发明背景
领域
本发明涉及新的荧光或着色染料，和它们的制备方法以及在多种分析方法中的用途。
相关技术的描述
已知荧光和/或着色染料特别适用于其中需要高灵敏度的检测试剂的应用。能够优先标记样品中的特定成分或组分的染料使得研究人员能够测定该特定成分或组分的存在、量和/或位置。此外，可以针对不同环境中的空间和时间分布来监控特定体系。
荧光和比色法在化学和生物学方面非常普遍。这些方法对于生物分子的存在、结构、距离、取向、络合和/或位置给出了有用的信息。此外，时间分辨的方法越来越多地用于热力学(dynamics)和动力学(kinetics)的测量。因此，已经开发了用于生物分子例如核酸和蛋白质的荧光或颜色标记的许多策略。
苝和相关染料具有高光化学持久性(化学、热和光化学稳定性)和高荧光量子产率，并用于各种复制过程、太阳能电池、光伏器件和染料激光器。然而，苝衍生物已经主要被用作颜料和荧光染料。已经报道了多种颜色和光吸收性能的苝染料。例如，Becker S.等,Chem.Eur.J.,6,213,984,(2000)报道了热致苝二甲酰亚胺发色团的合成，其显示了由蓝色至橙色的颜色变化。苝和相关的发色团已视为仅限于用作生物分子探针，显然是由于这些类型的分子的强疏水特性以及具有相同类型的生物分子的区域特异性标记困难。
因此，本领域需要水溶性染料和生物标志物，其允许生物分子的视觉或荧光检测，而无需预先照射或化学或酶促活化。理想情况下，这些染料和生物标志物应该是强烈显色或发荧光的，并且应该以各种颜色和荧光波长获得。本发明满足了这一需要并提供了进一步的相关优点。
简要概述
简而言之，本发明通常涉及可用作水溶性、荧光或着色的染料和探针的化合物，其使得能够目视检测生物分子和其它分析物以及其制备用试剂。还描述了用于目视检测生物分子和用于测量生物分子尺寸的方法。本发明的水溶性、荧光或着色染料强烈地显色和/或发荧光并且可以容易地通过目视观察或其它手段观察到。在一些实施方案中，该化合物可以无先前照明或化学或酶活化而被观察到。通过合适的选择如本文所描述的染料，可以获得多种颜色的目视可检测的生物分子。
在一个实施方案中，提供了具有以下结构(I)的化合物：
或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R1、R2、R3、R4、R5、L1、L3、L4、L6、L7、L8、M1、M2、q、w和n如本文所定义。
在另一个实施方案中，提供了染色样品的方法，该方法包含以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加本文所描述的代表性化合物。
仍在其他实施方案中，本公开内容提供一种用于目视检测生物分子的方法，包含：
(a)提供本文所描述的代表性化合物；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
其它公开的方法包括一种用于目视检测生物分子的方法，所述方法包含：
(a)将任何所公开的化合物与一种或多种生物分子混合；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
其他实施方案涉及一种组合物，所述组合物包含任何一种公开的化合物和一种或多种生物分子。还提供了这种组合物在检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。
本发明的这些和其它方面将在参考以下详细的描述中变得显而易见。
发明详述
在以下描述中，阐述某些具体细节旨在提供对本发明多种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解本发明可以在没有这些细节的情况下实施。
除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求通篇范围内，词“包含”及其变体，如，“包含了”和“包含着”将解释成是开放、包括性意义，即，解释为“包括但不限于”。
本说明书通篇范围内对“一个实施方案“或“某个实施方案”的谈及意指在本发明的至少一个实施方案中包含与某实施方案联系所描述的具体特点、结构或特征。因此，短语“在一个实施方案中”或“在某个实施方案中”在本说明书通篇范围内多个位置的出现并不必然地全都指相同的实施方案。另外，具体特点、结构或特征可以在一个或多个实施方案中按任何适合的方式组合。
“氨基”指-NH2基团。
“羧基”指–CO2H基团。
“氰基”指-CN基团。
“甲酰基”指-C(＝O)H基团。
“羟”或“羟基”指-OH基团。
“亚胺基”指＝NH基团。
“硝基”指-NO2基团。
“氧代”指＝O取代集团。
“巯基”指–SH基团。
“硫代”指＝S基团。
“烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述烃链基团是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或叁键)，具有1个至12个碳原子(C1-C12烷基)、优选地1个至8个碳原子(C1-C8烷基)或1个至6个碳原子(C1-C6烷基)，并且通过单键与分子的其余部分连接，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔-丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非在说明书中另有特别说明，烷基可以是任选取代的。
“亚烷基”或“亚烷基链”指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与取代基连接的直链或支链二价烃链，所述二价烃链是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或叁键)并且具有1个至12个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正-亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键与分子的其余部分连接并通过单键或双键与取代基连接。亚烷基链与分子其余部分及与取代基的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明，否则亚烷基链可以是任选取代的。
“氨基亚烷基”是指包含一种或多种氨基取代基的所定义的亚烷基。除非在说明书中另有明确说明，氨基亚烷基是任选取代的。
“烷氧基”指式-ORa的基团，其中Ra是如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。除非在说明书中另有明确说明，否则烷氧基可以是任选取代的。
“烷基氨基”是指式-NHRa或-NRaRa的基团，其中每一个Ra独立地为如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。除非在说明书中另有明确说明，烷基氨基可以是任选取代的。
“烷基醚基”指如上文定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。烷基醚包含至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个碳氧键。例如，在烷基醚的含义内包括聚乙二醇(PEG)。除非在说明书中另有明确说明，否则烷基醚基是任选取代的。例如，在一些实施方案中，烷基醚用醇或磷酸酯取代。
“亚烷基醚基”是指如上文定义的亚烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。亚烷基醚基包含至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个碳氧键(即，“聚亚烷基醚基”)。PEG连接基团是聚亚烷基醚的实例。“羟基聚亚烷基醚基”是指包含至少一个羟基取代基的聚亚烷基醚基。“氨基聚亚烷基醚基”是指包含至少一个氨基(包括烷基氨基、芳基氨基和芳烷基氨基)取代基的聚亚烷基醚。除非在说明书中另有明确说明，亚烷基醚、聚亚烷基醚、羟基聚亚烷基醚和氨基聚亚烷基醚的基团是任选取代的。
“烷基磷酰基”是指-RP(＝O)(Ra)Rb基团，其中R是亚烷基，Ra为OH、O-或ORc；并且Rb为-氧烷基或-氧烷基醚，其中Rc为抗衡离子(例如Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，烷基磷酰基团可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基磷酰基团中的-氧烷基或-氧烷基醚基团(Rb)任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。“氧烷基磷酰是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基磷酰基团。除非在说明书中另有明确说明，氧烷基磷酰基团可以是任选取代的。
“烷基醚磷酰基”是指-RP(＝O)(Ra)Rb基团，其中R为亚烷基醚基团，Ra为OH、O-或ORc；和Rb为-氧烷基或-氧烷基醚，其中Rc为抗衡离子(例如，Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，烷基醚磷酰基团可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在烷基醚磷酰基团中的-氧烷基或-氧烷基醚基团(Rb)任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。“氧烷基醚磷酰基为是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基醚磷酰基团。除非在说明书中另有明确说明，氧烷基醚磷酰基团可以是任选取代的。
“烷基硫代磷酰基”是指-P(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra为O或S，Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd；和Rc为-氧烷基或-氧烷基醚，其中Rd为抗衡离子(例如Na+等)和条件是：Ra为S或Rb为S-或SRd；或条件是Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有明确说明，否则烷基硫代磷酰基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基硫代磷酰基中的-氧烷基或-氧烷基醚基团任选用以下一种或多种基团取代：羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基。“氧烷基硫代磷酰基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基硫代磷酰基。除非在本说明书中另外声明，否则氧烷基硫代磷酰基可以是任选取代的。
“烷基醚硫代磷酰基”是指-P(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra为O或S，Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd；和Rc为-氧烷基或-氧烷基醚，其中Rd为抗衡离子(例如Na+等)和条件是Ra为S或Rb为S-或SRd；或条件是Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有明确说明，烷基醚硫代磷酰基团可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基醚硫代磷酰基中的-氧烷基或-氧烷基醚基团任选用以下一种或多种基团取代：羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基。“氧烷基醚硫代磷酰基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基醚硫代磷酰基。除非在本说明书中另外声明，否则氧烷基醚硫代磷酰基可以是任选取代的。
