已合成和纯化了另一组具有脂族取代基丙基(DP)、异丙基(DIP)、异丁基(DIB)、叔丁基(DtB)和三氟乙基(DMeCF3)的全氢-1,4-氧氮杂䓬地高辛衍生物。表6显示与地高辛本身和DMe相比，最近的脂族衍生物对四种Na,K-ATP酶亚型复合物的抑制和选择性的结果，图14描绘了最高选择性的异丁基衍生物，DIB的效果。当与DMe相比时，在α1β1与α2β1中未观察到显著差异。然而，对于α2β3，包括DMe在内的所有脂族衍生物显著优于地高辛且在异丁基衍生物的情况下选择性比率达16倍。通常，α2β2的曲线位于α2β3和α2β1的曲线之间。如上述提到的，α2β1-3复合物之间K0.5K的差异应转化为Ki的差异，如对地高辛所见的，在某种意义上Ki α2β1>α2β2≥α2β3。然而，对α2β3:α1β1的选择性增加比地高辛对所有这些新衍生物所见的明显更高(6.5倍)，且特别是对于异丁基衍生物，DIB(16倍)。这一发现可能意味着，所有脂族衍生物，但尤其是DIB，与α2β3的相互作用比α2β1更特定。在任何情况下DIB对α2β3抑制的5.8nM的Ki比任何其它的脂族(或其它)衍生物所见的更低。
α2β3抑制的低Ki意味着DIB可能是兔子中IOP的良好抑制剂。这在图15所总结的实验中测试。事实上，在4AP之前局部施用DIB有效地防止IOP上升。完全防止IOP上升所需的浓度(>30μM)比先前测试的最有效衍生物(DMe)所需的低约2倍。
表6. 脂族地高辛全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物对α2β3亚型复合物的选择性
。
总之，目前已证明地高辛的第三洋地黄毒糖残基的修改可产生对α2比对α1的选择性增加的衍生物。与地高辛相比(Kiα1/α2 3.44倍)，选择性比率显著增加，顺序为DGlyN>DMe>DGly≈DPrN≈DSCar，对DGlyN达到Kiα1/α2=7.45的最大值(表2)。
此外，选择性比率，Kiα2β3/α1β1，地高辛本身为6.5，对所有更多脂族衍生物DP、DIP、DIB、DtB和DMeCF3明显增强，对DIB达到c.16倍。
考虑到全氢-1-4-氧氮杂䓬环中的取代基的结构(表1、2和6)，似乎增加的α2:α1选择性(尤其是α2/β3)用具有H键潜力的小R基团(例如，甘氨酸、甘氨酰胺、丙酰胺、氨基脲、氨基硫脲)，或小疏水基团(例如，Me、Et、Pr、iPr和tBu)来实现，而较大的取代基(丙氨酸、丙氨酰胺、丝氨酸、丝氨酰胺)改善选择性程度较低，尽管这些化合物在治疗上也可以是有用的。亚型选择性的重要特征是(a)α2-选择性可能受限于具有β-洋地黄毒糖残基的洋地黄糖苷，由于例如乌本苷(一种α-鼠李糖苷)对α1比α2略有选择性和(b)如上述以及(6)中所总结的，第三洋地黄毒糖残基是最佳的。
尽管肾Na,K-ATP酶的乌本苷结合构象的结构(12-14)通常与观察到的糖苷配基的亚型选择性缺乏一致，因为乌本苷本身对α1比α2仅略有选择性(表2)，但这些结构既不能详细解释地高辛对α2的中度选择性，也不能解释全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物对α2的增强的选择性。不希望受任何特定机制或理论的束缚，假设本发明的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物(例如，DGlyN)对α2比对α1的选择性相对高，表明与α2和α1的外环中的亚型特异性残基的差异相互作用。糖苷配基和糖基之间的解离速率的非常大的差异强调结合至α2的糖的作用。与DGlyN和DMe部分的改变的洋地黄毒糖衍生物的α2的特异性相互作用也直接通过与地高辛相比较慢的解离速率表明(图9和表4)。类似地，表6中更多脂族衍生物诸如DIB对α2β3复合物比对α1β1的增强的选择性可能表明与βVal89的更特异性的相互作用。目前的发现证实和验证这一观念，第三洋地黄毒糖残基的修饰可增加对α2亚型的选择性。