“酰胺基”是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb独立地为H、烷基或芳基。除非在说明书中另有明确说明，否则酰胺基可以是任选取代的。
“芳基”是指包含6至18个碳原子和至少一个碳环芳环的碳环状环体系基团。出于本发明的目的，芳基可以是单环状、双环状、三环状或四环状环体系，其可以包括稠合或桥环体系。芳基包括但不限于衍生自苯并苊(aceanthrylene)、苊烯、荧蒽(acephenanthrylene)、蒽、薁、苯、、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯、芘和三亚苯的芳基。除非在本说明书中另外声明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(如“芳烷基”中)意在包括任选取代的芳基。
“芳氧基”是指式-ORa的基团，其中Ra是如上所定义的芳基，例如苯氧基等。除非在说明书中另有明确说明，芳氧基可以是任选取代的。
“芳烷基”是指式-Rb-Rc的基团，其中Rb是如上文定义的亚烷基链并且Rc是如上文定义的一种或多种芳基，例如，苄基、二苯甲基等。除非在说明书中另有明确说明，芳烷基可以是任选取代的。
“氧芳烷基”是通过氧键合与分子剩余部分连接的芳烷基。“ODMT”指通过O原子与分子其余部分连接的二甲氧基三苯甲基。除非在本说明书中另外声明，否则氧芳烷基可以是任选取代的。
“氰基烷基”指包含至少一个氰基取代基的烷基。一个或多个-CN取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则氰基烷基可以是任选取代的。
“碳环状环”是其中每一个环原子是碳的环。碳环状环可以是饱和或不饱和的，包括芳族环。除非在说明书中另有明确说明，否则碳环基是任选取代的。
“环烷基”指稳定非芳族单环状或多环状碳环状环，所述非芳族单环状或多环状碳环状环可以包括稠合或桥环体系，具有3个至15个碳原子，优选地具有3个至10个碳原子，并且是饱和或不饱和的以及通过单键与分子的其余部分连接。单环状环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环状环烷基包括例如金刚烷基、降冰片基、萘烷基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非在本说明书中另外声明，否则环烷基可以是任选取代的。
“环烷基烷基”是指式-RbRd的基团，其中Rb为如上文定义的亚烷基链和Rd为如上所定义的环烷基。除非在说明书中另有明确说明，环烷基烷基可以是任选取代的。
“多环的”指具有多于一个环的任何分子。这些环可以稠合、为螺环状或由一个或多个原子分隔(例如，通过非环连接基连接)。
“螺环”指其中两个环共有单个碳原子的多环分子。
“稠合的”是指稠合到本发明的化合物中的存在的环结构的本文所描述的任何环结构。当稠合的环是杂环基或杂芳基时，在存在的环结构上的任何碳原子(其变成稠合杂环基环或稠合杂芳基环的部分)可以被氮原子替代。
“卤”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘。
“卤代烷基”指如上文定义的烷基，所述烷基由一个或多个如上文定义的卤素基团取代，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。除非在说明书中另有明确说明，否则卤代烷基可以是任选取代的。
“杂环基”或“杂环状环”是指稳定的三元至十八元芳环基(杂芳基)或非芳环基，其中至少一个环原子为选自氮、氧和硫的杂原子，并且剩余的环原子选自碳、氮、氧和硫。除非在说明书中另有明确说明，杂环基可以单环状、双环状、三环状或四环状环体系，所述环体系可以包括稠合或桥环体系；并且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季化；和杂环基可以是部分或完全饱和的。这类杂环基的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑啉基、哌啶、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉、硫吗啉基、1-氧代-硫代吗啉、和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非在本说明书中另外声明，否则杂环基可以是任选取代的。
“N-杂环基”指如上文定义的杂环基，所述杂环基含有至少一个氮并且其中杂环基与分子其余部分接合的点经过杂环基中的氮原子。除非在本说明书中另外声明，否则N-杂环基可以是任选取代的。
“杂环基烷基”是指式-RbRe的基团，其中Rb是如上文定义的亚烷基链并且Re是如上文定义的杂环基，并且如果杂环基是含氮杂环基，则该杂环基可以与烷基在氮原子处连接。除非在本说明书中另外声明，否则杂环基烷基可以是任选取代的。
“杂芳基”是指包含1个至13碳原子、1个至6个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5元至14元环体系。出于本发明的目的，杂芳基可以单环状、双环状、三环状或四环状环体系，所述环体系可以包括稠合或桥环体系；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季化。实例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二唑基、苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯基、1,4-苯并二烷基、苯并萘并呋喃基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并噻吩)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基，异吲哚啉基、异喹啉基、吲嗪基、异唑基、萘啶基、二唑基、2-氧代吖庚因基、唑基、环氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基，1-氧基哒嗪基，1-苯基-1H-吡咯基，吩嗪基，吩噻嗪基、吩嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(即噻吩基)。除非在说明书中另有特别说明，杂芳基可以是任选取代的。
“N-杂芳基”指如上文定义的杂芳基，所述杂芳基含有至少一个氮并且其中杂芳基与分子其余部分接合的点经过杂芳基中的氮原子。除非在本说明书中另外声明，否则N-杂芳基可以是任选取代的。
“杂芳基烷基”是指式-RbRf的基团，其中Rb是如上文定义的亚烷基链并且Rf是如上文定义的杂芳基。除非在本说明书中另外声明，否则杂芳基烷基可以是任选取代的。
“羟基烷基”指包含至少一个羟基取代基的烷基。一个或多个-OH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则羟基烷基可以是任选取代的。
“羟基亚烷基”是指包含至少一个羟基取代基的亚烷基。一个或多个-OH取代基可以是在伯、仲或叔碳原子上。除非在说明书中另有明确说明，羟基亚烷基是任选取代的。
“羟基烷基醚基”指包含至少一个羟基取代基的烷基醚基。一个或多个-OH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则羟基烷基醚基可以是任选取代的。
“磷酸酯基”是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra为OH、O-或ORc；和Rb为OH、O-、ORc，另一个磷酸酯(如在二磷酸酯和三磷酯中)硫代磷酸酯、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚或硫代磷酰烷基醚的基团，其中Rc为抗衡离子(例如，Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，否则磷酸酯基可以是任选取代的。
“磷酰基”是指二价-OP(＝O)(Ra)O-基团，其中Ra为O-或ORc；其中Rc为抗衡离子(例如H+、Na+等)。
“磷酰烷基”是指-P(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra为OH、O-或ORc；和Rb为-氧烷基，其中Rc为抗衡离子(例如Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，磷酰烷基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在磷酰烷基中-氧烷基任选被一个或多个羟基、氨基、巯基或磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。“氧磷酰烷基是通过氧原子与分子剩余部分连接的磷酰烷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧磷酰烷基可以是任选取代的。
“磷酰亚烷基”是指二价-OP(＝O)(Ra)Rb-基团，其中Ra为O-或ORc；和Rb为-氧亚烷基，其中Rc为抗衡离子(例如H+、Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，磷酰亚烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在磷酰烷基中的亚烷基基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基或磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代，其取代基是任选取代的。
“磷酰烷基醚基”是指-P(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra为OH、O-或ORc；和Rb为-氧烷基醚，其中Rc为抗衡离子(例如Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，磷酰烷基醚基团可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在磷酰烷基醚基团中的-氧烷基醚基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。“氧磷酰烷基醚基为通过氧原子与分子的剩余部分连接的磷酰烷基醚基团。除非在说明书中另有明确说明，氧磷酰烷基醚基团可以是任选取代的。
“巯基烷基”是指包含至少一个巯基取代基的烷基。一个或多个-SH取代基可以是在伯、仲或叔碳原子上。除非在说明书中另有明确说明，巯基烷基可以是任选取代的。
“巯基烷基醚基”是指包含至少一个巯基取代基的烷基醚基。一个或多个-SH取代基可以是在伯、仲或叔碳原子上。除非在说明书中另有明确说明，巯基烷基醚基团可以是任选取代的。
“磺酸酯基”是指-OS(O)2Ra基团，其中Ra为烷基或芳基。除非在说明书中另有明确说明，磺酸酯基团可以是任选取代的。
“硫代烷基”是指式-SRa的基团，其中Ra为如上所定义包含1个至12个碳原子的烷基。除非在说明书中另有明确说明，硫代烷基可以是任选取代的。
“硫代磷酸酯基”是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra为O或S，Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd；和Rc为OH、O-、ORd、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基，其中Rd为抗衡离子(例如Na+等)和条件是：Ra为S或Rb为S-或SRd；或条件是Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酸酯基团可以是任选取代的。
“硫代磷酰基”是指二价-RdP(＝Ra)(Rb)Rc-基团，其中Ra、Rc和Rd各自独立地为O或S；Rb为O-、S-、ORe或SRe；其中Re为抗衡离子(例如H+、Na+等)并且条件是：Ra为S；或Rb为S-或SRe；或Rc为S；或Rd为S，或其组合。
“硫代磷酰烷基”是指-P(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra为O或S，Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd；和Rc为-氧烷基，其中Rd为抗衡离子(例如Na+等)并且条件是：Ra为S或Rb为S-或SRd；或条件是Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酰烷基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在硫代磷酰烷基基团中的-氧烷基任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。“氧硫代磷酰烷基为经由氧原子连接到分子的剩余部分的硫代磷酰烷基。除非在说明书中另有明确说明，氧硫代磷酰烷基可以是任选取代的。
“硫代磷酰亚烷基”是指二价-RdP(＝Ra)(Rb)Rc-基团，其中Ra和Rd各自独立地为O或S，Rb为O-、S-、ORe或SRe；和Rc为-氧亚烷基或-硫亚烷基，其中Re为抗衡离子(例如H+、Na+等)和条件是：Ra为S；或Rb为S-或SRe；或Rc为-硫亚烷基；或Rd为S，或其组合。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酰亚烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，硫代磷酰亚烷基中的亚烷基基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代,其取代基是任选取代的。
“硫代磷酰烷基醚基”是指-P(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra为O或S，Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd；和Rc为-氧烷基醚基，其中Rd为抗衡离子(例如Na+等)并且条件是：Ra为S或Rb为S-或SRd；或条件是Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酰烷基醚基团可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在硫代磷酰烷基中-氧烷基醚基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。“氧硫代磷酰烷基醚基为通过氧原子连接到分子剩余部分的硫代磷酰烷基醚基团。除非在说明书中另有明确说明，氧硫代磷酰烷基醚基团可以是任选取代的。
在本文中所使用的术语“取代的”是指上述任一基团(即，烷基、亚烷基、氨基亚烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基醚基、亚烷基醚基、聚亚烷基醚基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、烷基磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基硫代磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、酰胺基、硫代烷基、芳基、芳氧基、芳烷基、氧芳烷基、氰基烷基、碳环状环基、环烷基、环烷基烷基、卤烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基、杂芳基烷基、羟基烷基、羟基亚烷基、氨基烷基、羟基烷基醚、磷酰烷基、磷酰亚烷基、磷酰烷基醚、巯基烷基、巯基烷基醚基、磺酸根、硫代磷酰烷基、硫代磷酰亚烷基和/或硫代磷酰烷基醚基)，其中至少一个氢原子由与非氢原子形成的键替换，所述非氢原子例如是，但不限于卤原子如F、Cl、Br和I；多种基团如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子；多种基团如硫醇基、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子；多种基团如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子；多种基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和多种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与杂原子(如氧代、羰基、羧基和酯基中的氧；和多种基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮)形成的更高级键(例如，双键或叁键)替换。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子由-NRgRh、-NRgC(＝O)Rh、-NRgC(＝O)NRgRh、-NRgC(＝O)ORh、-NRgSO2Rh、-OC(＝O)NRgRh、-ORg、-SRg、-SORg、-SO2Rg、-OSO2Rg、-SO2ORg、＝NSO2Rg，和-SO2NRgRh替换的上述任一基团。“取代的”还意指其中一个或多个氢原子被-C(＝O)Rg、-C(＝O)ORg、-C(＝O)NRgRh、-CH2SO2Rg、-CH2SO2NRgRh替代的任何上述基团。在前述中，Rg和Rh是相同的或不同的，并且独立地为氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与氨基、氰基、羟基、亚胺基、硝基、氧代、硫代、卤素、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基形成的键替换。此外，前述取代基的每一者也可以任选由一个或多个上述取代基取代。
关于“M”基团的“共轭”指一个p-轨道与另一个p-轨道跨居间的σ键重叠。共轭可以出现在环状或非环化合物中。“共轭度”指至少一个p-轨道与另一个p-轨道跨居间的双键重叠。例如，1,3-丁二烯具有一个共轭度，而苯和其他芳族化合物一般具有多个共轭度。荧光和着色化合物一般包含至少一个共轭度。
“荧光”指能够吸收特定频率的光并发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员熟知的。
“着色的”指吸收有色光谱(即，红色、黄色、蓝色等)内光的分子。
“连接基”指至少一个原子(如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链，所述连续链将分子的一部分连接至相同分子的另一个部分或连接至不同分子、部分或固体载体(例如，微粒子)。连接基可以经共价键或其他方式如离子相互作用或氢键相互作用连接分子。
出于本发明的目的，术语“生物分子”指多种生物材料的任一者，所述生物材料包括核酸、糖、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适配体及其混合物。更具体地，该术语意在包括而不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生化的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素，以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。如本文进一步描述，通过以下方式制备本发明的目视可检测生物分子(即，与生物分子连接的结构(I)的化合物)：使生物分子与具有反应基团的化合物接触，所述反应基团能够借助生物分子上的任何可用原子或官能团如氨基、羟基、羧基或巯基，使该生物分子与化合物连接。
术语“可视的”和“目视可检测的”在本文中用来指没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下通过视检可观察的物质。这类目视可检测的物质在范围从约300nm至约900nm的光谱区吸收并发光。优选地，这类物质强烈着色，优选地具有至少约40,000、更优选地至少约50,000、仍然更优选地至少约60,000、仍更优选地至少约70,000和最优选地至少约80,000M-1cm-1的摩尔消光系数。可以通过用肉眼观察，或借助基于光学的检测装置，包括而不限于，吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪，检测到本发明的生物分子。目视可检测的物质不限于在可见光谱发射和/或吸收光的那些。“目视可检测的”物质的范围内还包括在紫外(UV))区(约10nm至约400nm)、红外(IR)区(约700nm至约1mm)发射和/或吸收光的物质和在其他电磁波谱区发射和/或吸收的物质。
为了本发明的目的，术语“光稳定的可视染料”指如上文所定义那样目视可检测并且当暴露于光时没有显著改变或分解的化学部分。优选地，在暴露于光至少1小时后，光稳定的可视染料不显示明显的漂白作用或分解。更优选地，在暴露于光至少12小时、仍然更优选地至少24小时、然而仍更优选地至少1周和最优选地至少1个月后，可视染料稳定。适用于本发明化合物和方法中的光稳定可视染料的非限制性例子包含偶氮染料、硫靛蓝染料、喹吖啶酮颜料、二嗪、酞菁、芘酮、二酮吡咯并吡咯、喹酞酮和truarycarbonium。
如本文所用，术语“苝衍生物”意在包括目视可检测的任何取代的苝。但是，该术语不意在包括苝本身。类似地使用术语“蒽衍生物”、“萘衍生物”和“芘衍生物”。在一些优选的实施方案中，衍生物(例如，苝衍生物、芘衍生物、蒽衍生物或萘衍生物)是苝、蒽、萘或芘的酰亚胺、二酰亚胺或肼酰亚胺(hydrazamimide)衍生物。
本发明的目视可检测生物分子可用于广泛类型的生物化学应用和生物医学应用，其中需要确定特定生物分子的存在、位置或量。因此，在另一个方面，本发明提供一种用于目视检测生物分子的方法，包含：(a)提供具有包含与生物分子连接的结构(I)的化合物的目视可检测生物分子的生物体系；并且(b)通过其可视特性检测生物分子。出于本发明的目的，短语“通过其可视特性检测生物分子”意指在没有光照或化学激活或酶促激活的情况下用肉眼或借助基于光学的检测装置观察生物分子，所述检测装置包括而不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪。光密度计可以用来对存在的目视可检测生物分子的量定量。例如，可以通过测量相对光学密度确定两份样品中生物分子的相对量。如果已知染料分子每生物分子的化学计量并已知染料分子的消光系数，则也可以从光学密度的测量确定生物分子的绝对浓度。如本文所用，术语“生物体系”是用来指除目视可检测生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。这类生物体系的非限制性例子包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、分析混合物和杂交反应混合物。