总之，本文所述的α2-选择性地高辛衍生物降低眼内压，并且因此具有作为控制IOP和预防青光眼的新型药物的潜力。当通过剂量和尤其是效果的持续时间评价时，最高α2-选择性化合物DMe和DGlyN比中度α2-选择性地高辛或非选择性地高辛配基明显更有效。此外，当考虑到α2β3的选择性与化合物例如DIB时，观察到优异的效力。一个重要的结论是，α2β3确实起产生房水的主要作用，如可以从NPE细胞中其突出表达所预测的。
本文所述的新的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物也可具有良好的安全性，使得它们适于作为药物候选物。α2β3-选择性强心苷的局部毒性，即角膜和晶状体的肿胀应最小，因为角膜内皮表达α1和少量的α3但无α2，且晶状体上皮仅表达α1。另外，全身性心脏毒性效应应最小。
最后，更疏水的洋地黄毒苷的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物在降低高眼压症上，和/或作为强心剂可能甚至比地高辛衍生物更有效。
实施例5 –对大鼠眼内压的效果
为了评价本发明的化合物在慢性高眼压症的动物模型中是否能够控制IOP，和为了评估其局部和全身毒性，例如通过使用微珠阻止房水外流在大鼠中诱导高眼压症(24)。每日加入地高辛衍生物且随后出现IOP变化、炎症、角膜水肿或晶状体透明的迹象。对于全身毒性，通过放射免疫测定法测定血液中的地高辛衍生物的浓度。
实施例6：实验部分
材料
大肠杆菌XL-1蓝色株用于质粒构建的繁殖和制备。来自ICN Biomedicals Inc的酵母裂解酶(目录152270)用于毕赤酵母蛋白酶缺陷菌株SMD1165(his4，prb1)的转化。DDM(目录D310)和C12E8(25% w/w，目录号O330)购自Anatrace。合成的SOPS(钠盐)获自Avanti Polar Lipids，并作为氯仿溶液储存。BD Talon金属亲合树脂(目录635503)获自Clontech。胆固醇、乌本苷(O3125)、地高辛(D6003)、4-氨基吡啶(A78403)和IB-MECA(I146)获自Sigma。甲醇HPLC梯度购自Baker。所有有机溶剂和胺类均为最高纯度分析级。
hα1hβ1、hα1hβ2、hα1hβ3、hα2hβ1、hα2hβ2、hα2hβ3、hα3hβ1构建的制备
将人β1、β2和β3克隆到含有人α1或α2的pHIL-D2表达载体中。预先生成含有猪(p) α1、人(h) α1或人α2(其带有Hisx10标记的猪β1)的pHIL-D2表达载体(7,9)。pSD5载体中的人β1(登记：P05026)、人β2(登记：P14415)和人β3(登记：P54709) cDNA是来自K. Geering Univ. Lausanne Switzerland的礼物。使用含有BglII和SalI切割位点的合成引物通过聚合酶链反应(PCR)分别扩增hβ1、hβ2和hβ3(pSD5中)的开放阅读框和侧翼区。每一个扩增片段用BglII和SalI消化，并连接到BglII和SalI处理的质粒pHIL-D2-(pα1/His10pβ1)上以生成pHIL-D2 (pα1/His10hβ1或2或3)。将含有hβ1、hβ2和hβ3的片段从pHIL-D2-(pα1/His10hβ1或2或3)切除并亚克隆到pHIL-D2-(hα1/His10pβ1)或pHIL-D2-(hα2/His10pβ1)中以产生pHIL-D2-(hα1/His10hβ1或2或3)和pHIL-D2-(hα2/His10hβ1或2或3)。通过限制性酶消化和测序分析新建质粒的正确整合和正确的插入序列。在大肠杆菌XL-1蓝(E.coli XL-1 Blue)中大量制备每个构造的DNA用于毕赤酵母转化。
酵母转化。人Na,K-ATP酶亚型的表达和纯化
转化、毕赤酵母克隆培养、Na,K-ATP酶人亚型(α1β1、α2β1、α3β1)的蛋白表达、膜制备、DDM中膜的溶解以及在BD-Talon珠上纯化的方法已进行了详细描述(6-9,11,25)。在最初的实验中，将三种纯化的亚型复合物(0.3-0.5 mg/ml)从含有咪唑170mM、NaCl 100mM；Tricine.HCl 20 mM pH 7.4；C12E8，0.1 mg/ml；SOPS 0.07 mg/ml胆固醇0.01 mg/ml，甘油25%的溶液中的BD-Talon珠中洗脱。在以后的实验中，在α1β1FXYD1、α2β1FXYD1和α3β1FXYD1复合物洗脱之前，将亚型复合物用纯化的FXYD1在BD-Talon珠上重构在一起，如(10,11)中详细所述。将蛋白质在-80℃下贮存。蛋白质浓度用BCA(B9643 Sigma)测定。