“微颗粒”是一种固体载体类型并且是指可用于与本发明化合物连接的众多小粒子的任一个，包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方案中，微粒子包含聚苯乙烯珠。
“碱基配对部分”指能够借助氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)与互补性杂环部分杂交的杂环部分。碱基配对部分包括天然碱基和非天然碱基。碱基配对部分的非限制性例子是RNA和DNA碱基，如腺苷、鸟苷、胸苷、胞嘧啶和尿苷及其类似物。
本文公开的发明还意在涵盖通过一个或多个原子由具有不同原子质量或质量数的原子替换而进行同位素标记的全部的结构(I)化合物。可以掺入所公开化合物的同位素的例子分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I、和125I。
同位素标记的结构(I)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和以下实施例中所述的那些相似的方法，使用适宜的同位素标记试剂而非先前所用的非标记试剂来制备。
“稳定化合物”和“稳定结构”意指这样的化合物，所述化合物充分稳健以承受从反应混合物分离至有用纯度和配制成有效治疗剂。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或环境可能出现或可能不出现，并且这种描述包括其中所述事件或环境出现的情况及其中它不出现的情况。例如，“任选取代的烷基”意指烷基可以是取代的或可以是未取代的并且该描述包括取代的烷基和没有取代基的烷基。
“盐”包括酸加成盐和碱加成盐。
“酸加成盐”指与无机酸和与有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如是但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如是但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、延胡索酸、乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟-2-萘酸、尼克酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对-甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。
“碱加成盐”指从添加无机碱或有机碱至游离酸所制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂，如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙基胺、三丙基胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星、乙二胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
通常，结晶产生本发明化合物的溶剂化物。本发明包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”指包含一个或多个分子的本发明化合物与一个或多个分子的溶剂的聚集物。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真溶剂化物，而在其他情况下，本发明的化合物可以仅保留外来水或另一种溶剂或是水外加一些外来溶剂的混合物。
本发明的化合物(例如化合物I-VII)或其盐、互变异构体或溶剂化物可以含有一个或多个非对称中心并且因此可以产生可以根据绝对立体化学定义相对于氨基酸而定义为(R)-或(S)-或定义为(D)-或(L)-的对映异构体、非对映异构体及其他立体异构形式。本发明意在包括全部这类可能的异构体以及其消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术例如色谱和分级结晶拆分。用于制备/分离单独的对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体中手性合成或例如使用手性高压液相色谱(HPLC)拆分消旋物(或盐或衍生物的消旋物)。当本文所述的化合物含有烯属双键或其他几何非对称性中心时并且除非另外说明指定，否则该化合物意在同时包括E和Z几何异构体。同样，还意在包括全部互变异构形式。
“立体异构体”指由不可互换的借助相同键结合、但具有不同三维结构的相同原子组成的化合物。本发明构思了多种立体异构体及其混合物并且包括“对映异构体”，所述对映异构体是指其分子彼此是不可叠加镜像的两种立体异构体。
“互变异构体”指质子从分子的一个原子位移至同一分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的多种互变异构形式可由本领域普通技术人员容易地衍生。
使用ACD/命名9.07版软件程序和/或ChemDraw第10.0版软件命名程序(CambridgeSoft)，本文所用的化学命名方案和结构简图是I.U.P.A.C.命名系统的修改形式。还使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。
“键合”是指一个分子或原子与另一个原子或分子相联系的方法。键合包括离子键合、共价键合、螯合、缔合络合、氢键合等。能够使与分析物分子或固体载体键合的基团为能够通过任何以上方法与分析物分子或固体载体相联系的基团。在一个实施方案中，基团通过共价键合于分析物分子或固体载体键合(即，能够与分析物分子或固体载体形成共价键的基团)。
如上所指出，在本发明的一个实施方案中，提供了在多种分析方法中可用作荧光和/或着色染料的化合物。
在一个实施方案中，该化合物具有以下结构(I):
或其盐或立体异构体，其中：
M1和M2在每次出现时独立地为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的基团，和在M1至少一次出现时为包含三个或更多芳环或杂芳环，或其组合的基团；
L1、L3、L4、L6、L7和L8在每次出现时独立地为任选的亚烷基或杂亚烷基连接基；
R1在每次出现时独立地为H、烷基或烷氧基；
R2为电子对、H、烷基、烷基醚、羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚、巯基烷基、巯基烷基醚、氰基烷基、磷酰、硫代磷酰、烷基磷酰、烷基硫代磷酰、烷基醚磷酰、烷基醚硫代磷酰、磷酰烷基、磷酰烷基醚、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚；或R2为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R3为H、OH、SH、-NH2、烷基、烷基醚、羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚基、巯基烷基、巯基烷基醚基、氰基烷基、-氧芳烷基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、-氧烷基磷酰基、-氧烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、-氧烷基醚磷酰基、-氧烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基、硫代磷酰烷基醚、-氧磷酰烷基、-氧磷酰烷基醚基、-氧硫代磷酰烷基或-氧硫代磷酰烷基醚基；或R2为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R4在每次出现时独立地为O-、S-、OZ、SZ或N(R6)2，其中Z为阳离子和各个R6独立地为H或烷基；
R5在每次出现时独立地为氧代、硫代或不存在；
L9和L11在每次出现时独立地为任选的连接基；
L10在每次出现时独立地为选自聚亚烷基醚基、羟基亚烷基、氨基亚烷基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、磷酰基、硫代磷酰基、磷酰亚烷基或硫代磷酰亚烷基的二价官能团；
Q为能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或Q为分析物分子或固体载体；
n为1-20的整数；
对于n的各个整数值，q和w各自独立地为0或1；其中对于n的至少两个整数值，q为1；或其中对于n的至少一个整数值，q和w各自独立地为1；和
z为1-10的整数，
条件是R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在一些实施方案中，条件是R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q。在其他实施方案中，R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在一些实施方案中，对于每一个n的整数值，q为1和w为0。
在前述其他实施方案中，该化合物具有以下结构(Ia):
其中:
M1在每次出现时独立地为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的基团，和M1至少一次出现时为包含四个或更多芳环或杂芳环，或其组合的基团；
L1、L7和L3在每次出现时独立地为任选的亚烷基或杂亚烷基连接基；
R1在每次出现时独立地为H、烷基或烷氧基；
R2为电子对、H、烷基、烷基醚、羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚基、巯基烷基、巯基烷基醚基、氰基烷基、磷酰基、硫代磷酰基、烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚，或R2为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R3为H、OH、SH、-NH2、烷基、烷基醚、羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚基、巯基烷基、巯基烷基醚、氰基烷基、-氧芳烷基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、-氧烷基磷酰基、-氧烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、-氧烷基醚磷酰基、-氧烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基,、硫代磷酰烷基醚、-氧磷酰烷基、氧-磷酰烷基醚、-氧硫代磷酰烷基或-氧硫代磷酰烷基醚基；或R2为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R4在每次出现时独立地为O-、S-、OZ、SZ或N(R6)2，其中Z为阳离子和各个R6独立地为H或烷基；
R5在每次出现时独立地为氧代、硫代或不存在；
L9和L11在每次出现时独立地为任选的连接基；
L10在每次出现时独立地为选自聚亚烷基醚基、羟基亚烷基、氨基亚烷基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、磷酰基、硫代磷酰基、磷酰亚烷基或硫代磷酰亚烷基的二价官能团；
Q为与分析物分子或固体载体结合的基团或Q为分析物分子；
n为1-10的整数；和
z为1-10的整数；
条件是R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在其他一些实施方案中，该化合物具有以下结构(Ib)：
其中:
R7、R8、R9、R10、R11和R12在每次出现时独立地为H或烷基；和
x1、y1和z1在每次出现时独立地为0-5的整数。
在不同的实施方案中，该化合物具有以下结构(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)之一：
仍在在更多的实施方案中，对于n的至少一个整数值，w为1。例如，在一些实施方案中，该化合物具有以下结构(Ig)：
其中:
R7、R8、R9、R10、R11和R12在每次出现时独立地为H或烷基；和
x1、x2、y1、y2、z1和z2在每次出现时独立地0-5的整数。
在其他前述实施方案中，R5为氧代和R4为O-或OZ。
在其他一些实施方案中，R2为H或电子对，和R3为-L9-(L10)z-L11-Q。
在一些不同的实施方案中，R2为羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚基、巯基烷基或巯基烷基醚基，和R3为-L9-(L10)z-L11-Q。例如，在一些实施方案中，R2具有以下结构之一：
其中：
R2a为-OH、-NH2或-SH；和
a为1-10的整数。
在前述更多的实施方案中，R3为-L9-(L10)zL11-Q，和R2为烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚基，其中R2任选被选自-OH、-NH2和-SH的取代基取代。例如，在一些实施方案中，R2具有以下结构之一：
其中:
R2a为-OH、-SH、-NH2、磷酸酯基或硫代磷酸酯基；
R4a和R4b独立地为O-、S-、OZ或SZ，其中Z为阳离子；
R5a和R5b独立地为氧代或硫代；和
a、b和c各自独立地为1-10的整数。
在前述更多的实施方案中，R2为-L9-(L10)z-L11-Q，和R3为OH或磷酸酯基。
仍在前述更多的实施方案中，R2为-L9-(L10)z-L11-Q，和R3为被选自-OH、-NH2和-SH的取代基任选取代的磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰基、硫代磷酰基、-氧烷基磷酰基、-氧烷基硫代磷酰基、-氧烷基醚磷酰基、-氧烷基醚硫代磷酰基、-氧磷酰烷基、-氧磷酰烷基醚基、-氧硫代磷酰烷基或-氧硫代磷酰烷基醚基。例如，在一些实施方案中，R3具有以下结构之一：
其中：
R3a为-OH、-SH、-NH2、磷酸酯基或硫代磷酸酯基；
R4a和R4b独立地为O-、S-、OZ或SZ，其中Z为阳离子；
R5a和R5b独立地为氧代或硫代；和
b和c各自独立地为1-10的整数。
仍然在前述更多的实施方案中，R2为-L9-(L10)z-L11-Q，和R3为OH或磷酸酯基。
在不同的实施方案中，R4a和R4b各自为O-并且R5a和R5b各自为氧代。在一些其他实施方案中，R4a和R4b各自为O-并且R5a和R5b各自为硫代。在一些不同的实施方案中，R4a和R4b各自为S-并且R5a和R5b各自为硫代。在更多不同的实施方案中，R4a和R4b各自为S-并且R5a和R5b各自为氧代。
在一些其他实施方案中，a、b或c的至少一个为2。例如，在一些实施方案中，a、b和c的每一个为2。
在前述更多的实施方案中，a、b或c的至少一个为6。例如，在一些实施方案中，a、b和c的每一个为6。
在前述其他实施方案中，n为1-5的整数。在一些实施方案中，n为2-15的整数。在一些不同的实施方案中，n为2-10的整数。在一些其他实施方案中，n为2-5的整数。
仍然其他实施方案提供了具有以下结构(II)的化合物：
或其盐或立体异构体，其中：
M1在每次出现时独立地为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的基团，和在M1至少一次出现时为包含三个或更多芳环或杂芳环，或其组合的基团；
L1、L3和L7在每次出现时独立地为任选的亚烷基或杂亚烷基连接基；
R1在每次出现时独立地为H、烷基或烷氧基；
R2为电子对、H、磷酰基、硫代磷酰基、烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚基；或R2为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R3为H、OH、SH、-NH2、烷基、烷基醚、羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚基、巯基烷基、巯基烷基醚基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、-氧烷基磷酰基、-氧烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、-氧烷基醚磷酰基、-氧烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基、硫代磷酰烷基醚基、-氧磷酰烷基、-氧磷酰烷基醚基、-氧硫代磷酰烷基或-氧硫代磷酰烷基醚基；或R3为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R4在每次出现时独立地为O-、S-、OZ、SZ或N(R6)2，其中Z为阳离子和每一个R6独立地为H或烷基；
R5在每次出现时独立地为氧代、硫代或不存在；
L9和L11在每次出现时独立地为任选的连接基；
L10在每次出现时独立地为选自聚亚烷基醚基、羟基亚烷基、氨基亚烷基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、磷酰基、硫代磷酰基、磷酰亚烷基或硫代磷酰亚烷基的二价官能团；
Q为能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或Q为分析物分子或固体载体；
n为1-20的整数；和
z为1-10的整数，
条件是R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在一些实施方案中，R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q。在不同的实施方案中，R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在前述其他实施方案中，R3为-L9-(L10)z-L11-Q，和R2为电子对或H。
仍然在前述更多的实施方案中，R3为-L9-(L10)z-L11-Q，和R2为烷基磷酰基、烷基硫代磷酰基、烷基醚磷酰基、烷基醚硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚基，其中R2任选被选自-OH、-NH2和-SH的取代基取代。例如，在一些实施方案中R2具有以下结构之一：
其中:
R2a为-OH、-SH、-NH2、磷酸酯基或硫代磷酸酯基；
R4a和R4b独立地为O-、S-、OZ或SZ，其中Z为阳离子；
R5a和R5b独立地为氧代或硫代；和
a、b和c各自独立地为1-10的整数。
在一些不同的实施方案中，R2为-L9-(L10)z-L11-Q，和R3为OH或磷酸酯基。在一些其他实施方案中，R2为-L9-(L10)z-L11-Q，和R3为被选自-OH、-NH2和-SH的取代基任选取代的磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰基、硫代磷酰基、-氧烷基磷酰基、-氧烷基硫代磷酰基、-氧烷基醚磷酰基、-氧烷基醚硫代磷酰基、-氧磷酰烷基、-氧磷酰烷基醚基、-氧硫代磷酰烷基或-氧硫代磷酰烷基醚基。
在前述其他实施方案中，R3具有以下结构之一：
其中:
R3a为-OH、-SH、-NH2、磷酸酯基或硫代磷酸酯基；
R4a和R4b独立地为O-、S-、OZ或SZ，其中Z为阳离子；
R5a和R5b独立地为氧代或硫代；和
b和c各自独立地为1-10的整数。
在多种实施方案中，在每次出现时R4为O-和R5为氧代。
在不同的实施方案中，L1、L3和L7各自为亚烷基连接基。
在一些其他不同的实施方案中，L1和L3各自为亚烷基连接基和L7不存在。在这些实施方案的一些中，亚烷基是亚甲基。
其他实施方案提供了具有以下结构(III)的化合物：
或其盐或立体异构体，其中：
M1为包含三个或更多个芳环或杂芳环或其组合的基团；
R1为H、烷基或烷氧基；
R2为H、电子对或阳离子；或R2为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R3为H、磷酸酯基或OH；或R3为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物；
R4为O-、S-、OZ、SZ，其中Z为阳离子；
R5为氧代或硫代；
R7、R8、R9、R10、R11和R12在每次出现时独立地为H或烷基；
L9和L11在每次出现时独立地为任选的连接基；
L10在每次出现时独立地为选自聚亚烷基醚基、羟基亚烷基、氨基亚烷基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、磷酰基、硫代磷酰基、磷酰亚烷基或硫代磷酰亚烷基的二价官能团；
Q为能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或Q为分析物分子或固体载体；和
x、y和z在每次出现时独立地为0-5的整数；和
z为1-10的整数；
条件是R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在一些其他实施方案中，R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q。在不同的实施方案中，R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。
在其他实施方案中，x、y和z各自为1。
在多种其他的实施方案中，x为0和y和z各自为1。
M1通常是目视可检测的基团或物质。例如，M1在UV、可见光或IR光谱中可以是目视可检测的。在前述任何一些中，M1在每次出现时独立地为发荧光的或显色的。例如，在一些实施方案中，M1为发荧光的。
在某些实施方案中，M1不是嘌呤或嘧啶碱基，例如但不限于鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和腺嘌呤。在其他实施方案中，M1不是卟啉。在其他实施方案中，M1不是以下之一：
仍然在前述任何其他实施方案中，M1包含3个或更多个芳基环或杂芳基环或其组合，例如4个或更多个芳基环或杂芳基环或其组合，或甚至5个或更多个芳基环或杂芳基环或其组合。在一些实施方案中，M1包含6个芳基环或杂芳基环或其组合。在其他实施方案中，环是稠合的。例如在一些实施方案中，M1包含3个或更多个稠环、4个或更多个稠环、5个或更多个稠环或甚至6个或更多个稠环。
在一些实施方案中，M1是环状的。例如，在一些实施方案中，M1是碳环。在其他实施方案中，M1是杂环。仍在前述的其他实施方案中，M1在每次出现时独立地包含芳基部分。在这些实施方案的一些实施方案中，芳基部分是多环状的。在其他更多的具体例子中，芳基部分是稠合多环状芳基部分，例如，其可以包含至少3个、至少4个或甚至多于4个芳基环。
在结构(I)的前述任一种化合物的其他实施方案中，M1在每次出现时独立地包含至少一个杂原子。例如，在一些实施方案中，杂原子是氮、氧或硫。
在前述任一的仍然更多实施方案中，M1在每次出现时独立地包含至少一个取代基。例如，在一些实施方案中，取代基是氟基、氯基、溴基、碘基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、羟基、巯基、烷氧基、芳氧基、苯基、芳基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、羧基、磺酸酯基、酰胺基或甲酰基。