纯化的亚型复合物的Na,K-ATP酶活性的试验
CG’s对洗涤剂可溶(detergent–soluble)的α1β1、α2β1和α3β1复合物的Na,K-ATP酶活性的抑制使用αβ或αβFXYD1复合物如(6)所述进行测定。FXYD1的存在或不存在不影响强心苷对Na,K-ATP酶活性的抑制(6)，但强烈稳定复合物(9-11)。K0.5K通过含有固定的60mM的总K+氯化胆碱和恒定的140mM的NaCl的培养基中变化的K浓度进行评估。将曲线拟合成Hill函数v=Vmax*[S]n/([S]n +Kn)，其中S为K浓度，n为Hill系数且Kn为K0.5K。为了比较不同的曲线，计算和重新绘制每个曲线的v/Vmax比率。在评估本发明的强心苷对Na,K-ATP酶活性的抑制的实验中，计算抑制百分数VCG/V0，并通过将数据拟合至函数VCG/V0 = Ki /([CG] + Ki)+ c获得Ki值。在3-8个独立实验中评估抑制并计算平均Ki值±SEM。通过未配对的学生t检验(p值)计算Kiα1和Kiα2之间的差异显著性。计算每种化合物的Kiα1/α2±SEM的比率，并通过与地高辛比较计算p值。P值<0.05被认为是显著的。
强心苷的解离速率 将纯化的α2β1FXYD1复合物(0.3-0.5mg/ml)在含有ATP，1mM；NaCl 100mM；MgCl2，4mM 组氨酸.HCl 25mM pH 7.4无(对照)或有1μM的不同强心苷的培养基中在37℃下温育30分钟。然后将酶溶液稀释100倍至含有100mM NaCl、5mM KCl、1mM EDTA(Tris)、0.005 mg/ml C12E8、0.01 mg/ml SOPS和0.001 mg/ml胆固醇的培养基中并在37℃下温育不同的时间长度。在不同的时间取出等分试样并经0.5分钟(地高辛配基)或2分钟(其它强心苷)在含有200μM ATP的标准活性培养基中一式三份测定Na,K-ATP酶活性。将测试样品的活性除以对照样品的活性并通过将数据拟合至函数vt=v∞e-kt+c分析抑制逆转的时间过程。通过从每个活性值中减去恒定值c并重新拟合比率vt/v∞= 1-e-kt获得不同实验比较的标准曲线(例如如图9)。
地高辛的全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物的合成
不同的地高辛全氢-1,4-氧氮杂卓衍生物的合成以两个步骤进行：1)用高碘酸钠氧化地高辛以得到第三糖部分中开环的二醛和2)在NaCNBH3存在下用伯胺还原胺化，闭合7元环以得到地高辛全氢-1,4-氧氮杂䓬衍生物。作为实例，下面提供DGlyN的合成。对本领域技术人员显而易见的是，本发明的其它化合物可通过相同或类似的方法来制备。
用NaIO4氧化地高辛(26)
在50ml聚丙烯试管中，在室温搅拌下将NaIO4(400 mg，1840 μmol)在H2O(4 ml)中的溶液加入到地高辛(400 mg，512 μmol)在95% EtOH(36 ml，未完全溶解)中的悬浮液中，并将立即溶解的混合物在室温下静置1 hr。在这段时间内形成沉淀物。通过以3,000x g离心15 min并通过注射过滤器(PTFE，0.2 um，25 mm)过滤去除沉淀的NaIO3。在蒸发器中浓缩溶液并用40 ml CHCl3萃取。用2x 8 ml水洗涤有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在蒸发器中蒸发，并高真空过夜以得到二醛，将其溶于48ml无水甲醇中以得到10 mM二醛溶液。
用甘氨酰胺盐酸盐还原胺化
将甘氨酰胺盐酸盐(28.2 mg，256 μmoles，MW = 110.54，Aldrich)加入到地高辛二醛(180 mg = 240 μmoles)溶液中以分别得到12mM和10mM的浓度。用浓乙酸甲醇溶液将表观pH校正至5-6，并将混合物在室温下保持5 min。在搅拌下用NaCNBH3(59.6 mg，480 μmoles，MW = 123.95，20mM)还原形成的Schiff碱。反应进程通过TLC(含丙酮/CHCl3(3：2)的SiO2)监测。将混合物静置1.5 h，DGlyN的产生和地高辛二醛的消失通过质谱法证实，并通过旋转蒸发和高真空过夜蒸发甲醇。由于可能发生副反应，诸如酸或碱诱导的二醛水解成双- 洋地黄毒糖苷，因此对最终产物进行纯化。将DGlyN反应混合物溶于最小量(5.4 ml)的50%甲醇中，通过注射过滤器0.2 μm，PTFE过滤，并用于HPLC纯化(图2B)。HPLC纯化在Purospher STAR RP-18e半制备柱上，用梯度的50-80%甲醇水溶液以4 ml/min的流速以15柱体积洗脱来进行。在施加到半制备柱之前，使用在分析性HPLC运行(Chromolith RP-18e)中建立的甲醇最佳梯度纯化其它衍生物。甲醇为JT Baker HPLC梯度级。
通过类似的方法制备其它化合物。它们的质谱数据呈现于表1中。
洋地黄毒苷衍生物可通过如本文所述的类似方法，使用洋地黄毒苷构架(X = H)代替地高辛构架(X = OH)来制备。
兔子眼内压的测量
动物
将任何性别的约1岁新西兰白兔(3-3.5 kg)以颠倒的、12小时黑暗/光照循环在动物房条件下在分开的笼子里单独饲养。为了实验，将动物在安静和平静的气氛下转移到兔限位器(图1)。在实验之前或期间未检测到眼异常。动物护理和处理得到动物实验的机构委员会批准，Weizmann Institute IACUC许可(号04270911-2)。
药物制备和给药
将强心苷的储备溶液溶于乙醇中，并在实验的每天在磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释，使得最终的乙醇浓度不超过1%。
建模
将地高辛(坐标3B0W)手动引入到与乌本苷(4HYT)结合的猪肾Na,K-ATP酶的结构中，以便乌本苷和地高辛的类固醇和内酯部分尽可能接近重叠，参见参考文献。然后将具有结合地高辛的结构文件提交至YASARA Energy Minimization Server。用PyMOL制备结构图。
眼内压和角膜厚度测量
兔子的IOP(mm Hg)使用校准的Pneumatonometer(型号30，Reichert technologies，图1)测量。在IOP测量前约一分钟将局部麻醉剂盐酸丁氧普鲁卡因(0.4%，25μl)施用到每个角膜。在局部给予CG(或PBS作为对照)前和半小时后(零时)读取两个基线IOP读数。两次测量的读数几乎相同，表明CG’s对基底IOP无影响。在零时将一滴4AP(40mg/ml，30μl)或IB-MECA(1μM，30μl)给予至每只兔子的两只眼睛。IOP测量在不同时间进行，如在每个实验中所示。在IOP升高数小时的实验中，每1.5小时加入4AP或每2小时加入IB-MECA。当XmmHg值的标准差为0.1-0.4 mmHg之间即X±0.1-0.4 mmHg时接受Pneumatonometer读数，表示与由4AP或IB-MECA诱导的IOP中最少增加3mmHg相比6-13%的可能误差和与最高增加6mmHg相比1.6-6.7%的可能误差。每个实验重复两或三次，其中具有类似的结果。在所有情况下，附图描绘与对照±SEM相比对IOP的平均效果(即四或六只眼)。未在图中见到误差条的地方，误差比使用的符号小。与对照的差异显著性通过未配对的学生t检验(p值)来计算。p值<0.05被认为是显著的。在用CG和4AP处理的实验之前和期间使用超声测厚仪(Sonogage pachometer，Cleveland，USA)测量角膜厚度(μm)。值表示每只眼睛三次独立测量的平均值。
缩写：
IOP，眼内压；
CG，强心苷；
4AP，4-氨基吡啶。
虽然已经说明和描述了本发明的某些实施方案，但应当清楚的是本发明不限于本文描述的实施方案。多种修改、改变、变化、替代和等同物对本领域技术人员来说将是显而易见的，而不脱离如随后权利要求所述的本发明的精神和范围。
参考文献