在前述一些甚至更具体的实施方案中，M1在每次出现时独立地是二甲氨基茋、喹吖啶酮、氟苯基-二甲基-BODIPY、双-氟苯基-BODIPY、吖啶、三萘嵌苯、联六苯基、卟啉、苯并芘、(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基、(双-氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基、四苯基、双-苯并噻唑、三-苯并噻唑、双-萘基、双-蒽基、方酸菁、方酸菁鎓、9,10-乙炔基蒽或三-萘基部分。在其他实施方案中，M1在每次出现时独立地是是对三联苯基、苝、偶氮苯、吩嗪、菲咯啉、吖啶、硫代蒽烯、荧蒽、红荧烯、晕苯、花青、苝酰亚胺或苝酰胺或其衍生物。在仍然更多的实施方案中，M1在每次出现时独立地是香豆素染料、试卤灵染料、二吡咯亚甲基二氟化硼染料、钌联吡啶染料、能量转移染料、噻唑橙染料、多次甲基或N-芳基-1,8-萘二甲酰亚胺染料。
在前述任一的仍然更多实施方案中，M1在每次出现时是相同的。在其他实施方案中，每个M1是不同的。在仍然更多的实施方案中，一个或多个M1是相同的并且一个或多个M1是不同的。
在一些实施方案中，M1是芘、苝、苝单亚酰胺或6-FAM或其衍生物。在一些其他实施方案中，M1具有以下结构之一：
在一些实施方案中，M2选自上述M1部分的任一种。在一些实施方案中，M1和M2是相同的。在其他实施方案中，M1和M2是不同的。
在其他实施方案中，M2的至少之一次出现是碱基配对部分。例如，在一些实施方案中，M2每次出现是碱基配对部分。在这些实施方案的一些中，碱基配对部分是嘌呤、嘧啶、二氢嘧啶或其衍生物。在其他实施方案中，碱基配对部分具有以下结构之一：
本发明包括单体化合物(例如n＝1)以及低聚化合物(例如，n为2-20或2-10)。在其它前述实施方案中，n为1-5的整数。例如，在一些实施方案中，n为2-10的整数，或2-5的整数，例如3。在其他实施方案中，n为1。在更多的实施方案中，n为2。在其他实施方案中，n为3。在更多的实施方案中，n为4。在其他实施方案中，n为5。在更多的实施方案中，n为6。在其他实施方案中，n为7。在更多的实施方案中，n为8。在其他实施方案中，n为9。在更多的实施方案中，n为10。
可以包括任何数目的亚甲基间隔团单位(即，x，y和z)。在一些实施方案中，x是0。在其他实施方案中，x是1。在更多实施方案中，x是2。在一些实施方案中，x是3。在其他实施方案中，x是4。在更多实施方案中，x是5。
在一些实施方案中，y是0。在其他实施方案中，y是1。在更多实施方案中，y是2。在一些实施方案中，y是3。在其他实施方案中，y是4。在更多实施方案中，y是5。
在一些实施方案中，z是1-5。在一些实施方案中，z是0。在其他实施方案中，z是1。在更多实施方案中，z是2。在一些实施方案中，z是3。在其他实施方案中，z是4。在更多实施方案中，z是5。
在其他实施方案中，x是1，y是0并且z是1。在其他实施方案中，x是0，y是1并且z是1。
在多种实施方案中，L9存在。例如，在一些实施方案中，L9为C1-C6亚烷基。
在多种实施方案中，L10选自聚亚烷基醚、磷酰和磷酰亚烷基。例如,在一些实施方案中L10选自：
其中a为1-6的整数和b为2-10的整数。
在多种实施方案中，(L10)z具有以下结构之一：
其中b为2-10的整数，例如5。
在多种实施方案中，L9和L11各自独立地为C1-C6亚烷基连接基。在一些实施方案中，L9为C2亚烷基连接基。在其他实施方案中，L11为C6亚烷基连接基。
仍然在其它实施方案中，Q为能够与分析物分子或固体载体结合的基团。在某些实施方案中，Q提供了将结构(I)的化合物连接至分析物分子或固体载体的手段(例如通过共价键)。例如，在一些实施方案中，Q为能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团。在这方面，不限制Q基团的类型和Q基团与结构(I)的化合物的剩余部分的连接。在某些实施方案中，Q是在水性条件下不易水解的基团，但是具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体上的相应的基团形成键(例如胺)。
本文描述的化合物的某些实施方案包含通常在生物共轭领域采用的Q基团。例如，在一些实施方案中，Q为亲核反应性基团、亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中，Q为巯基、二硫基、活化酯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、炔基、烯基、二烯基、亲二烯基、酰卤基、磺酰卤基、膦基、α-卤代酰亚胺、生物素、氨基或马来酰亚胺基。在一些实施方案中，活化酯基为N-琥珀酰亚胺酯基、亚氨酸酯基或聚氟苯基酯基。在其它实施方案中，炔基是烷基叠氮基或酰基叠氮基。
在下表1中提供了示例性的Q基团。
表1.示例性Q基团
在一些实施方案中，有利的采用化合物，其中Q为-SH，因为-SH可以容易地共轭到许多分析物分子、双官能连接基团和/或固体载体(例如通过与分析物分子或固体载体上的自由的巯基形成二硫化物键)。然而，为了化合物长期稳定性的目的，以二硫化物二聚体的形式储存化合物可能是需要的。因此，一些实施方案提供了这种二硫化物二聚体。
例如，在一些实施方案中，R2或R3的至少一个为-L9-(L10)z-L11-Q或-L9-(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-I，其中I独立地表示结构(I)的另外的化合物。“结构(I)的化合物”是指本文所描述的任何化合物，其通过结构(I)包括。
该二聚体可以在R2或R3的任意一个和R2或R3的另一个之间形成。为了便于解释说明，但限制性，以下阐明了一个示例性的二聚体(Ia’)，其中二聚体在两个R2基团之间形成：
或其盐，其中R1、R3、R4、R5、L1、L3、L7、L9、L10、L11和z各自独立地如前述实施方案任一项所定义。
该二聚体还如下(Ia’)所阐明：
结构(I)的两个化合物之间的二硫化连接基，即-L9(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-，可以具有多种结构。在一些实施方案中，-L9(L10)z-L11-S-S-L11-(L10)z-L9-具有以下结构之一：
仍然在其它实施方案中，Q为分析物分子或固体载体。例如，在一些实施方案中，分析物分子为生物分子。在一些实施方案中，生物分子为核酸、氨基酸或其聚合物。在其它实施方案中，生物分子为核酸、肽、碳水化合物、脂质、酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体、抗原或朊病毒。
在不同的实施方案中，分析物分子为药物、维生素或小分子。
在多种其他实施方案中，R7、R8、R9、R10、R11和R12，当存在时，各自为H。
在一些其他不同的实施方案中，x1、y1和z1各自为1。
在更多不同的实施方案中，每一个x1为0和每一个y1和z1为1。
在一些不同的实施方案中，每一个x2为1和每一个y2和z2为0。
其他实施方案涉及具有以下结构(IV)的化合物：
或其盐或立体异构体，其中:
M1为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的基团，和M1至少一次出现时为包含三个或更多芳环或杂芳环，或其组合的基团；
Q为能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或Q为分析物分子或固体载体；
R20在每次出现时独立地为H、磷酸酯、磷酸酯取代的烷基、C1-C6烷基或C1-C6羟基烷基；和
每一个x’、y’和z’独立地为0-10的整数。
在这些实施方案的一些中，M1如在前述实施方案任一项中所定义。例如在一些实施方案中，M1为苝。
在其他实施方案中，Q如在前述实施方案任一项中所定义。例如，在一些实施方案中，Q为-SH。
在多种实施方案中，每一个y’为0。在一些不同的实施方案中，每一个z’为1。在前述更多的实施方案中，每一个x’独立地为2-6的整数。
在一些其他不同的实施方案中，R20为磷酸酯、-CH2OPO32-或CH2OH。
在一些实施方案中，化合物具有以下结构：
其它实施方案提供了具有以下结构之一的化合物：
其中Q为分析物分子。
其他实施方案涉及具有以下结构(V)的二硫化物二聚体：
或其盐或立体异构体，其中：
M1为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的的基团，和M1至少一次出现为包含三个或更多个芳环或杂芳环，或其组合的基团；
R20在每次出现时独立地为H、磷酸酯、烷基磷酸酯、C1-C6烷基或C1-C6羟基烷基；和
每一个x’、y’和z’独立地为0-10的整数。
在这些实施方案的一些中，M1如在前述实施方案任一项中所定义。例如在一些实施方案中，M1为苝。
在多种不同的实施方案中，每一个y’为0。在一些不同的实施方案中，每一个z’为1。在前述更多的实施方案中，每一个x’独立地为2-6的整数。
在一些其他不同实施方案中，R20为磷酸酯、CH2OPO32-或CH2OH。
在多种不同的其他实施方案，二硫化物二聚体具有以下结构：
在前述其他实施方案中，M1具有以下结构：
在多种其他实施方案中，提供了具有以下结构(VI)的化合物：
或其盐或立体异构体，其中：
M1为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的基团，和M1至少一次出现时为包含三个或更多个芳环或杂芳环，或其组合的基团；
Q为能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或Q为分析物分子或固体载体；
R20在每次出现时独立地为H、磷酸酯、用磷酸酯取代的烷基、C1-C6烷基或C1-C6羟基烷基；和
每一个x’、y’和z’在每次出现时独立地为0-10的整数。
在这些实施方案的一些中，M1如在前述实施方案任一项中所定义。例如，在一些实施方案中，M1为苝。
在其他实施方案中，Q如在前述实施方案任一项中所定义。例如，在一些实施方案中，Q为-SH。
在多种不同的实施方案中，每一个y’为0。在一些不同的实施方案中，每一个z’为1。在前述更多的实施方案中，每一个x’独立地为2-6的整数。
在一些其它不同的实施方案中，R20为磷酸酯、CH2OPO32-或CH2OH。
在一些实施方案中，该化合物具有以下结构：
在前述其它实施方案中，M1具有以下结构：
其他实施方案提供了具有以下结构(VII)的二硫化物二聚体：
或其盐或立体异构体，其中：
M1为包含两个或更多个双键和至少一个共轭度的基团，和M1至少一次出现时为包含三个或更多个芳环或杂芳环，或其组合的基团；
R20在每次出现时独立地为H、磷酸酯基、用磷酸酯取代的烷基、C1-C6烷基或C1-C6羟基烷基；和
每一个x’、y’和z’在每次出现时独立地为0-10的整数。
在这些实施方案的一些中，M1如在前述实施方案任一项中所定义。例如，在一些实施方案中，M1为苝。
在多种实施方案中，每一个y’为0。在一些不同的实施方案中，每一个z’为1。在前述更多的实施方案中，每一个x’独立地为2-6的整数。
在一些其他不同的实施方案中，R20为磷酸酯、CH2OPO32-或CH2OH。
在一些实施方案，二硫化物二聚体具有以下结构：
例如，在前述一些实施方案中，M1具有以下结构：
为了便于阐明，包含磷基团的多个化合物(例如磷酸酯等)以阴离子状态描述(例如-OPO32-)。本领域技术人员将容易地理解电荷取决于pH和不带电(例如质子化或盐，例如钠或其他阳离子)形式也包括在本发明的范围中。
在多个其他实施方案中提供了包含任何前述化合物和一种或多种分生物分子的组合物。在一些实施方案中，还提供了这类组合物在用于检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。
仍然在其它实施方案中，该化合物可用于多种分析方法。例如，在某些实施方案中，该公开内容提供了染色样品的方法，所述方法包含以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加结构(I)的化合物，其中R2为-L9-(L10)z-L11-Q，Q为能够与分析物分子连接的基团和R3为H、OH、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚基。
在前述方法的一些实施方案中，R2是包含与生物分子共价连接的连接基。例如，核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在仍然更多的实施方案中，生物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。
在前述方法的另外其他实施方案中，R2是包含与微粒子共价连接的连接基。例如，在一些实施方案中，微粒子是聚合物珠或非聚合物珠。
在甚至更多的实施方案中，所述光学响应是荧光响应。
在其他实施方案中，所述样品包含细胞，并且一些实施方案进一步包含通过流式细胞术观察所述细胞。
在仍然更多的实施方案中，该方法进一步包含区分所述荧光响应与具有可检出不同光学特性的第二荧光团的荧光响应。
在其他实施方案中，本公开提供一种用于目视检测生物分子的方法，包含：
(a)提供结构(I)的化合物，其中，R2为-L9-(L10)z-L11-Q，Q为能够与生物分子连接的基团和R3为H、OH、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基或硫代磷酰烷基醚基；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
例如核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在仍然更多的实施方案中，生物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。
在其他实施方案中，提供一种用于目视检测生物分子的方法，所述方法包含：
(a)将任一种前述化合物与一种或多种生物分子混合；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
可以理解，如上述的结构(I)化合物的任何实施方案和本文对结构(I)化合物中变量R1、R2、R3、R4、R5、L1、L3、L4、L6、L7、L8、M1、M2、q、w和n所述的任何具体选择可以独立地与其他实施方案和/或结构(I)化合物的变量组合以形成上文没有具体描述的本发明实施方案。此外，在一个具体实施方案和/或权利要求中针对任何特定R或M基团列出一系列选择的情况下，可以理解，每种独立选择可以从该具体实施方案和/或权利要求删除并且剩余的一系列选择将视为处于本发明的范围内。
可以理解，在本说明书中，允许所述式的取代基和/或变量的组合，只要这类贡献产生稳定的化合物。
本领域技术人员还将领会，在本文所述的方法中，中间化合物的官能团可能需要通过合适的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧羰基、苯甲氧基羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据本领域技术人员已知和如本文所述的标准技术添加或移除保护基。保护基的用途是在Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第三版,Wiley中详述。如本领域技术人员将领会，保护基也可以是聚合物树脂如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯脂。
另外，可以借助本领域技术人员已知方法通过用适宜的无机碱或酸或有机碱或酸处理，将本发明的以游离碱或酸形式存在的全部化合物转化成它们的盐。可以通过标准技术，将本发明化合物的盐转化成它们的游离碱或酸形式。
以下反应方案阐明了制备本发明化合物的示例性制备方法。可以理解，本领域技术人员可能通过相似的方法或通过组合本领域技术人员已知其他方法，能够制备这些化合物。还应当理解，通过使用适宜的起始组分并根据需要修改合成的参数，本领域技术人员将能够以如下文描述的相似方式制备下文没有具体描述的其他的结构(I)化合物。通常而言，起始组分可以从多种来源如Sigma Aldrich、Lancaster Synthesis,Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等获得或根据本领域技术人员已知的来源(参见，例如，Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第五版(Wiley,2000.12))合成或如本发明中所述那样制备。
反应方案I
反应方案I阐明了用于制备结构(I)化合物的示例性方法。R2’和R3’表示如上所定义的R2和R3基团，或R2和R3基团的前体或使用本领域已知的技术可以转化为所需R2和R3基团的其保护的衍生物，并且在以下实施例中提供。参考反应方案I，结构a的化合物可以购买或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。在本领域已知的Suzuki偶合条件下，a与M1-X的反应(其中x为卤素，例如溴)产生结构b的化合物。可以改性结构b的化合物以获得一些其它结构I的化合物。例如，结构b的化合物可以低聚以获得其它结构I的化合物(即，其中n大于1，例如2-10)。低聚的示例性的方法包括类似于基于亚磷酰胺的固相寡核苷酸合成的方法，其是本领域熟知的。
反应方案II
反应方案II阐明了制备结构I的化合物的可替代的方法。R2’和R3’表示本文所定义的R2和R3基团，或R2和R3基团的前体或使用本领域已知的技术可以转化为所需R2和R3基团的其保护的衍生物，并且在以下实施例中提供。在该方法中，结构c的化合物(其可以购买或通过熟知技术制备)与M1-Z反应以得到结构d的化合物。此处，Y和Z表示具有互补反应性的官能团(即，反应形成共价键的官能团)。Z可以是M1的侧基或M结构骨架的一部分，例如环状酸酐。Y可以是任何数目的官能团，例如氨基。
包含核糖基团的结构(I)的化合物根据类似的步骤制备或由商业来源购买(例如，如亚磷酰胺)。
在某些实施方案中，结构I的化合物是包含2-10个重复单元的低聚物。这种低聚物可以使用类似于已知自动化DNA合成方法的方法制备。DNA合成方法是本领域已知的。简而言之，两个醇基团分别使用二甲氧基三苯甲基(DMT)基团和2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺基团官能化。亚磷酰胺基团通常在活化剂例如四唑的存在下偶合至醇基团，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基基团可以用酸(例如氯乙酸)移除以露出游离醇，其可以与亚磷酰胺基团反应。2-氰乙基基团可以在低聚之后通过使用氨水处理而移除。
用于低聚方法中的亚磷酰胺的制备也是本领域熟知的。例如，伯醇(例如R3)可以通过与DMT-Cl的反应作为DMT基团保护。仲醇(例如R2)随后通过与合适的试剂例如2-氰乙基-N，N-二异丙基氯亚磷酰胺的反应官能化为亚磷酰胺。制备亚磷酰胺和他们低聚的方法是本领域熟知的并且在实施例中更详细地描述。
提供了以下实施例用于解释说明的目的，而不是限制。
实施例
一般方法
在JEOL 400MHz谱仪上获得1H和31PNMR谱。31PNMR谱参比85％磷酸水溶液并且1H谱参比TMS。使用具有保持在45℃的2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱的Waters Acquity UHPLC系统进行反相HPLC染料分析。使用MassLynx4.1采集软件，在Waters/Micromass Quattro微型MS/MS(仅以MS模式)系统上进行质谱分析。用于LC/MS染料上的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，8.6mM三乙胺(TEA)，pH8。使用具有二极管阵列探测器的Agilent Infinity 1260 UHPLC系统和使用SpiritTM肽C18柱(4.6mm x 100mm，5μm粒度)的高效自动采样器分析分析亚磷酰胺和前体分子。在Cary Eclipse光谱光度计上记录激发曲线和发射曲线实验。
除非另外声明，否则全部反应均在烘箱干燥的玻璃器具中氮气气氛下实施。市售DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling，VA)。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。全部其他化学品均购自Aldrich或TCI并且原样使用，不作额外纯化。
使用基于亚磷酰胺的偶联方法的标准方案，全部低聚体染料均在ABI 394 DNA合成仪上合成。用于合成低聚体的链装配循环如下：(i)去三苯甲基化，二氯甲烷中的3％三氯乙酸，1分钟；(ii)偶联，乙腈中的0.1M亚磷酰胺和0.45M四唑，10分钟；(iii)封端，THF/卢剔啶(1/1，v/v)中的0.5M乙酸酐，15秒；(iv)氧化，THF/吡啶/水(10/10/1，v/v/v)中的0.1M碘，30秒。
循环内部的化学步骤之后是乙腈洗涤和干燥氩气冲洗0.2-0.4分钟。通过用氨在室温1小时处理实现从载体裂解和移除碱基和磷酰胺酯保护基。随后如上文所述通过反相HPLC分析低聚体染料。
实施例1
具有活化酯基团的可溶染料的合成
实施例1例证了改性含有活化酯基团的水可溶染料物质(2和3)，其可以共轭至具有伯胺官能团的大分子。在该实施例中，含有二硫化物连接基的染料序列(1)用三(2-羧乙基)磷烷(TCEP)还原以释放两个更小的染料序列，每一个具有氟(Fluor)和游离硫醇末端。这些产物随后与N-马来酰亚胺基-6-氨基乙酰基1-羟基-2-硝基-4-苯磺酸酯(Mal-Sac-HNSA)的马来酰亚胺部分反应，在每一个染料序列上放置活化酯基团，其耐H2O介导的水解，仍然经受含有伯胺分子的亲核攻击。化合物1根据本文描述的一般步骤制备，包括类似于本领域已知的固相DNA亚磷酰胺化学的方法。
使用5mL微量移液器将3.88mL的H2O加入到50mL锥形管10mg的干燥化合物1中。使用Vortex混合器将溶解的化合物1混合大约5分钟，并且出现略微非染料相关的沉淀。将该管和其内容物在其最大速度(3280RCF)在离心管中旋转5分钟，并且随后仔细移除化合物1上清液，不干扰粒料。将澄清的化合物1转移至新的锥形管中，并且移除样品进行量化和HPLC分析。HPLC-MS证明化合物具有52％纯并且具有1648道尔顿(Da)的质量。
使用微量移液器由澄清的溶液中取样5mL的化合物1并且在H2O中稀释20倍。在NanoDrop上使用水进行空白测量，并且随后在443nm下测量稀释化合物1的吸收率。使用等式1计算化合物1的摩尔浓度：
等式1:化合物1的摩尔浓度＝{A443/(L*e化合物1)}*稀释因子
e化合物1＝38,000M-1 cm-1
Lnanodrop＝0.1cm
A443＝0.614AU
稀释因子＝20
化合物1的摩尔浓度＝3.23x10-03M化合物1。
通过称重47.7mg的TCEP并且将其加入到15mL的锥形管中制备TCEP(三(2-羧乙基)磷烷)、HCl盐的原液。将1.5mL的H2O加入到管中并且使用vortex混合器将溶液充分混合大约5分钟将TCEP溶解。得到的溶液为31.8mg/mL TCEP或0.111MTCEP。使用等式2计算化合物1的摩尔数：
等式2:化合物1的摩尔数＝{M化合物1*(V化合物1·mL/1000)}
M化合物1＝3.23x10-03M(Eq.1)
V化合物1＝3.88mL
待还原的化合物1的摩尔数＝1.23x10-05摩尔化合物1。
使用等式3计算实现TCEP与化合物1 11.3:1摩尔比的所需的TCEP的摩尔数。
等式3:TCEP的摩尔数＝摩尔数化合物1*11.3
摩尔数化合物1＝1.23x10-05(Eq.2)
摩尔过量：11.3
所需TCEP摩尔数＝1.39x10-04摩尔TCEP。
使用等式4计算添加到化合物1的TCEP的体积：
等式4:所需TCEP的体积(mL)＝{(摩尔数TCEP/MTCEP)*1000}
摩尔数TCEP＝1.39x10-04(Eq.3)
MTCEP＝0.111M
所需TCEP的体积＝1.28mL的TCEP。
TCEP的HCl盐是酸性的并且还原化合物1需要在稍许酸性至中性pH(例如，pH 6-7)下发生。NaPO4缓冲液应当大约5倍或更高摩尔过量，维持6.5的pH。由于0.6M NaPO4原液的摩尔浓度为0.111M TCEP原液的5.45倍高，加入到TCEP等体积的原液足够缓冲反应。
所需试剂的体积：
3.23x 10-03M化合物1＝3.88mL
0.6M NaPO4＝1.28mL
0.111M TCEP＝1.28mL
使用微量移液器，将1.28mL NaPO4缓冲液加入到3.88mL化合物1中。将1.28mL TCEP加入到化合物1-NaPO4溶液中，最终反应体积为6.44mL。将反应在室温下(～23℃)培育。在2小时之后，将样品移出进行HPLC-MS。HPLC分析证明在这些条件下的还原反应部分完成(可能是由于氧化的TCEP)。
存在两个还原的化合物1产物：5’-ECC-SH物种(其具有预期的785道尔顿的质量)和HS-CCE-3’物种(其具有预期的865道尔顿的质量)。
尽管在该实施例中仅部分还原，含有两个意欲产物的混合物与N-马来酰亚胺基-6-氨基己酰基1-羟基-2-硝基-4-苯磺酸酯(MSH)反应。
使用分析天平，称出37mg干燥的MSH并且转移至15mL的锥形管中。使用5mL微量移液器将3.7mL的H2O加入到管中，制备10mg/mL(0.023M)的MSH溶液。将3.1mL该MSH溶液加入到含有6.44mL化合物1还原混合物的管中，并且通过加入0.46mL H2O使所得溶液的体积达到10mL。在室温下培育反应30分钟。
对于最终10mL体积计算反应物的最终浓度：
化合物1:(3.23x 10-03M化合物1)x(3.88mL化合物1)/10mL＝1.25x 10-03M化合物1
TCEP:(0.111MTCEP)*(1.28mL TCEP)/10mL＝0.014M TCEP
MSH:(0.023M MSH)*(3.1mL MSH)/10mL＝7.13x 10-03M MSH
NaPO4:(0.6M NaPO4*1.28mL NaPO4)/10mL＝0.077M NaPO4
移出样品进行HPLC-MS分析，其显示MSH的马来酰亚胺官能团同时加入到5’-ECC-SH和HS-CCE-3’物种中，并且产物是化合物2和3。
使用半制备型反相色谱法从反应混合物分离产物，如下：
设备
·HPLC:Akta Purifier 100
柱
·Phenomenex Gemini C18(5mm,10x250mm),组件号00G-4435-N0
方法1:
·流动速率:2mL/分钟
·流动相：
○A＝0.1M TEAA，在H2O中5％乙腈
○B＝100％乙腈
·注射:5mL反应物
·洗脱:0-55％流动相B,5CV,柱清洗:100％流动相B,1CV
·监控微量物：
○导电性
○在445nm和310nm下的UV吸收率
·分馏:在50mAU下通过UV445触发的阈值，1.25mL每在15mL中收集的馏分
○在15mL锥形管中收集
○通过HPLC分析的馏分以确认纯度
使用前述HPLC方法纯化化合物3，然而对于化合物2进行另外的HPLC纯化，如下：
设备
·HPLC:Akta Purifier 100
柱
·Phenomenex Gemini C18(5mm,10x250mm),组件号00G-4435-N0
方法2:
·流动速率:2mL/分钟
·流动相:
○A＝0.1M TEAA,在H2O中5％的甲醇
○B＝100％甲醇
·注射:5mL HNSA-S-CCE-3’+未反应的化合物1(馏分B11)
·洗脱:0-55％流动相B,5CV,柱清洗：100％流动相B,1CV
·监控微量物:
○导电性
○在445nm和310nm下的UV吸收率
·分馏:在50mAU下通过UV445触发的阈值，1.25mL每在15mL中收集的馏分
○在15mL锥形管中收集
○通过HPLC分析馏分以确认纯度
确认馏分C10为纯化的化合物2
将10mL的H2O加入到各个收集的产物(即，化合物2和3)馏分中以稀释有机改性剂至小于15％。将样品在干冰/乙醇浴中快速冷冻，置于Labconco FreeZone 4.5冻干机上，并且冷冻干燥过夜以除去水分、溶剂和TEAA缓冲液组分。
使化合物2和3与TRIS(含有伯胺的分子)反应以模拟染料与含伯胺的大分子如蛋白质或抗体的共轭。将300ml H2O加入到各个组分中以完全溶解。用50μL的水或50μL的1M Tris(pH 8.5)处理50ml的各个组分的等分试样并且允许在室温下反应15分钟。将每一个样品提交进行HPLC分析(参见图8a和8b)。
HPLC-MS分析显示HNSA活化的染料序列经由缓冲液相关的甲醇添加或在分子的HNSA酯位置处的水合经受一些程度的降解，但还显示了完整的化合物1-HNSA可预测地与TRIS反应。仅显示了对于5’-ECC-S-HNSA产物的结果。
实施例2
含马来酰亚胺染料的合成
通过将含有末端伯胺的水溶性染料(化合物4)与磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)的N-羟基琥珀酰亚胺基反应合成具有官能化马来酰亚胺的水溶性染料。
使用Nanodrop和Beer法则通过测量其吸收率测定化合物4的摩尔浓度。使用H2O作为稀释剂，制备两个化合物4的10倍稀释液(100倍最终稀释度)。使用H2O在NanoDrop上进行空白测量。测量在443nm下化合物4的吸收率。由吸收率使用等式1计算化合物4的摩尔浓度。
等式1(Beer法则)：SND215的摩尔浓度＝{A443/(L*e化合物4)}*稀释因子
e化合物45＝38,000M-1 cm-1
Lnanodrop＝0.1cm
A443＝0.372
稀释因子＝100
SND215的摩尔浓度＝9.79x10-03M化合物4。
制备Sulfo-SMCC的原液。称重28mg的Sulfo-SMCC并且将其加入到15ml锥形管。将2.8ml的H2O加入到管中。使用Vortex混合器将Sulfo-SMCC溶解大约5分钟。这是10mg/ml Sulfo-SMCC溶液。计算Sulfo-SMCC的摩尔浓度为0.023MSulfo-SMCC。
等式2：SND215的摩尔数＝{M化合物45*(V化合物4-ml/1000)}
M化合物4＝9.79x10-03M(等式1)
V化合物4＝0.65ml
待与Sulfo-SMCC反应的化合物4的摩尔数＝6.36x10-06摩尔化合物4。
使用等式3计算需要达到10:1 Sulfo-SMCC与化合物4摩尔比的Sulfo-SMCC的摩尔数。
等式3：Sulfo-SMCC的摩尔数＝摩尔数化合物4*10
摩尔数化合物4＝6.36x10-06(Eq.2)
摩尔过量:10
所需Sulfo-SMCC的摩尔数＝6.36x10-05摩尔Sulfo-SMCC。
使用等式4计算将添加至化合物4的Sulfo-SMCC体积数。
等式4：所需Sulfo-SMCC的体积(ml)＝{(摩尔数Sulfo-SMCC/MSulfo-SMCC)*1000}
摩尔数Sulfo-SMCC＝6.36x10-05(Eq.3)
MSulfo-SMCC＝0.023M
所需Sulfo-SMCC的体积＝2.765ml的Sulfo-SMCC。
Sulfo-SMCC是酸性的并且化合物4的添加应当在略微碱性至中性pH(例如pH 7.5-8.5)下进行。NaPO4缓冲液应当大约等摩尔于Sulfo-SMCC以维持7.5的pH。使用0.45M NaPO4(pH＝8.0)以缓冲反应。
使用以下体积(参见以下)将反应物加入到5ml锥形管中。
9.79x10-03M化合物4＝0.65ml
0.45M NaPO4＝1.15ml
0.023M Sulfo-SMCC＝2.75ml
H2O＝0.45ml
反应物的总浓度(其中总体积为5ml)如下计算：
化合物4:(9.79x10-03M化合物4)x(0.65ml化合物4)/5ml＝1.27x10-03M化合物4
Sulfo-SMCC:(0.023M Sulfo-SMCC)*(3.1ml Sulfo-SMCC)/5ml＝0.013M Sulfo-SMCC
NaPO4:(0.45M NaPO4*1.15ml NaPO4)/5ml＝0.104M NaPO4
使用石蕊试纸，反应的pH值约为7.5。在实验室室温(约23℃)下培育反应过夜。计算用于反应的反应物的最终浓度。使用石蕊试纸(其跨越7-14的pH范围)测量反应的pH。在反应之前和一旦完成反应移出用于HPLC/MS分析的样品。在反应前化合物4的M.S.分析：计算的MW为888.4。发现的MW为887.2。在反应前化合物5的M.S.分析：计算的MW为1107.2。发现的MW为1106.4。
如下由粗反应混合物纯化化合物5至整体纯度78％：
设备
·HPLC:Akta Purifier 100
柱
·Waters Spherisorb C6(5mm,,10x250mm),组件号PSS831085
方法1:
·流动速率:2mL/分钟
·流动相:
○A＝0.1M TEAA，在H2O中5％乙腈
○B＝100％乙腈
·注射:5mL反应物
·洗脱:0-55％流动相B,5CV,柱清洗:100％流动相B,1CV
·监控微量物：
○导电率
○在445nm和310nm下的UV吸收率
·分馏:在50mAU下通过UV445触发的阈值，1.25mL每在15mL中收集的馏分
○在15mL锥形管中收集馏分B6和B5
○收集馏分并且通过HPLC分析确认纯度。
如下冻干纯化的化合物5：
用H2O稀释纯化的化合物5至最终25ml的体积。在干冰/乙醇浴中快速冷冻稀释的化合物5。在其冷冻之后，将化合物5放入室内，一个预冷的Labconco FreeZone 4.5冻干机。施加真空并且使化合物5冷冻干燥过夜。用针刮出少量的物质，并在H2O中重构。通过HPLC分析重构的化合物5。将剩余的干燥SND215-马来酰亚胺储存在-20℃冷冻箱中。
如下测试化合物5与分析物分子形成共价键的能力：
反应物:
·L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(CAS 7048-04-6,FW 175.6,Thermo Scientific)
·0.1M磷酸酯缓冲液(+0.15M NaCl)，pH 6.5
·SND215+MSH的水原液(0.15mM)
步骤：
通过将12.5mg的固体溶解在14.2ml的水中制造L-半胱氨酸5mM的溶液。L-半胱氨酸和马来酰亚胺基之间的反应应当在略微酸性条件下进行，因此样品如所示制备并且检查pH水平为pH 6-7：
·空白：45μL水+50μL缓冲液+5μL L-半胱氨酸原液
·未处理的样品：45μL SND215,50μL缓冲液,5μL水
·处理的样品：45μL SND215,50μL缓冲液,5μL L-半胱氨酸原液
良好混合样品并且允许在室温下反应3小时。使用LC/MS在各个测试样品的10μL注射上进行分析。结果表明化合物5与胱氨酸反应形成预期的共价键。
本说明书提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括2015年2月26日提交的美国临时专利申请序列No.62/121,415，以其全部通过引用并入本文，程度是不与本说明书不一致。
由前文可以理解，虽然本发明的具体实施方案已经在本文描述用于阐明的目的，在不脱离本发明的精神和范围内可以作出多种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。